Medycyna Wet. 2007, 63 (9)

1040

Artyku³ przegl¹dowy

Review

Cytometria przep³ywowa (flow cytometry – FCM) ma

obecnie szeroki wachlarz zastosowañ w rutynowej

diagnostyce klinicznej cz³owieka, ale jej wykorzystanie

wzrasta tak¿e w naukach weterynaryjnych, zw³aszcza

w immunologii, onkologii, farmakologii i mikrobiologii.

U¿ycie przeciwcia³ monoklonalnych, specyficznych

w stosunku do konkretnego epitopu na komórkach krwi

zwierz¹t towarzysz¹cych cz³owiekowi oraz stanowi¹cych

Ÿród³o po¿ywienia, poszerzy³o spektrum testów o poten-

cjalnym zastosowaniu klinicznym. Zalicza siê tu takie

testy, jak: okreœlanie liczby niedojrza³ych i dojrza³ych re-

tikulocytów, wykrywanie immunoglobulin wi¹¿¹cych siê

z komórkami krwi, immunofenotypowanie bia³aczek

i ch³oniaków, analizowanie komórek ró¿nych populacji

szpiku kostnego oraz pojedynczych komórek ró¿nych po-

pulacji w zawiesinie, niezwi¹zanych z pod³o¿em w p³y-

nach tkankowych b¹dŸ komórkach tkanek i narz¹dów

œwie¿ych, zamro¿onych lub utrwalonych w parafinie

celowo uwolnionych z otaczaj¹cej je substancji miêdzy-

komórkowej (2, 15, 30).

Analiza uk³adu bia³okrwinkowego

Leukocyty mo¿na analizowaæ w pe³nej krwi lub jako

komórki izolowane w gradiencie gêstoœci. Badanie leu-

kocytów w pe³nej krwi jest mo¿liwe dziêki wydzielaniu

grup komórek przy pomocy programu komputerowego

– tak zwane ustalanie okna, bramkowanie. Wczeœniej

nale¿y z krwi usun¹æ erytrocyty przez dodanie buforu

lizuj¹cego. Badanie leukocytów polega najczêœciej na

oznaczaniu ich immunofenotypu, zestawu antygenów

ró¿nicowania (CD – Cluster Designation, Cluster Diffe-

rentiation), który jest charakterystyczny dla danej po-

pulacji komórek (2). Przy zastosowaniu odpowiednich

przeciwcia³ mo¿na oceniæ zarówno ekspresjê okreœlonej

cz¹steczki CD na powierzchni ró¿nego typu komórek,

jak i ekspresjê ró¿nych antygenów na komórkach jedne-

go typu (15, 20).

Cytometriê przep³ywow¹ mo¿na wykorzystaæ do oce-

ny stanu czynnoœciowego neutrofilów. Jedn¹ z najwa¿-

niejszych funkcji tych komórek jest fagocytoza. Do jej

oceny u¿ywa siê cz¹stek, które s¹ fagocytowane przez

komórki ¿erne. S¹ one znakowane barwnikami fluo-

rescencyjnymi (izotiocyjanian fluoresceiny – FITC, oran¿

akrydyny). Dotychczas w badaniach u¿ywano cz¹stek

lateksu (1,8 mm), nanocz¹stek (0,3 mm), zymosanu,

liposomów, krwinek czerwonych, mikroorganizmów

(Staphylococcus aureus, Escherichia coli i wiele innych)

lub grzybów (Candida albicans, dro¿d¿e piekarnicze).

Zastosowanie cytometrii przep³ywowej

w medycynie weterynaryjnej

URSZULA LISIECKA, KRZYSZTOF KOSTRO, £UKASZ JAROSZ

Zak³ad Epizootiologii i Klinika Chorób ZakaŸnych Instytutu Chorób ZakaŸnych i Inwazyjnych

Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej AR, ul. G³êboka 30, 20-612 Lublin

Lisiecka U., Kostro K., Jarosz £.

Applying flow cytometry in veterinary medicine

Summary

The number of ways in which flow cytometry may be applied in veterinary sciences is continually increasing,

especially in the fields of immunology, oncology, pharmacology and microbiology. White blood cell analysis by

flow cytometry, and in particular, the study of leukocyte antigens, phagocytosis and intracellular killing, is

being applied to an ever growing number of animal species. Moreover, flow cytometry enables red blood cell

analysis, including reticulocyte count and maturity, identification of anti-erythrocyte antibodies and

intraerythrocyte parasites detection. Through flow cytometry it is possible to make a speedy and precise

diagnosis of neoplasms. In diseases of the haematopoietic system, such as leukemia and lymphomas this method

allows the cell line which has become malignant to be precisely established. When appropriate procedures are

used, solid tissues such as tumors can be investigated, and if there is no direct access to tumors, it is possible

to study cells from secondary lesions – e.g. pleural fluid or peritoneal fluid. Flow cytometry can provide

information about sperm parameters, such as sperm cell chromatin structures or differentiations between

X and Y bearing sperm cells. The flow cytometry method enables a wide range of diseases to be diagnosed

by studying apoptosis, i.e. programmed cell death. When adequate, modified procedures are applied, it can

be utilized in diagnosing bacterial and viral infections and it is the only method which makes it possible to

determine cytokines produced by different cell populations, and cytokine sets produced by a single cell.

