Cytometria przepływowa

Cytometria przepływowa

w diagnostyce

w diagnostyce

laboratoryjnej płynów z

laboratoryjnej płynów z

jam ciała

jam ciała

OML, 2008

Mirosława

Pietruczuk

Cytometria

Cytometria

przepływowa

przepływowa

Pozwala na

szybką,

wieloparametrową

analizę

zawiesiny komórek.

Zasada ogniskowania hydrodynamicznego

3 - dif

3 - dif

SS

FS

Ly

Mid

Neu

 

                                                                                  

                                     

 

    

 

    

 

    

 

    

 

   

 

    

 

    

 

    

 

                                                                                  

                                     

 

    

 

    

 

    

 

    

 

   

 

    

 

    

 

    

 

                                                                                  

                                    

 

    

 

    

 

    

 

    

 

   

 

    

 

    

 

    

Slide 46 of 81

Cytometria przepływowa

Cytometria przepływowa

Warunkiem wykonania badania jest

doprowadzenie posiadanego materiału

do

zawiesiny

pojedynczych

komórek:

szpik kostny

pobierany jest

na heparynę

krew obwodowa

pobierana

jest

na

wersenian

dwupotasowy
(procedura dla krwi pełnej)

węzły

chłonne

–

homogenizacja

płyny

z

jam

ciała

–

antykoagulant,

jeżeli jest potrzeba

Cytometria

Cytometria

przepływowa

przepływowa

Pozwala na ocenę fenotypu komórek

pobranych

ze źródła wtórnego

np. płynu

opłucnowego,

otrzewnowego,

towarzyszącego guzom, w sytuacjach

kiedy

nie

można

pobrać

materiału

pierwotnego.

Pobrany materiał

Pobrany materiał

musi być dostarczony w odpowiednim czasie
i warunkach:

węzeł chłonny

- zawieszony w jałowym

obojętnym płynie, np. soli fizjologicznej, czas
transportu < 2h

szpik kostny

- umieszczony w chłodzonym

pojemniku
czas opracowania nie dłuższy niż kilka godzin

płyny z jam ciała

czas opracowania nie dłuższy niż kilka godzin

W uzyskanej

W uzyskanej

zawiesinie

zawiesinie

komórkowej

komórkowej

:

:

ocenia się

żywotność komórek

(niska np. 60% powoduje
nieswoiste wiązanie przeciwciał).

UWAGA:



liza krwinek czerwonych (powoduje uszkodzenie

części wrażliwych komórek blastycznych)



wirowanie w gradiencie gęstości (powoduje

utratę pewnych populacji komórek) i może

przyczyniać się do błędnej oceny proporcji

populacji komórek.

Przeciwciała monoklonalne

Przeciwciała monoklonalne

(MoAb)

(MoAb)

Przeciwciała monoklonalne
skierowane są na

antygeny

różnicowania CD
(cluster of differentiation),

obecne:

na powierzchni

i/lub

w cytoplazmie

i/lub

w jądrze komórek

Metody wykorzystujące

Metody wykorzystujące

MoAb

MoAb

w diagnostyce:

w diagnostyce:



immunofluorescencja



mikroskop fluorescencyjny

(promieniowanie ultrafioletowe )



cytometria:

cytometry
sortery ( światło laserowe)



immunocytochemia



metody immunoenzyma
tyczne:



APAAP, POX

Ocena fenotyp

Ocena fenotyp

u

u

czyli

ekspresji determinant powierzchniowych

oraz struktur cytoplazmatycznych komórek,
jąder komórkowych

przy użyciu przeciwciał

monoklonalnych pozwala na określenie
stopnia dojrzałości i zróżnicowania komórek.

Ekspresja determinant

Ekspresja determinant

Na powierzchni komórek jest bardzo różna
od

silnej

np. HLA-DR, CD19, po

słabą

np.

CD7.

Najczęściej przyjmuje się, że komórki
badane

wykazują

ekspresję

danej

determinanty wtedy,

jeżeli minimum

20%

komórek

wykazuje

intensywność

fluorescencji wyższą niż tło.

