CYTOMETRIA PRZEPŁYWOWA

Joanna Grądzka

Grupa 4

Cytometria przepływowa



Metoda diagnostyczna stojąca na pograniczu cytopatologii i analityki medycznej



Metoda pomiaru pojedynczych komórek lub cząsteczek przepływających przez aparat w strumieniu cieczy



Umożliwia ocenę wielkości, intensywności zabarwienia oraz intensywności fluorescencji badanych komórek

Badane komórki



Jedynie komórki znajdujące się w zawiesinie



Najdogodniejszym materiałem do badań są komórki krwi, płynów ustrojowych

Mierzone sygnały



Rozproszenie światła przez badaną próbkę



Intensywność fluorescencji składników komórki lub zastosowanych barwników



Absorpcja światła przez próbkę



Pomiary w czasie – użyteczne dla badania kinetyki, dynamicznych zachowań populacji komórek

Budowa cytometru przepływowego



Układ hydrauliczny - wytwarza strumień cieczy otaczającej zawiesinę komórkową. Z jego pomocą badane cząsteczki przechodzą przez punkt pomiarowy z odpowiednią prędkością.



Źródło światła - przechodząc przez badane cząstki wytwarza sygnał rozproszenia i fluorescencji. Funkcję tą może spełniać laser lub lampa łukowa.



Układ optyczny - kształtuje i ogniskuje wiązkę laserową na badanej komórce. W jego skład wchodzi również optyka zbierająca, która odfiltrowuje poszczególne długości fali oraz ogniskuje promienie świetlne na fotokatodzie detektorów.



Układ elektryczny - przetwarza sygnały świetlne na impulsy elektryczne.



System analizy danych - odpowiednie oprogramowanie pozwalające na statystyczne opracowanie uzyskanych wyników.

Schemat cytometru przepływowego



Filtry dichroiczne odbijają fale krótkie i pozwalają na transmisję fal długich



Filtry środkowo-przepustowe przepuszczają jedynie światło z bardzo wąskiego zakresu długości fali



Użycie właściwych filtrów pozwala stwierdzić obecność określonych znaczników w badanej próbce.

Parametry mierzone za pomocą cytometru



Strukturalne:



Rozmiar, kształt, cytoplazmatyczna ziarnistość



Zawartość barwnika np.:



Hemoglobina, barwniki fotosyntetyczne, porfiryny



Aminokwasy fluoryzujące w białkach np.:



Tryptofan, tyrozyna



Zawartość DNA, RNA, wszystkich białek, lipidów, cukrów powierzchniowych, antygenów

Przedstawienie uzyskanych wyników



Dokładne dane liczbowe



W formie wykresów:



Jednowymiarowych (A)



Histogram



Dwuwymiarowych (B)



Kropkowy



Gęstości



Konturowy



Trójwymiarowych (C, D)



Perspektywiczny

Podsumowanie



W zależności od jakości cytometru można:



Badać koekspresję nawet czterech antygenów, co nie jest możliwe w żadnej innej metodzie



Analizować bardzo liczne populacje obiektów w krótkim czasie



Osiągnąć wysoką dokładność i zminimalizować rozrzut wyników



W ciągu kilku sekund z niezwykłą dokładnością i powtarzalnością wykryć subpopulacje rzadko występujące i nietypowe



Cytometria przepływowa jest nieinwazyjnym (tzn. nie naruszającym integralności komórkowej) narzędziem badawczym w wieloparametrowej ocenie struktury i funkcji komórek

Piśmiennictwo



Baran J., 2008. Nowa epoka cytometrii przepływowej - przewodnik po współczesnych cytometriach i ich zastosowanie. Postępy Biologii Komórki 35 (24): 3-15.



http://www.e-biotechnologia.pl/Artykuly/Cytometria-przeplywowa/ - autor: Anna Kurcek.



Śliwińska E., 2008. Zastosowanie cytometrii przepływowej do oznaczania zawartości DNA u roślin. Postępy Biologii Komórki 35 (24): 165-176.



Urszula Lisiecka, Krzysztof Kostro, Łukasz Jarosz, Cytometria przepływowa jako nowoczesna metoda w diagnostyce i prognozowaniu chorób, artykuł przeglądowy Medycyna Wet. 2006, 62(9).