Keywords: flow cytometry, immunophenotyping, apoptosis, cytokines

Medycyna Wet. 2007, 63 (9)

1041

Aby okreœliæ dok³adnie procent fagocytuj¹cych mono-

cytów i granulocytów oraz aktywnoœæ fagocytarn¹ (œred-

nia iloϾ sfagocytowanych bakterii w przeliczeniu na

jedn¹ komórkê), stosuje siê komercyjnie dostêpny test

Phagotest (Orpegen, Niemcy). Jest to szybki test, który

pozwala okreœliæ aktywnoœæ fagocytarn¹ w niewielkiej

objêtoœci krwi pe³nej lub w p³ynie stawowym. Jego sk³ad-

nikiem s¹ bakterie E. coli znakowane FITC, opsonizo-

wane przeciwcia³ami i sk³adowymi dope³niacza pulowa-

nej surowicy (11, 34).

W oparciu o ocenê metabolizmu tlenowego komórki

mo¿na wykazaæ, czy materia³ poch³oniêty przez neutro-

file zosta³ zdegradowany. W tym celu wykrywa siê pro-

dukty powsta³e w czasie aktywacji systemu oksydazy

NADPH. W cytometrii przep³ywowej do wykazania

obecnoœci produktów aktywacji oksydazy stosuje siê

dwuoctan 2’7’-dichlorofluorescyny (DCFH-DA). Jest to

ma³a cz¹stka, nie wykazuj¹ca fluorescencji, która po prze-

nikniêciu przez b³onê wewn¹trz komórki ulega przekszta³-

ceniom przez enzymy komórkowe do 2’7’-dichloroflu-

oresceiny (DCF), która emituje sygna³ fluorescencyjny

(530 nm). Inna metoda polega na zastosowaniu utlenia-

nia wewn¹trzkomórkowego hydroetydyny (HE) do brom-

ku etydyny, który wykazuje czerwon¹ fluorescencjê. Aby

wykazaæ obecnoœæ w komórce tych dwóch metabolitów,

nale¿y zastosowaæ bardzo silne stymulatory wybuchu od-

dechowego, na przyk³ad estry forbolu (PMA) (11, 34).

W laboratoriach stosuje siê ponadto wystandaryzowane

testy, takie jak Bursttest (Orpegen). Stymulatorem wy-

buchu tlenowego jest s³aby aktywator N-formylometio-

nyloleucynofenyloalanina (FMLP) oraz opsonizowane

E. coli. Substancj¹, która ulega przekszta³ceniom w ko-

mórce, jest DHR 123. Mo¿na okreœliæ intensywnoœæ fluo-

rescencji powsta³ej rodaminy 123 i dziêki temu zbadaæ

aktywnoœæ enzymatyczn¹.

Badanie reaktywnych pochodnych tlenu (ROS) mo¿e

przyczyniæ siê do wykrycia szeregu chorób zakaŸnych

oraz oceny zaburzeñ czynnoœci neutrofilów. Podobne

badania wykorzystano do oceny zmian funkcjonalnych

neutrofilów u byd³a oraz identyfikacji zwierz¹t podat-

nych na chroniczne zapalenie wymion wywo³ane przez

Staphylococcus aureus (13, 34). Cytometria przep³ywo-

wa zosta³a tak¿e z powodzeniem zastosowana do oceny

fagocytozy oraz zabijania wewn¹trzkomórkowego u œwiñ,

psów, kotów, królików, byd³a, a nawet u wielorybów (6,

11, 13, 23).

Analiza uk³adu czerwonokrwinkowego

Cytometryczna analiza erytrocytów dotyczy przede

wszystkim okreœlania liczebnoœci i dojrza³oœci retikulo-

cytów, identyfikowania przeciwcia³ skierowanych prze-

ciwko erytrocytom oraz wykrywania ich wewn¹trzkomór-

kowych paso¿ytów. Erytrocyty mo¿na analizowaæ w pe³-

nej krwi pobranej na antykoagulant lub izolowaæ z war-

stwy erytrocytów powsta³ej po wirowaniu krwi ca³ko-

witej. Cytometriê stosuje siê czêsto do badania konfliktu

serologicznego miêdzy matk¹ a p³odem. Zwykle stosuje

siê do tego celu przeciwcia³a przeciwko p³odowej hemo-

globinie F. Jest to precyzyjny i czu³y test, pozwalaj¹cy

odró¿niæ erytrocyty p³odowe od dojrza³ych erytrocytów

zawieraj¹cych ma³¹ iloœæ hemoglobiny F (2).

Ocena liczby retikulocytów jest oparta na pomiarze

intensywnoœci fluorescencji RNA zawartego w retikulo-

cycie. Do barwienia RNA retikulocytów stosowane s¹

fluorochromy, takie jak: oran¿ tiazolowy, oran¿ akrydy-

ny, auramina czy bromek etydyny. Kluczowym paramet-

rem jest odsetek retikulocytów o wysokiej zawartoœci

RNA, których cech¹ charakterystyczn¹ jest zwiêkszona

intensywnoœæ fluorescencji (21). U zwierz¹t cytometria

przep³ywowa by³a stosowana do oznaczania liczby reti-

kulocytów u psów i kotów i w obu przypadkach rezulta-

ty by³y porównywalne z obliczeniami manualnymi (30).

