Seminarium + Ćwiczenie

III Rok Wydział Lekarski

1

O czym porozmawiamy….

I. Cytometria przepływowa –

narzędzie badawcze i
diagnostyczne

II. Patofizjologia komórki - proliferacja
III. Patofizjologia komórki - apoptoza

2

I. Cytometria przepływowa -

- narzędzie badawcze i

diagnostyczne

3

• Cytometria przepływowa

– Mierzy właściwości optyczne przepływających

komórek (żywych lub utrwalonych)

• Przepływowe sortowanie komórek

– Oddziela komórki różnych populacji na

podstawie odmiennych właściwości optycznych

ang. Fluorescence-Activated Cell

Sorting (FACS)

Co to jest cytometria?

4

Komórki w zawiesinie
przepływają pojedynczo
przez oświetloną komorę,
rozpraszając światło i
emitując fluorescencję;
wielkości rozproszenia
światła i fluorescencji są
rejestrowane i
przetwarzane
komputerowo.

Fluid

Fluid

y

y

ka

ka

Opt

Opt

yk

yk

a

a

Ele

Ele

k

k

troni

troni

ka

ka

Podstawy cytometrii przepływowej

5

Detektor

FSC

(10

o

)

Detektor SSC (90

o

)

Laser

Detektor FL1

(fl. zielona)

Detektor FL2

(fl. pomarańczowa)

Jak to działa?

6

CD3

+

CD3

-

CD4

+

CD4

L

O

CD4

-

CD8

+

CD8

in

t

CD8

-

Natężenie fluorescencji

Wynik analizy: HISTOGRAM

7

10

1

10

2

10

3

10

4

CD3 -->

1

0

1

1

0

2

1

0

3

1

0

4

C

D

4

-

->

FL1-CD3

F

L

2

-C

D

4

kolor

CD3

-

CD4

-

czarny

CD3

+

CD4

-

niebieski

CD3

-

CD4

+

błękitny

CD3

+

CD4

+

zielony

50%

5%

25%

20%

ANALIZA KWADRANTOWA

Wynik analizy: DOT PLOT

8

• Analiza

proporcji komórek

w mieszaninie

(immunofenotypizacja)

• Wykrywanie

rzadkich komórek

• Ocena niektórych

właściwości

czynnościowych badanych komórek

Zastosowania cytometrii przepływowej

9

CD # = cluster of differentiation

CD2

CD4

Markery powierzchniowe

Markery cytoplazmatyczne

Immunofenotypizacja

10

Subpopulacje limfocytów krwi

obwodowej

11

PRZYKŁAD: Zaburzenia składu subpopulacji

limfocytów krwi obwodowej

Osoba 1

Osoba 2

12

DCFH-DA

DCF

DCF

DCFH-DA

DCFH-DA

DCF

DCF

H

H

2

2

2

2

H O

H O

NEUTROFIL

Testy czynnościowe – wybuch tlenowy

13

Obrazki z testu fagocytozy

FITC-bakterie

NEUTROFIL

Testy czynnościowe – fagocytoza

14

• podejrzenie

niedoboru odporności

wrodzonej i nabytej

(zaburzenia proporcji populacji komórek i/lub ich

właściwości)

• w tym

AIDS

• podejrzenie

nowotworu hematologicznego

(pojawienie się komórek o swoistym fenotypie)

• monitorowanie przebiegu choroby nowotworowej i jej

remisji

• podejrzenie

choroby resztkowej

(wykrywanie bardzo

rzadkich komórek)

• zaburzenia

krzepnięcia

– podejrzenie zaburzeń

płytkowych

• zaburzenia

erytropoezy

(retikulocytoza)

• bezpłodność

Kiedy i kogo kierować na badania

diagnostyczne?

15

• Materiałem do badań techniką cytometrii

przepływowej może być:

– Pełna krew (pobrana na EDTA lub heparynę,

bardzo dobrze wymieszana i przechowywana
nie dłużej niż kilka godzin)

– Popłuczyny oskrzelowe (bronchial lavage)
– Docelowo – inne płyny biologiczne, jak płyn

mózgowo-rdzeniowy, mocz

– Osocze lub surowica (cytokiny)

Jakie warunki powinien spełniać

materiał biologiczny?

16

Cytometria przepływowa umożliwia m.in.:

• ocenę liczby receptorów na/w komórkach,
• ocenę

proliferacji

komórek,

• ocenę nasilenia różnych faz procesu

apoptozy

– mitochondrialnej,
– błonowej,
– efektorowej,

• ocenę aktywności niektórych enzymów,
• ocenę „sygnału wapniowego”,
• kariotypowanie
• sortowanie bardzo czystych (>99%) populacji żywych komórek

itd..