Cytometria przepływowa w

Cytometria przepływowa w

różnicowej

różnicowej

diagnostyce białaczek

diagnostyce białaczek

ostrych.

ostrych.

1976r - klasyfikacja FAB
(Mo - M6, L1 - L3)

1985r –
uzupełnienie

klasyfkacji

FAB (M7, M5a,

M5b)

indukcja
remisji

intensyfkacja

leczenie

podtrzymujące
i reindukcyjne

~ 10

9

blastów

< 10

6

blastów

10

-1

blastów

~ 10

12

blastów

~1
kg

Białaczka
pełnoobjawowa

~1 g

~1
mg

Remisja
labolatoryjna
i kliniczna

Skuteczność
kontroli
immunologiczne
j

90 % prawdopodo-
bieństwa
wyleczenia

Podstawą współczesnego rozpoznawania

ostrych białaczek jest kompleksowa ocena



morfologiczno-cytochemiczna



immunologiczna



cytogenetyczna

klonu białaczkowego

(populacji komórek

wywodzących się z klonu

białaczkowego).

Analiza fenotypów

Analiza fenotypów

komórek patologicznych posiada znaczenie

nie tylko w okresie diagnostycznym a także w

jego trakcie jak i we wznowach.
Obecnie

duży

nacisk

kładzie

się

na

poszukiwanie choroby resztkowej

(minimal

residual disease)

w oparciu o nietypowe

fenotypy komórek patologicznych,
oznaczane metodą
cytometrii przepływowej.

Badania fenotypu

Badania fenotypu

komórek

komórek

Powinno być wykonane równolegle
do oceny hematologicznej rozmazu
i mielogramu czy też histologicznej
węzła chłonnego lub bioptatu guza.

Panele

Panele



(

standardowe lub zestawione samodzielnie

zestawy

przeciwciał

monoklonalnych)

pozwalają na :



określenie z jakiej linii komórkowej pochodzi

badana komórka,



jaki

jest

jej

stopień

dojrzałości

i

zróżnicowania,



w

jakim

stopniu

jej

fenotyp

jest

odpowiednikiem

fenotypu

prawidłowej

komórki

szpiku

czy

węzła

chłonnego

znajdującej się na takim samym etapie

dojrzewania i zróżnicowania.

Gina –

po

przeszcze

pie szpiku

Cytometria przepływowa

Cytometria przepływowa

w diagnostyce chłoniaków.

w diagnostyce chłoniaków.

Cytometria przepływowa została

wykorzystana do opracowania
nowej klasyfikacji chłoniaków
nieziarniczych

(REAL i WHO).

Klasyfikacja REAL i WHO ma na
celu powiązanie rozpoznania z
obrazem klinicznym, sposobem
leczenia i rokowaniem.

Badanie

Badanie

fenotypu

fenotypu

komórkowego

komórkowego

Powinno być wykonane

równolegle do oceny
histologicznej węzła
chłonnego lub bioptatu
guza. Określenie fenotypu komórek
chłoniaka

niaziarniczego

wymaga

zestawu innych niż w białaczkach
ostrych, przeciwciał monoklonalnych

Typ zwykły PBL:

Typ zwykły PBL:

Przewlekła

Przewlekła

białaczka

białaczka

limfocytowa

limfocytowa

B - komórkowa

B - komórkowa

Hiperleukocytoza

Limfocytoza -

>4.0x10

9

/l

we krwi obwodowej

Różnego stopnia

pancytopenia:

(leukopenia

erytrocytopenia

trombocytopenia)

Diagnostyka CLL

Diagnostyka CLL

W oparciu o kryteria IWCLL i NCI
-Working Group Guidelines:
1) liczba limfocytów we krwi obwodowej
> 5.0x 10

9

/l i podstawowy fenotyp

CD19+, CD5+, CD23+, FMC-7 minus.