Cytometria przep³ywowa jest stosowana z powodze-

niem do wykrywania wewn¹trzerytrocytarnych paso¿y-

tów. Erytrocyty inkubuje siê z hydroetydyn¹, która jest

poch³aniana przez ¿ywe komórki i przekszta³cana do ety-

dyny. Etydyna jest fluorochromem, wi¹¿¹cym siê z DNA

paso¿yta. Ta technika zosta³a wykorzystana do przeœle-

dzenia cyklu rozwojowego Babesia bovis w erytrocytach

bydlêcych, a w erytrocytach psich do identyfikacji ko-

mórek zainfekowanych Babesia gibsoni. Cytometria jest

tak¿e pomocna w ocenie skutecznoœci leków przeciw-

malarycznych. Zainfekowane zarodŸcem malarii ludzkie

erytrocyty barwi siê z u¿yciem barwnika Hoechst 33258.

Zalet¹ cytometrii jest to, ¿e pozwala ona na wykrycie

paso¿yta wystêpuj¹cego nawet w bardzo ma³ej iloœci (30).

Zastosowanie cytometrii przep³ywowej w hematolo-

gii weterynaryjnej mo¿e mieæ miejsce przy ocenie iloœ-

ciowej niedojrza³ych p³ytek krwi, które by³y badane we

krwi ludzi, psów i koni w sposób podobny do stosowa-

nego przy analizie retikulocytów (21, 31). Wiele testów

z wykorzystaniem cytometrii przep³ywowej jest udosko-

nalanych w celu identyfikacji kr¹¿¹cych w organizmie

p³ytek aktywowanych. Do testów tych zalicza siê m.in.:

wi¹zanie fibrynogenu do p³ytek, stosowanie przeciwcia³

przeciwko p³ytkowym markerom zale¿nym od aktywa-

cji, wykrywanie p³ytkowych mikrocz¹stek, badanie zmia-

ny kszta³tu oraz detekcja agregatów p³ytki-leukocyty.

Obecnoœæ przeciwcia³ skierowanych przeciwko p³ytkom,

która pozwala wykryæ trombocytopeniê, ehrlichiozê i ba-

daæ procesy nowotworzenia, by³a badana u ludzi i psów

(21, 31). Testy te s¹ pomocne w ocenie stanu zdrowia

zwierz¹t.

Diagnostyka nowotworów

Bardzo wa¿ne z punktu widzenia kliniki jest wyko-

rzystanie cytometrii przep³ywowej w rutynowej diag-

nostyce schorzeñ uk³adu krwiotwórczego, takich jak bia-

³aczki i ch³oniaki. Cytometria przep³ywowa umo¿liwia

ocenê dok³adnej liczby komórek zmienionych nowotwo-

rowo oraz okreœlenie linii komórkowej, z jakiej pocho-

dzi nowotwór oraz jego potencjalnej z³oœliwoœci.

WskaŸnikiem z³oœliwoœci nowotworu s¹ klonalnoœæ

i zawartoϾ (ploidia) DNA. KlonalnoϾ jest dowodem na

to, ¿e linia komórek bia³aczkowych pochodzi od poje-

dynczej komórki. Pojawienie siê dodatkowych pików na

histogramie obrazuj¹cym zawartoœæ DNA œwiadczy

o aneuploidalnoœci i jest wskaŸnikiem procesów nowo-

tworzenia (21, 30). Ró¿ne typy bia³aczek i ch³oniaków

charakteryzuj¹ siê czêsto drobnymi ró¿nicami profilów

antygenowych, dziêki temu mo¿na je rozró¿niæ za po-

moc¹ cytometrii przep³ywowej (30). Zastosowanie kli-

Medycyna Wet. 2007, 63 (9)

1042

niczne immunofenotypowania w weterynaryjnej onko-

logii wi¹¿e siê z diagnoz¹ psich bia³aczek i ch³oniaków

z³oœliwych (5) oraz kocich ostrych bia³aczek mieloidal-

nych i limfoidalnych (30). Dodatkowo cytometria w prze-

p³ywaj¹cym strumieniu cieczy umo¿liwia badanie sku-

tecznoœci chemioterapii, co udowodniono prowadz¹c tego

typu analizê limfocytów krwi obwodowej u psów z wie-

locentrycznym ch³oniakiem, przed leczeniem i po poda-

niu cytostatyków (5). Cytometria umo¿liwia ponadto

wykrycie choroby resztkowej (MRD – minimal residual

disease) u pacjentów z ostrymi bia³aczkami. Dok³adnoœæ

i czu³oœæ badania pozwala wykryæ nawet pojedyncze ko-

mórki bia³aczkowe (21).

Kolejne zastosowanie cytometrii przep³ywowej odno-

si siê do charakterystyki antygenowej i iloœciowej komó-

rek szpiku kostnego (21). Metoda ta umo¿liwia m.in.

okreœlanie liczby ró¿nych komórek szpiku poprzez ich

barwienie dwuoctanem 2’7’-dichlorofluoresceiny, wi¹-

¿¹cym siê preferencyjnie z komórkami zawieraj¹cymi

peroksydazê, a nastêpnie analizowanie pod k¹tem zielo-

nej fluorescencji i rozpraszania œwiat³a FSC. W ten spo-

sób mo¿liwe jest odró¿nienie populacji proliferuj¹cych

i dojrza³ych komórek mieloidalnych, proliferuj¹cych

i dojrza³ych komórek erytroidalnych oraz megakariocy-

tów. Mo¿liwe jest tak¿e analizowanie nie barwionych

próbek szpiku, przy którym, bazuj¹c na stopniu rozpra-

szania œwiat³a FSC i SSC, identyfikuje siê segmentowa-

ne neutrofile, metamielocyty, niedojrza³e komórki mie-

loidalne i erytroidalne oraz dojrza³e komórki erytroidal-

ne. Jodek propidyny, jak równie¿ bromodeoksyurydyna

s¹ wykorzystywane dodatkowo do okreœlania aktyw-

noœci proliferacyjnej szpiku (21).