Możliwości cytometrii przepływowej są

ogromne…

17

są dwa procesy regulujące liczbę komórek

w organizmie: proliferacja i apoptoza,

pozostające w równowadze…

18

II. Patofizjologia komórki -

- proliferacja

19

•

zapotrzebowania na nowe komórki:

• wzrost organizmu,

• reakcja na stymulację,

• wysiłek fizyczny,

• praca umysłowa,

• odpowiedź immunologiczna;

• obecności czynników wzrostowych

• prawidłowej transdukcji sygnałów

• właściwości środowiska:

• podłoże (białka macierzy
międzykomórkowej)

• substancje odżywcze

• tlen

• braku/obecności błędów w samych
komórkach
(DNA)

Zdolności podziałowe komórek zależą

od:

20

Uszkodzone lub zużyte komórki są eliminowane

i zastępowane przez nowe, bez zmiany

wielkości/objętości tkanki lub narządu….

Przewaga śmierci komórek nad proliferacją

prowadzi do reorganizacji/zaniku tkanki.

Do przyczyn należą:

• czynniki toksyczne

• endogenne czynniki hamujące proliferację, np. IL-10, TGFβ

• nadmierna indukcja apoptozy

• niedobór substancji pokarmowych

• niedobór czynników wzrostowych

Fizjologia  patofizjologia

21

• Zaburzenia wzrostu narządu/tkanki np

.:

• karłowatość,
• niedorozwój (hipo- lub aplazja) narządu;

• Utrudnione gojenie się ran i innych ubytków

tkankowych:

• zaburzenia czynności „ze zużycia” (niezależnie od

wieku osobniczego),

• marskość wątroby, nerki,
• wtórne niedobory endokrynologiczne,
• niedobory immunologiczne;

• Starzenie się (także przedwczesne).

Konsekwencje

niedoborów

proliferacji

komórek:

22

1. Prowadzi do rozwoju nowotworów;

(niekontrolowanego rozplemu (namnażanie) populacji

komórek przekraczającego zapotrzebowanie organizmu)

2. Przyczynia się do rozwoju wielu chorób;

(

reumatoidalne zapalenie stawów, kłębuszkowe zapalenie

nerek, łuszczyca, przewlekłe choroby układu krążenia –
niedokrwienie, rozrost prostaty)

Do przyczyn należą:
- nadmierna, niekontrolowana proliferacja
- brak lub obniżenie apoptozy

Konsekwencje

przewagi proliferacji

komórek nad eliminacją:

23

24

• W komórkach

przygotowujących się

do podziału (faza G0)

od:

– wykrywania błędów w

DNA i ich reperacji,

– inicjacji apoptozy w

przypadku niemożności

naprawienia mutacji,

– oceny długości

telomerów.

• W trakcie cyklu

podziałowego od:

– decyzji o kontynuacji

lub zatrzymaniu cyklu

w „punktach

kontrolnych”,

– prawidłowego rytmu

syntezy i degradacji

protoonkogenów, a

zwłaszcza cyklin.

G
0

Prawidłowa kontrola nad proliferacją

komórek zależy od:

25

Cytometryczna ocena cyklu

komórkowego na podstawie analizy

zawartości DNA…

Fluorescence Intensity

PI - Fluorescence

#

o

f

E

v

e

n

ts

G

0

– G

1

G

2

- M

S

Apoptotic cells

Normal G

1

/G

0

cells

#

o

f

E

v

e

n

ts

26

• metody mikroskopowe (zliczanie,

wizualizacja stadiów podziału),

• znakowanie DNA (barwniki

fluorescencyjne, 3H-TdR, BrdU),

• znakowanie antygenów związanych z

proliferacją (PCNA, cykliny),

• „dividing cells’ tracing”,

Metody stosowane do oceny

proliferacji komórek:

27

• jedyna obecnie dostępna cytometryczna metoda

wieloparametrowej oceny proliferacji komórek i
ich fenotypu (CFSE),

• pozwala na analizę parametrów podziału

nieuchwytnych dla innych technik,

• długotrwałe, przyżyciowe znakowanie komórek,
• nietoksyczność (brak interferencji z

czynnościami życiowymi komórek i
mechanizmami podziału),

• proporcjonalny spadek zawartości znacznika po

każdym podziale,

• dostępne barwniki: CFSE,

dividing cells’ tracing

28

• Analiza

bezpośrednia :