2)

„pre CLL” –

obecność
monoklonalnej
limfocytozy
<5,0x10

9

/l

Cytometria

Cytometria

przepływowa

przepływowa

w diagnostyce

w diagnostyce

przewlekłej

przewlekłej

białaczki

białaczki

szpikowej

szpikowej

.

.

Pozwala

także

na

ocenę

fenotypu

komórkowego

w

kryzie

blastycznej

przewlekłej białaczki szpikowej, w której
u

20-30% chorych występuje przełom

limfoblastyczny

(najczęściej

z

cIg

(cytoplazmatyczną Ig) lub

antygenem

Calla, najrzadziej z markerami linii T).

Zespoły

Zespoły

mielodysplastyczne (MDS)

mielodysplastyczne (MDS)

i cytometria przepływowa

i cytometria przepływowa

Zespoły mielodysplastyczne stanowią duży

problem kliniczno-diagnostyczny.
Cytometria

przepływowa

w

MDS

wykorzystywana jest przede wszystkim

do

poszukiwania komórek o nieprawidłowym

fenotypie

(np. jednoczesna ekspresja
CD2 i CD19)

i do wychwycenia
transformacji
w ostrą białaczkę.

MDS

MDS

Należy

jednak

podkreślić,

że

różnorodność zaburzeń

w obrębie wielu

linii komórkowych w MDS, utrudnia
ujednolicenie kryteriów rozpoznawczych
w oparciu o fenotyp komórkowy.

Poszukiwanie choroby

Poszukiwanie choroby

resztkowej (

resztkowej (

MRD

MRD

)

)

- minimal

- minimal

residual disease

residual disease

Bardzo często w celu wykrycia MRD łączy

się ocenę fenotypu komórek z analizą

DNA. Takim przykładem mogą być

białaczki

ALL

(ostre

białaczki

limfoblastyczne)

z

obecnością

aneuploidalnych blastów.

Różnicuje

się

je

z

komórkami

diploidalnymi po chemioterapii.

Zaleca

się wtedy oznaczenie antygenów CD34,

CD10, CD19 z jednoczesną analizą

cytometryczną DNA.

Nietypowy fenotyp

Nietypowy fenotyp

pojawienie się na powierzchni komórki

dodatkowych

determinant,

których

nie

posiada

odpowiadająca

jej

komórka

prawidłowa z danej linii i na tym samym

etapie dojrzewania i
różnicowania
np. białaczka limfoblastyczna typu common:

CD10

/CD19, CD22, CD20, HLA-DR

,

lub brak ekspresji determinat, która znajduje

się na prawidłowych komórkach
np. białaczka limfoblastyczna T komórkowa:

CD2, CD5, cyt.CD3, CD8, TdT i

brak sCD3,

TCR.

Ocena obecności

Ocena obecności

molekuły

molekuły

lekooporności

lekooporności

Oporność wielolekowa (MDR – multi
drug

resistance)

powoduje

niewrażliwość komórek nowotworowych
na

chemioterapię.

Jednym

z

mechanizmów odpowiedzialnych za ten
fenomen jest redukcja akumulacji leku
wewnątrz komórki w zależności od
aktywności

transbłonowego

białka

transportowego.

Ocena obecności

Ocena obecności

molekuły

molekuły

lekooporności

lekooporności

Białko to jest produktem genu
mdr1 zwanym P-glikoproteiną (P-
gp) (6). P-gp działa jako ATP-
zależna

pompa,

powodująca

wypływ

leków

czy

toksyn

z

komórki.

W szpiku kostnym P-gp

jest wykrywana na komórkach
CD34+ (komórki hemopoetyczne
stem).

MDR

MDR

Do oceny oporności

wielolekowej stosuje się
czynnościową analizę
cytometryczną wypływu
znakowanego

fikoerytryną R123

lub przeciwciała
monoklonalne

znakowane

fikoerytryną, skierowane
przeciwko
Zewnątrzkomórkowemu
epitopowi P-gp.