Jedn¹ z najwiêkszych zalet cytometrii przep³ywowej

jest mo¿liwoœæ przy braku dostêpu do guza pobrania

i badania komórek z wtórnego Ÿród³a zmiany chorobo-

wej np. p³ynu op³ucnowego czy otrzewnowego (10). Je-

¿eli badana jest tkanka lita, komórki musz¹ zostaæ rozbi-

te mechanicznie lub enzymatycznie. Metodê enzymatycz-

n¹ stosuje siê wówczas, je¿eli materia³ guza zawiera wiele

martwych komórek, du¿¹ iloœæ podœcieliska lub zw³ók-

nienia. Œwie¿o pobrany materia³ z guza powinien byæ

transportowany i przechowywany w specjalnym pod³o-

¿u (nie w formalinie) w temperaturze 4°C. Materia³ prze-

znaczony do badania powinien zawieraæ jak najwiêcej

interesuj¹cej nas tkanki, natomiast jak najmniej tkanki

t³uszczowej, w³óknistej, naczyñ krwionoœnych (warstwy

naczyniowej) i komórek nekrotycznych (10).

Ocena proliferacji komórek

Cytometriê przep³ywow¹ wykorzystuje siê z powodze-

niem do scharakteryzowania cyklu komórkowego ró¿-

nych rodzajów komórek w hodowlach. Zastosowanie

w tej metodzie barwienia z u¿yciem jodku propidyny

umo¿liwi³o obliczenie procentu komórek znajduj¹cych

siê w fazie G0/G1, S i G2/M. Do badania cyklu czêsto

stosuje siê oznaczanie zawartoœci DNA po jego kwaœnej

denaturacji. Po dodaniu do hodowli substancji blokuj¹-

cej komórki w fazie M, np. winblastyny i okreœleniu

indeksu mitotycznego (liczby komórek bêd¹cych w trak-

cie podzia³u mitotycznego) w ró¿nym czasie po dodaniu

tej substancji, mo¿emy obliczyæ czas podwojenia (gene-

ration time) populacji komórek. Prowadz¹c hodowle ko-

mórkowe lub tkankowe mo¿na œledziæ stan hodowli po

zabarwieniu DAPI – sulforodamin¹ i oran¿em akrydyny.

Nag³e pogorszenie siê rozdzielczoœci histogramu DNA

przy prowadzeniu regularnej kontroli hodowli mo¿e

œwiadczyæ o zaka¿eniu mykoplazm¹.

Proliferacjê nowotworów mo¿na badaæ analizuj¹c fazê

S cyklu komórkowego. Je¿eli odsetek komórek znajdu-

j¹cych siê w tej fazie przekroczy kilkanaœcie procent,

oznacza to wzrost proliferacji. W przypadku np. raka

sutka wzrost liczby komórek w fazie S stanowi samo-

dzielny czynnik rokowniczy. Badaj¹c cykl komórkowy

nale¿y tak¿e zwróciæ uwagê na antygeny towarzysz¹ce

proliferacji, takie jak Ki-67 czy PCNA. Istnieje zale¿-

noœæ pomiêdzy ich ekspresj¹ a postêpem choroby nowo-

tworowej. Cytometryczna ocena zawartoœci DNA jest

stosowana tak¿e w badaniach cytogenetycznych. Iloœæ

kwasu nukleinowego ocenia siê wtedy w poszczególnych

chromosomach przy u¿yciu odpowiednich fluorochro-

mów (np. DAPI czy jodku propidyny). Proliferuj¹ce lim-

focyty mo¿na wykryæ, znakuj¹c je przeciwcia³ami prze-

ciwko receptorowi dla interleukiny 2 (CD25) lub recep-

torowi dla transferyny (CD71). Oba te receptory znaj-

duj¹ siê na powierzchni zaktywowanych limfocytów.

Mo¿na tak¿e wykorzystaæ fakt, ¿e proliferuj¹ce komórki

wbudowuj¹ analog tymidyny – bromodezoksyurydynê

(BrdU), któr¹ mo¿na wykryæ za pomoc¹ przeciwcia³ anty-

-BrdU (2).

Ocena parametrów nasienia

Badanie jakoœci nasienia polega zwykle na wykrywa-

niu nieprawid³owej struktury chromatyny plemników.

