CYTOMETRIA PRZEPŁYWOWA

I LASEROWA CYTOMETRIA SKANINGOWA W MEDYCYNIE

Cytometr przepływowy (flow cytometer, FC) FACSCalibur pozwala na pomiar

intensywności czterech kolorów fluorescencji wzbudzonych światłem jednego (argon laser,

488 nm) lub dwóch laserów (red diode laser, 635 nm) oraz pomiar światła rozproszonego

w komórkach umieszczonych w zawiesinie i zabarwionych fluorochromami lub

przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromami. Pomiar w FC opiera się na założeniu,

że intensywność emitowanej fluorescencji wywołanej iluminacją komórki światłem lasera

o długości fali zbliżonej do maksimum absorpcji dla danego fluorochromu jest wprost

proporcjonalna do ilości składnika komórki znakowanego tym fluorochromem. Pomiar

światła rozproszonego, mierzonego w przedłużeniu promienia lasera (forward scatter) i pod

kątem 90

o

do promienia lasera (side scatter), pozwala na analizę odpowiednio wielkości

komórki i ziarnistości cytoplazmy. Jest to pomiar jakościowy i ilościowy. Zaletą cytometrii

przepływowej jest możliwość szybkiego, obiektywnego i zautomatyzowanego pomiaru

pojedynczych komórek w dużych populacjach komórkowych, wykrywanie śladowych

subpopulacji, równoległa ocena kilku parametrów komórki (analiza wieloparametrowa)

i opcja sortowania komórek. Niedogodnością FC jest brak możliwości korelacji wyników

pomiarów fluorescencji z morfologią komórek oraz technika przygotowania materiału

do badań wymagająca izolacji z tkanki pojedynczych komórek.

W medycynie FC są wykorzystywane m.in. do immunofenotypowania, analizy

i sortowania komórek hematopoetycznych, oceny oporności wielolekowej, ploidii, replikacji

DNA, struktury chromatyny, zawartości RNA, zawartości białek, ekspresji antygenów

(powierzchniowych, cytoplazmatycznych, jądrowych), właściwości błon cytoplazmatycznych

(potencjał, przepuszczalność), aktywności enzymów, stężenia Ca

+2

, apoptozy, pH i wielu

innych.

Wprowadzenie systemów komputerowej analizy obrazu (image analysis system)

umożliwiło wykonywanie pomiarów w skrawkach histologicznych bez potrzeby izolacji

pojedynczych komórek, analizę parametrów morfologicznych komórek i jądra komórkowego,

wizualizację badanych komórek i ich selekcję do pomiaru. Pomiar w analizatorze obrazu jest

czasochłonny i praktycznie nie daje możliwości przeprowadzenia analizy ilościowej.

Laserowy cytometr skaningowy (laser scanning cytometer, LSC) jest połączeniem FC

i systemu komputerowej analizy obrazu. LSC mierzy cztery kolory fluorescencji (zieloną,

pomarańczową, czerwoną i bliską podczerwieni) wzbudzoną jednym (argon laser, 488 nm)

lub dwoma laserami (he-ne laser, 633 nm) oraz intensywność światła rozproszonego

w komórkach umieszczonych na szkiełku podstawowym i zabarwionych fluorochromami.

Pomiar odbywa się z szybkością do 100 komórek/sekundę, z czułością (sensitivity)

i dokładnością (accuracy) porównywalną z uzyskiwanymi w nowoczesnych FC. Porównanie

właściwości oraz możliwości FC i LSC przedstawiono w tabeli poniżej.

Porównanie właściwości oraz możliwości FC i LSC

Cecha

Cytometr przepływowy (FC)

Laserowy cytometr

skaningowy (LSC)

Barwienie i pomiar komórek

w zawiesinie

na szkiełku

podstawowym

Analiza wielu parametrów
fluorescencyjnych komórki

tak

tak

Korelacja fluorescencji z morfologią
komórek

możliwa przy użyciu sortera

tak

Analiza parametrów związanych z
przestrzenną dystrybucją
fluorochromu w komórce (np. jądro
versus cytoplazma)

nie

tak

Analiza maksymalnej intensywności
fluorescencji na danym obszarze

nie

tak (max pixel)

Liczba pomiarów danej komórki

jeden

wielokrotne

Wielokrotny pomiar tych samych
komórek celem oznaczenia zmian
fluorescencji w czasie (kinetyka)

nie

tak

Wielokrotne pomiary tych samych
komórek sekwencyjnie zabarwionych
różnymi fluorochromami

nie

tak

Utrata komórek w trakcie barwienia

duża

(zależna od liczby wirowań)

minimalna

(< 5%)

Archiwizacja zmierzonego materiału

nie

tak

Pomiar w skrawkach histologicznych

nie

tak

Analiza parametrów fluorescencji w
zależności od topografii skrawka

nie

tak

Automatyczna analiza miejsc FISH

praktycznie niemożliwa

tak

Pomiar światła rozproszonego

forward scatter

side scatter

forward scatter

Sortowanie komórek/chromosomów

tak

nie

Szybkość pomiaru

do 10 000 komórek/s

do 100 komórek/s

Zasada pomiaru fluorescencji komórek w LSC jest podobna do FC, z tym że pomiar

komórek w LSC odbywa się na szkiełku podstawowym, a w FC w zawiesinie. Oba

urządzenia pozwalają na pomiar zintegrowanej wartości fluorescencji, światła rozproszonego

i czasu. LSC umożliwia równoczesny pomiar fluorescencji w dwóch różnych

kompartmentach komórki, tj. na obszarze jądra komórkowego i osobno na obszarze

cytoplazmy. Jednym z parametrów rejestrowanych w trakcie pomiaru w LSC jest położenie

komórki na szkiełku podstawowym, co jest podstawą korelacji parametrów fluorescencji

z morfologią komórek. Komórki po pomiarze w LSC mogą być zabarwione innymi

fluorochromami, ponownie poddane pomiarowi, a wyniki pomiarów połączone w jeden plik.

Ponieważ rejestrowana jest pozycja każdej komórki na szkiełku, zatem po wykonaniu

pomiaru w skrawku histologicznym możliwe jest odtworzenie mapy geograficznej preparatu

i analiza parametrów fluorescencji komórek zlokalizowanych na określonym obszarze

zmierzonego skrawka (np. tylko w tej części preparatu, która zawiera utkanie nowotworowe).

Przygotowanie preparatów do pomiaru w LSC jest proste. Komórki już raz

przytwierdzone do szkiełka podstawowego nie ulegają przemieszczaniu i nawet wielokrotne

płukanie i ponowne barwienie powoduje utratę jedynie minimalnej liczby komórek (< 5%).

Zastosowania LSC częściowo pokrywają się z zastosowaniami FC. Zwraca uwagę

użycie LSC do pomiarów fluorescencji w preparatach histologicznych oraz możliwości

analizy przestrzennej dystrybucji fluorochromu, która może służyć do wykrywania

translokacji białek z jądra do cytoplazmy, np. translokacji NF-kB, p53, p21 lub białek

pośredniczących w przekazywaniu sygnałów.

prof. dr hab. Elżbieta Urasińska

Zakład Patomorfologii