Cytometria przepływowa w

Cytometria przepływowa w

różnicowej diagnostyce

różnicowej diagnostyce

laboratoryjnej -

laboratoryjnej -

przyszłość

przyszłość

Ocena procesu

apoptozy

zastosowanie

do

prognozowania odpowiedzi
na

leczenie

i

terapii

celowanej.

(ocena

indeksu

apoptotycznego,

białek

rodziny Bcl-2,
kaspaz, kinaz,
potencjału
mitochondrialnego).

Ilościowa cytometria przepływowa

Ilościowa cytometria przepływowa

w klinicznej diagnostyce

w klinicznej diagnostyce

laboratoryjnej

laboratoryjnej

QFCM – quantitative flow cytometry

Ilościowa cytometria przepływowa

wymaga

dodatkowo

standaryzacji.

Konwencjonalne immunofenotypowanie

pozwala

zmierzyć efekt łączenia Ab z

MoAb

,

proporcjonalne do ich ilości.

QFCM

QFCM

Pozwala na:

ocenę

stężenia/gęstości

antygenu na docelowej komórce

Kliniczne zastosowanie

Kliniczne zastosowanie

QFCM

QFCM



Choroby rozrostowe:

wykorzystanie aberrantnej ekspresji

antygenówna

komórkach

nowotworowych



Przykłady:



CD20

w CLL



„Bright” ekspresja CD20 w HCL



Obniżenie ekspresji

CD3

w Mucosis

fungoides



CD5 –

„dim” w LGL

Kliniczne zastosowanie

Kliniczne zastosowanie

QFCM

QFCM

Bcl-2

Ilościowe oznaczenie ekspresji
białka Bcl-2 ma szczególne
znaczenie
w

leczeniu

antysensami

olgonukletydowymi. Stosuje się
je w:



ALL (B komórkowej)



AML (M1, M2)

Kliniczne zastosowanie

Kliniczne zastosowanie

QFCM

QFCM



Ilościowe

oznaczenie

gęstości receptorów dla
estrogenu

lub

progesteronu w leczeniu
raka piersi

Kliniczne zastosowanie

Kliniczne zastosowanie

QFCM

QFCM



MRD (Minimal residual

disease):



Pozwala na wykrycie

populacji komórek
nowotworowych w ilości
< 1%.

Kliniczne zastosowanie

Kliniczne zastosowanie

QFCM

QFCM

Przeciwciała monoklonalne w terapii



za pomocą immunotoksyn:



Rituximab,

(

antyCD20

)

w

chłoniakch B komórkowych



Herceptin,

(Trastuzumab,

anty

EGFR

(HER2, 1,2) w raku piersi

HER2+



Avastin, (

anty VGFR

) w raku jelita

grubego

Kliniczne zastosowanie

Kliniczne zastosowanie

QFCM

QFCM



ONTAK, (

anty IL-2R

), w

leczeniu

chłoniaków

T

komórkowych



Campath,

(Alemtuzumab,

antyCD52

), w białaczkach i

chłoniakach

Kliniczne zastosowanie

Kliniczne zastosowanie

QFCM

QFCM



Prognozowanie zachorowania na AIDS

(ocena aktywności wirusów HIV)



Ilościowa ocena ekspresji

antygenu

CD38 na limfocytach CD8+

pozwala na

przybliżone

określenie

czasu

wystąpienia klinicznych objawów AIDS.



Rodzinna Hypercholesterolemia



Ilościowa ocena ekspresji receptora

LDL

Kliniczne zastosowanie

Kliniczne zastosowanie

QFCM

QFCM



Sepsa:



- ilościowa ocena ekspresji

antygenu

CD69

na aktywnych leukocytach



- ilościowe obniżenie ekspresji CD14
na monocytach i CD64 i CD11b na
neutrofilach



Rheumatoid arthritis:



HLA-DR4



-

Kliniczne zastosowanie

Kliniczne zastosowanie

QFCM

QFCM



Choroby genetyczne:



Zespół leniwych leukocytów -

ilościowa ocena ekspresji

cząstek CD11/CD18



Transplantacja: ocena

choroby GVHD

Przerwa na kawę