DNA znakuje siê oran¿em akrydyny (AO). Barwnik ten,

³¹cz¹c siê z DNA dwuniciowym, daje zielon¹ fluorescen-

cjê, natomiast w po³¹czeniu z jednoniciowym DNA œwie-

ci na czerwono. Zwiêkszona liczba komórek o czerwo-

nej fluorescencji œwiadczy o nieprawid³owej strukturze

chromatyny plemników. Plemniki mo¿na tak¿e znako-

waæ rodamin¹ 123 i jodkiem propidyny PI, dziêki czemu

wykrywa siê zmiany w potencjale b³ony mitochondrial-

nej, a co za tym idzie – ruchliwoœci plemników. Czerwo-

na fluorescencja pochodz¹ca od PI œwiadczy o du¿ej licz-

bie martwych komórek, natomiast intensywna zielona

fluorescencja jest wskaŸnikiem ¿ywotnoœci i du¿ej ruch-

liwoœci plemników. Wyniki oceny ¿ywotnoœci plemni-

ków w nasieniu ogierów z zastosowaniem cytomerii prze-

p³ywowej oraz innych metod by³y porównywalne. Za po-

moc¹ cytometrii badano ¿ywotnoœæ i integralnoœæ akro-

somu psich plemników oraz ¿ywotnoœæ i integralnoœæ

b³ony komórkowej plemników knura (25). Dziêki tech-

nikom cytometrycznym wykrywa siê w ludzkim nasie-

niu komórki takie, jak leukocyty czy komórki prostaty,

co jest pomocne we wczeœniejszym wykryciu raka pro-

staty (24). Cytometria umo¿liwia ponadto okreœlenie nie-

wielkich ró¿nic w zawartoœci DNA w plemnikach nios¹-

cych chromosomy X i Y. Plemniki zawieraj¹ce chromo-

som X lub Y sortuje siê za pomoc¹ specjalnego typu cy-

tometrów wyposa¿onych w sortery komórkowe, dziêki

temu mo¿liwa jest regulacja p³ci zwierz¹t hodowlanych

(1, 22).

Medycyna Wet. 2007, 63 (9)

1043

Badanie apoptozy

Apoptoza jest czynnym procesem, który przyczynia siê

do regulacji liczby komórek w organizmie. Zachwianie

równowagi miêdzy proliferacj¹ komórek a ich œmierci¹

prowadzi do powstania licznych schorzeñ. W komórkach

apoptotycznych nastêpuj¹ zmiany sk³adu fosfolipidów

w b³onie zewnêtrznej komórki – pojawia siê tam, prze-

niesiona z czêœci wewnêtrznej b³ony fosfatydyloseryna.

Do jej wykrycia stosuje siê aneksynê V zwi¹zan¹ che-

micznie z barwnikiem fluorescencyjnym (najczêœciej

FITC). Równoczeœnie wybarwia siê komórki jodkiem

propidyny, który pozwala oceniæ integralnoœæ b³ony ko-

mórkowej. Nastêpnie bada siê fluorescencjê za pomoc¹

cytometru. Komórki ¿ywe nie barwi¹ siê ¿adnym odczyn-

nikiem, komórki nekrotyczne barwi¹ siê jodkiem propi-

dyny, a komórki apoptotyczne barwi¹ siê w ró¿nym stop-

niu aneksyn¹ V. Komórki barwi¹ce siê jednoczeœnie anek-

syn¹ V i jodkiem propidyny znajduj¹ siê w póŸnym sta-

dium apoptozy (28).

Apoptozê mo¿na tak¿e badaæ, wykrywaj¹c pêkniêcia

³añcucha DNA w komórkach apoptotycznych. W tym celu

stosuje siê trifosforan deoksyurydyny (dUTP) lub bro-

modeoksyurydyny (Br-dUTP) sprzê¿ony z fluorescein¹

lub digoksygenin¹, który przy u¿yciu enzymów, takich

jak terminalna transferaza czy polimeraza DNA jest

wbudowywany w miejscach pêkniêæ ³añcucha DNA.

Fluorescencja Br-dUTP po³¹czonego z kwasem nuklei-

nowym jest nastêpnie mierzona cytometrycznie. Jest ona

proporcjonalna do liczby pêkniêæ ³añcucha DNA. Ten

sposób badania apoptozy zwany jest metod¹ TUNEL (28).

Za pomoc¹ cytometrii przep³ywowej mo¿liwe jest ba-

danie aktywacji kaspaz (proteinaz cysteinowych) – en-

zymów, które s¹ obecne w komórkach apoptotycznych.

Najczêœciej wykrywa siê kaspazê 3, stosuj¹c komercyj-

ne zestawy odczynników (kity), które zawieraj¹ substra-

ty fluorescencyjne, rozszczepiane przez kaspazê.

Ocena apoptozy mo¿e mieæ znaczenie w zrozumieniu

przebiegu wielu chorób zwierz¹t i cz³owieka (choroby

nowotworowe, autoagresja, choroby neurodegeneracyj-

ne i infekcyjne). W badaniach klinicznych za pomoc¹

cytometrii oznaczano spontaniczn¹ i indukowan¹ apop-

tozê limfocytów w przebiegu infekcji wirusem HIV

u ludzi (20) oraz apoptozê w przebiegu infekcji wirusem

niedoboru odpornoœci u kotów (FIV) (19). Badano tak¿e

apoptozê leukocytów u byd³a (27), trzody chlewnej (29),

kotów (8, 19) i psów (34). Porównywano proces apopto-

zy zdrowych i zainfekowanych wirusem Panleukopenia

limfocytów kotów (8). U trzody chlewnej oznaczano

apoptozê zainfekowanych wirusem choroby Aujesz-

ky’ego leukocytów krwi obwodowej (29). Ponadto ba-

dano apoptozê kocich, mysich i szczurzych tymocytów

(34).

