

Cytometr (cytofluorometr) przepływowy służy do

Cytometr (cytofluorometr) przepływowy służy do

szybkiego pomiaru dużej ilości cząstek lub

szybkiego pomiaru dużej ilości cząstek lub

komórek zawieszonych w cieczy i

komórek zawieszonych w cieczy i

przepływających jedna za drugą przez punkt

przepływających jedna za drugą przez punkt

pomiarowy.

pomiarowy.



Zaletą tej metody jest fakt, że pomiar

Zaletą tej metody jest fakt, że pomiar

dokonywany jest na pojedynczej komórce, a nie

dokonywany jest na pojedynczej komórce, a nie

uśredniany na całą populację oraz, że w krótkim

uśredniany na całą populację oraz, że w krótkim

czasie (kilka- kilkadziesiąt sekund) można

czasie (kilka- kilkadziesiąt sekund) można

zanalizować tysiące komórek.

zanalizować tysiące komórek.

Cytometr przepływowy

Cytometr przepływowy



Umożliwia ocenę morfologii komórek

Umożliwia ocenę morfologii komórek

poprzez pomiar rozproszenia światła przez

poprzez pomiar rozproszenia światła przez

komórki.

komórki.



FSC

FSC

– światło rozproszone w osi promienia

– światło rozproszone w osi promienia

świetlnego odpowiadające w przybliżeniu

świetlnego odpowiadające w przybliżeniu

wielkości komórek

wielkości komórek



SSC

SSC

– światło rozproszone pod kątem 90° do

– światło rozproszone pod kątem 90° do

osi padającego promienia wyrażające

osi padającego promienia wyrażające

ziarnistość badanych cząsteczek.

ziarnistość badanych cząsteczek.

Cytometria przepływowa

Cytometria przepływowa



Umożliwia ocenę fluorescencji (FL1, FL2,

Umożliwia ocenę fluorescencji (FL1, FL2,

FL3) barwników zastosowanych do

FL3) barwników zastosowanych do

znakowania komórek (fluorochromów) po

znakowania komórek (fluorochromów) po

wzbudzeniu

wzbudzeniu

przez promień lasera.

przez promień lasera.



Fluorochromy związane są z przeciwciałami

Fluorochromy związane są z przeciwciałami

łączącymi się z antygenami

łączącymi się z antygenami

powierzchniowymi

powierzchniowymi

i wewnątrzkomórkowymi.

i wewnątrzkomórkowymi.

Cytometria przepływowa

Cytometria przepływowa



rozpoznawanie białaczek i chłoniaków oraz monitorowanie

rozpoznawanie białaczek i chłoniaków oraz monitorowanie

przebiegu choroby

przebiegu choroby



diagnostyka wrodzonych i nabytych zaburzeń

diagnostyka wrodzonych i nabytych zaburzeń

immunologicznych

immunologicznych



diagnostyka trombocytopenii, określenie liczby

diagnostyka trombocytopenii, określenie liczby

retikulocytów

retikulocytów



ocena markerów powierzchniowych komórek

ocena markerów powierzchniowych komórek

nowotworowych (komórki złuszczone z powierzchni guzów

nowotworowych (komórki złuszczone z powierzchni guzów

lub materiał z biopsji cienkoigłowej)

lub materiał z biopsji cienkoigłowej)



badania naukowe (ocena fazy cyklu komórkowego,

badania naukowe (ocena fazy cyklu komórkowego,

apoptozy, ilość wydzielanych cytokin i inne)

apoptozy, ilość wydzielanych cytokin i inne)



w przypadku połączenia cytometru z sorterem – sortowanie

w przypadku połączenia cytometru z sorterem – sortowanie

komórek

komórek

Zastosowanie cytometrii

Zastosowanie cytometrii

przepływowej:

przepływowej:

Apoptozę trudno badać w materiale

Apoptozę trudno badać w materiale

tkankowym co wynika z:

tkankowym co wynika z:



krótkiego czasu trwania - od kilku

krótkiego czasu trwania - od kilku

do kilkunastu godzin

do kilkunastu godzin



fagocytozy ciałek apoptotycznych

fagocytozy ciałek apoptotycznych

Wykrywanie procesu apoptozy

Wykrywanie procesu apoptozy

Techniki wykrywania apoptozy opierają się na analizie:

Techniki wykrywania apoptozy opierają się na analizie:



zmian morfologii komórek (

zmian morfologii komórek (

ocena jądra komórkowego, stanu

ocena jądra komórkowego, stanu

kondensacji chromatyny, znakowanie ciałek apoptotycznych

kondensacji chromatyny, znakowanie ciałek apoptotycznych

)

)



przemieszczenia się fosfatydyloseryny (FS) na zewnątrz błony

przemieszczenia się fosfatydyloseryny (FS) na zewnątrz błony

komórkowej (

komórkowej (

test z aneksyną V

test z aneksyną V

)

)



czynności mitochondriów (

czynności mitochondriów (

zmniejszenie akumulacji rodaminy

zmniejszenie akumulacji rodaminy

123 w związku ze spadkiem mitochondrialnego potencjału

123 w związku ze spadkiem mitochondrialnego potencjału

transbłonowego

transbłonowego

)

)



aktywacji kaspaz apoptotycznych (

aktywacji kaspaz apoptotycznych (

kaspaza 3

kaspaza 3

)

)



wypływu cytochromu c i AIF z mitochondriów

wypływu cytochromu c i AIF z mitochondriów



degradacji DNA (

degradacji DNA (

elektroforetyczna ocena długości

elektroforetyczna ocena długości

fragmentów DNA, znakowanie rozszczepionych końców DNA

fragmentów DNA, znakowanie rozszczepionych końców DNA

-TUNEL, cytometryczna ocena zawartości DNA

-TUNEL, cytometryczna ocena zawartości DNA

)

)

Wykrywanie procesu apoptozy

Wykrywanie procesu apoptozy