Diagnostyka i patogeneza zaka¿eñ bakteryjnych

i wirusowych

Przy u¿yciu cytometrii przep³ywowej zaka¿enia bak-

teryjne i wirusowe mo¿na badaæ bezpoœrednio b¹dŸ po-

œrednio, monitoruj¹c zmiany, jakie zachodz¹ w uk³adzie

immunologicznym. W wyniku zaka¿enia bakteryjnego

nastêpuj¹ du¿e zmiany w komórkach obronnych. Jedn¹

z tych zmian jest tzw. „parali¿ immunologiczny”, który

jest spowodowany utrat¹ przez monocyty krwi antygenu

HLA-DR. Zmiany ekspresji tego antygenu mo¿emy œle-

dziæ dziêki cytometrii przep³ywowej (33).

Za pomoc¹ cytometrii mo¿na tak¿e badaæ oddzia³y-

wanie wirusa z komórk¹, okreœlaj¹c ekspresjê wybranych

antygenów powierzchniowych i cytoplazmatycznych

komórki, z zastosowaniem przeciwcia³ monoklonalnych.

Analizuj¹c fenotypy komórek zaka¿onych wirusem mo¿-

na monitorowaæ przebieg zaka¿enia i okreœlaæ jego ro-

kowania (18). Za pomoc¹ tej metody œledzono stan cho-

rych zaka¿onych wirusem HIV (20). W diagnostyce we-

terynaryjnej cytometriê przep³ywow¹ stosowano miêdzy

innymi do oceny progresji infekcji kocimi wirusami FIV

i FeLV (19), wirusami bia³aczki byd³a, wirusem BIV

i BLAD (wrodzonym zespo³em niedoboru leukocytar-

nych cz¹stek adhezyjnych). Analizowano komórki od-

pornoœciowe we krwi owiec w przebiegu doœwiadczal-

nego zaka¿enia wirusem BIV (12) oraz wykrywano

zaka¿enia wirusem zapalenia têtnic koni w nasieniu ogie-

rów (4). Badano tak¿e zmiany w subpopulacjach limfo-

cytów u kurcz¹t zaka¿onych Salmonella enteritidis (32).

Cytometriê przep³ywow¹ mo¿na zaadaptowaæ tak¿e do

bezpoœredniej wieloparametrowej analizy mikroorganiz-

mów, jednak ze wzglêdu na to, ¿e ró¿ni¹ siê one od orga-

nizmów eukariotycznych, niezbêdna jest modyfikacja

standardowych procedur wykorzystywanych do charak-

teryzowania komórek zwierzêcych. Barwienie barwni-

kiem fluorescencyjnym – bromkiem etydyny (BE) po-

zwala tak¿e na wykrycie bakterii w p³ynach fizjologicz-

nych, takich jak: ¿ó³æ, wydzieliny ropne z ran, p³yn suro-

wiczy oraz wydzieliny oskrzelowe (33).

Cytometria znajduje zastosowanie w bezpoœrednim

badaniu komórek bakteryjnych do zliczania i wykrywa-

nia okreœlonych gatunków bakterii w populacjach mie-

szanych, np. Legionella pneumophila w wie¿ach ch³od-

niczych (9), Listeria monocytogenes w mleku (3), Esche-

richia coli O157:H7 w zanieczyszczonym miêsie (14)

oraz subpopulacji bakterii w produktach probiotycznych

(probiotykach) i produktach mlecznych (3).

Cytometriê mo¿na tak¿e wykorzystaæ w badaniach

serologicznych. Za jej pomoc¹ wykrywano przeciwcia³a

przeciwko Yersinia pestis w surowicach pobranych od

chorych na d¿umê pacjentów. Mo¿liwa jest tak¿e detek-

cja przetrwalników (spor) bakteryjnych np. Bacillus an-

thracis (26).

Metoda cytometrii przep³ywowej znajduje tak¿e za-

stosowanie w testowaniu wra¿liwoœci bakterii na anty-

biotyki. Do detekcji martwych komórek bakterii stosuje

siê barwniki wi¹¿¹ce siê z DNA, np. jodek propidyny,

oraz barwniki wi¹¿¹ce siê z DNA i RNA, takie jak SYTO-

-13 czy SYTO-17. Barwienie komórek oran¿em akrydy-

ny pozwala oceniæ zmiany integralnoœci b³ony komórko-

wej wskutek dzia³ania antybiotyków (33).

Cytometria przep³ywowa zosta³a z powodzeniem za-

stosowana do detekcji wirusów z rodzin Baculoviridae,

Herpesviridae, Myoviridae, Phycodnaviridae, Picorna-

viridae, Podoviridae, Retroviridae i Siphoviridae. Kwa-

sy nukleinowe wirusów barwiono u¿ywaj¹c takich barw-

ników, jak: SYBR Green I, SYBR Green II, OliGreen,

PicoGreen, YO-PRO oraz YOYO-1. Prowadzone s¹ tak¿e

Medycyna Wet. 2007, 63 (9)

1044

badania leków antywirusowych przeciwko ludzkiemu

wirusowi niedoboru odpornoœci (HIV), wirusowi cyto-

megalii oraz wirusom opryszczki (HSV) (17, 18).

Oznaczanie poziomu cytokin

Cytokiny s¹ noœnikami informacji miêdzy uk³adem

odpornoœciowym a nerwowym i hormonalnym. Popula-

cje limfocytów produkuj¹ okreœlone, specyficzne tylko

dla nich zestawy cytokin. W trakcie procesów chorobo-

wych synteza cytokin mo¿e byæ zaburzona, wiêc anali-

zuj¹c ich ekspresjê mo¿emy wnioskowaæ o stanie funk-

cjonalnym uk³adu odpornoœciowego.

Cytometria przep³ywowa umo¿liwia oznaczanie ró¿-

nych cytokin produkowanych przez odrêbne populacje

komórek, a tak¿e zestawów cytokin produkowanych

przez pojedyncz¹ komórkê. Po 4-6-godzinnej inkubacji

z czynnikiem stymuluj¹cym, wewn¹trzkomórkowe cy-

tokiny znakuje siê przeciwcia³ami po³¹czonymi z fluoro-

chromem (16). Zazwyczaj stosuje siê stymulatory poli-

klonalne, takie jak: lektyny, konkanawalina A (ConA),

estry forbolu (PMA), jonomycyna, niektóre przeciwcia-

³a monoklonalne i superantygeny (7). Aby syntetyzowa-

ne cytokiny nie by³y wydzielane na zewn¹trz komórki,

stosuje siê inhibitory transportu bia³ek, takie jak brefel-

dyna A czy monensyna (7, 16).

Badanie cytokin wewn¹trzkomórkowych mo¿e stano-

wiæ pomoc w diagnostyce zaka¿eñ bakteryjnych, wiru-

sowych, paso¿ytniczych, chorób nowotworowych, auto-

immunizacyjnych, alergicznych i niedoborów odpornoœ-

ci. Stosuje siê je obecnie przy ró¿nicowaniu limfocytów.

Na przyk³ad, jedyn¹ ró¿nic¹ miêdzy subpopulacjami Th1

i Th2 jest spektrum wydzielanych cytokin (7). W przy-

sz³oœci badanie cytokin mo¿e znaleŸæ zastosowanie

w monitorowaniu dzia³ania leków i innych œrodków te-

rapeutycznych in vivo (7, 16).

Piœmiennictwo

1.Bochenek M., Smor¹g Z.: Regulacja p³ci u byd³a poprzez separacjê plemni-

ków X i Y – wstêpne wyniki badañ. Medycyna Wet. 2005, 61, 50-52.

2.Brown M., Wittwer C.: Flow cytometry: principles and clinical applications

in hematology. Clin. Chem. 2000, 46, 1221-1229.

3.Bunthof Ch. J., Abee T.: Development of a flow cytometric method to analyze

subpopulations of bacteria in probiotic products and dairy starters App.

Environment. Microbiol. 2002, 68, 2934-2942.

4.Cierpisz J., Golnik W., Laskowska A., Ugorski M.: Wykrywanie zaka¿eñ

wirusem zapalenia têtnic koni w nasieniu ogierów metod¹ cytometrii prze-

p³ywowej. Medycyna Wet. 1998, 54, 626-627.

5.Culmsee K, Simon D, Mischke R, Nolte I.: Possibilities of flow cytometric

analysis for immunophenotypic characterization of canine lymphoma. J. Vet.

Med. A. 2001, 48, 199-206.

6.De Guise S., Flipo D., Boehm J. R., Martineau D., Beland P., Fournier M.:

Immune functions in beluga whales (Delphinapterus leucas): Evaluation of

phagocytosis and respiratory burst with peripheral blood leukocytes using

flow cytometry. Vet. Immunol. Immunopathol. 1995, 47, 351-362.

7.Drela N.: Wykrywanie wewn¹trzkomórkowych cytokin metod¹ cytometrii

przep³ywowej – zastosowanie i problemy. Post. Biol. Kom. 2001, 28, 129-

-146.

8.Ikeda Y., Shinozuka J., Miyazawa T., Kurosawa K., Izumiya Y., Nishimura Y.,

Nakamura K., Cai J., Fujita K., Doi K., Mikami T.: Apoptosis in feline

panleukopenia virus-infected lymphocytes. J. Virol. 1998, 72, 6932-6936.

9.Ingram M., Cleary T. J., Price B. J., Castro A.: Rapid detection of Legionella

pneumophila by flow cytometry. Cytometry 1982, 3, 134-147.

10.Iwaszkiewicz-Paw³owska A., Ho³ownia A.: Cytometria przep³ywowa – przy-

datnoϾ diagnostyczna, lecznicza i rokownicza w litych guzach. Pol. Mer.

Lek. 1999, 6, 104-106.

11.Kostro K., Wojcicka-Lorenowicz K., Leœniewska K., Madany J., Majer-

-Dziedzic B.: Cytometryczna ocena aktywnoœci fagocytarnej i metabolizmu

tlenowego granulocytów krwi obwodowej królików z przewlek³¹ trichofi-

toz¹. Medycyna Wet. 2006, 62, 423-426.

12.Kozaczyñska B., Bicka L., KuŸmak J., Winnicka A.: Analiza komórek odpor-

noœciowych krwi owiec w przebiegu doœwiadczalnego zaka¿enia wirusem

(BIV). Medycyna Wet. 2001, 57, 129-134.

13.Krakowski L., Kostro K., Wrona Z., Krakowska I., Brodzki P., Piech T.,

Kostrzewa A.: Metabolizm tlenowy neutrofilów i monocytów krwi w okresie

oko³oporodowym u krów zdrowych i z zatrzymaniem ³o¿yska. Medycyna

Wet. 2004, 60, 1080-1083.

14.Kusunoki H., Bari M. L., Kita T., Sugii S., Uemura T.: Flow cytometry for the

detection of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 with latex beads

sensitized with specific antibody. J. Vet. Med. B. 2000, 47, 551-559.

15.Lisiecka U., Kostro K., Jarosz £.: Cytometria przep³ywowa jako nowoczesna

metoda w diagnostyce i prognozowaniu chorób. Medycyna Wet. 2006, 62,

998-1001.

16.Maino V. C.: Rapid assessment of antigen induced cytokine expression in

memory T cells by flow cytometry. Vet. Immunol. Immunopathol. 1998, 63,

199-207.

17.Marie D., Vaulot D., Partensky F.: Application of the novel nucleic acid dyes

YOYO-1, YO-PRO and PicoGreen for flow cytometric analysis of marine

prokaryotes. Appl. Environ. Microbiol. 1996, 62, 1649-1655.

18.McSharry J. J.: Analysis of virus-infected cells by flow cytometry. Methods

2000, 21, 249-257.

19.Momoi Y., Mizuno T., Nishimura Y., Endo Y., Ohno K., Watari T., Goitsu-

ka R., Tsujimoto H., Hasegawa A.: Detection of apoptosis induced in peri-

pheral blood lymphocytes from cats infected with feline immunodeficiency

virus. Arch Virol. 1996, 141, 1651-1659.

20.Owens M. A., Loken M. R.: Flow cytometry principles for clinical laboratory

practice. Quality assurance for quantitative immunophenotyping. Wiley-Liss,

Inc. 1995.

21.Pietruczuk M.: Cytometria przep³ywowa w diagnostyce laboratoryjnej. Diag-

nosta laboratoryjny 2004, 4, 8-10.

22.Pena A. I., Quintela L. A., Herradon P. G.: Flow cytometric assesment of

acrosomal status and viability of dog spermatozooa. Reprod. Dom. Anim.

1999, 34, 495-502.

23.Riber U., Lind P.: Interaction between Salmonella typhimurium and phago-

cytic cells in pigs. Phagocytosis, oxidative burst and killing in polymorpho-

nuclear leukocytes and monocytes. Vet. Immunol. Immunopathol. 1999, 67,

259-270.

24.Ricci G., Presani G., Guaschino S., Simeone R., Perticarari S.: Leukocyte

detection in human semen using flow cytometry. 2000. Human Reprod. 15,

1329-1337.

25.Siemieniuch M., Bielas W., Dubiel A., Zbyryt I., Chorbiñski P.: Ocena

¿ywotnoœci i integralnoœci b³on komórkowych plemników knura w nasieniu

œwie¿ym i mro¿onym. Medycyna Wet. 2005, 61, 184-187.

26.Stopa P. J.: The flow cytometry of Bacillus anthracis spores revisited. Cyto-

metry 2000, 41, 237-244.

27.Van Oostveldt K., Dosogne H., Burvenich C., Paape M. J., Brochez V., Van

den Eeckhout E.: Flow cytometric procedure to detect apoptosis of bovine

polymorphonuclear leukocytes in blood. Vet. Immunol. Immunopathol. 1999,

70, 125-133.

28.Vermes I., Haanen C., Steffens-Nakken H., Reutelingsperger C.: A novel

assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expres-

sion on early apoptotic cells using fluorescein labelled annexin V. J. Immu-

nol. Methods 1995, 184, 39-51.

29.Wang F. I., Pang V. F., Hahn E. C.: Flow cytometric analysis of porcine

peripheral blood leukocytes infected with pseudorabies virus. J. Leuk. Biol.

1988, 43, 256-264.

30.Weiss D. J.: Application of flow cytometric techniques to veterinary clinical

hematology. Vet. Clin. Pathol. 2002, 31, 72-74.

31.Weiss D. J., Townsend E.: Evaluation of reticulated platelets in dogs. Comp.

Haematol. Int. 1998, 8, 166-170.

32.Wieliczko A., Kuczkowski M., Mazurkiewicz M.: Zachowanie siê subpopu-

lacji limfocytów T CD3+, CD4+ i CD8+ u kurcz¹t w przebiegu zaka¿enia

Salmonella enteritidis. Medycyna Wet. 2002, 58, 527-530.

33.WoŸniak-Kosek A., Reiss J., Kawiak J.: Cytometria przep³ywowa w klinicz-

nych analizach bakteriologicznych. Post. Mikrobiol. 2003, 42, 235-254.

34.Zeman K.: Wykorzystanie cytometrii przep³ywowej do badañ granulocytów

obojêtnoch³onnych. Materia³y z I Konferencji szkoleniowej nt. Przeciwcia³a

monoklonalne w immunologii i diagnostyce. Pu³awy 1995, s. 99-117.

Adres autora: mgr Urszula Lisiecka, ul. Krasiñskiego 12/100, 20-709

Lublin; e-mail: [e-mail]