• liczba cykli

podziałowych,

• liczba komórek w

kolejnych pokoleniach,

• fenotyp dzielących się

komórek;

• Analiza pośrednia

(obliczenia):

• charakterystyczna

liczba podziałów,

• czas pojedynczego

cyklu,

• liczba efektywnych

prekursorów,

• czas G

0

G

1

CFSE: carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester

2 1 0

Zasada metody oceny proliferacji z

użyciem cell division tracer (DCT)

29

Metoda DCT umożliwia ocenę proliferacji

limfocytów o określonym fenotypie

30

Bez stymulacji

Stymulacja

3 dzień

5 dzień

7 dzień

Metoda DCT umożliwia badanie kinetyki

proliferacji komórek

31

Fenotypowanie powierzchni komórek

dzielących się – stymulowanie

konkanawaliną A

32

III. Patofizjologia komórki -

- apoptoza

33

34

Początki apoptozy

Po raz pierwszy opisana w 1972r:

Apoptosis: a basic biological phenomenon with

wide ranging implications in tissue kinetics.

(Br.J.Cancer 1972 26:239)

Obecnie: programowana
śmierć komórki

35

Długość życia komórki

W organizmie znajduje się około 210 typów

komórek.

NARODZINY

RÓŻNICOWANIE

FUNKCJA

ŚMIERĆ

Neutrofile:

- krążące: 6 – 7 godzin,
- w tkance: 4 dni

Czerwone krwinki:

- 120 dni

36

Apoptoza a nekroza

NEKROZA

–

bierny, kataboliczny proces degeneracyjny;

–konsekwencja działania na komórkę czynników
uszkadzających jej funkcję w sposób nieodwracalny;

–proces niespecyficzny, którego obraz zależy od

rodzaju uwolnionych enzymów;

–powstałe produkty rozpadu komórki wywołują

odpowiedź

komórek należących do układu odpornościowego i

fagocytozę

prowadzącą do usuwania pozostałości martwych

komórek.

APOPTOZA

- proces czynny, często związany z aktywacją genów;

– szereg specyficznych zmian morfologicznych i
biochemicznych

37

Liza komórki

Tworzenie się pęcherzyków przez

otaczanie błoną komórkową

fragmentującej cytoplazmy

(ang. blebbing)

Powstawanie ciałek

apoptotycznych przez odrywanie

się pęcherzyków od komórki

macierzystej

Pęcznienie cytoplazmy i

mitochondriów,

Pęcznienie i dezintegracja

organelli komórkowych

Obkurczanie się cytoplazmy i

kondensacja chromatyny

Agregacja chromatyny przy błonie

jądrowej,

Fragmentacja cytoplazmy i

segregacja organelli komórkowych

Utrata integralności błony

komórkowej

Zmiana symetrii błony komórkowej

przy zachowaniu jej integralności

Grupy sąsiadujących

komórek

Pojedyncze komórki

NEKROZA

APOPTOZA

ZMIANY MORFOLOGICZNE

38

Proces pasywny,

niezależny od ATP,

przebiega również w 4

0

C

Aktywny proces zależny od ATP,

Nie przebiega w 4

0

C

Cięcie DNA w miejscach

przypadkowych

Cięcie DNA na mono i

oligonukleosomy

Proces przypadkowy i

nieuporządkowany przez

kaskady specyficznych

enzymów

Aktywacja kinaz białkowych i

fosfataz,

Wypływ cytochromu c i AIF z

mitochondriów

Zaburzenia funkcji

transporterów,

kanałów jonowych

Translokacja fosfatydyloseryny do

wewnętrznej warstwy błony

komórkowej

NEKROZA

APOPTOZA

ZMIANY BIOCHEMICZNE

39

Fagocytoza przez

makrofagi

Dotyka całych grup

komórek w tkance

Odczyn zapalny

Brak odpowiedzi zapalnej

Wywołana przede

wszystkim przez czynniki

patogenne: wirusy

wywołujące lizę komórki,

hipotermia, hipoksja,

ischemnia, trucizny

metaboliczne

Indukowana przez:

1. Zmianę fizjologiczną (spadek

poziomu czynników

troficznych i wzrostowych,

zmiany w dopływie hormonów

2. Działanie toksyn (zewnętrznych

czynników uszkadzających,

toksyn komórkowych np. ROS)

NEKROZA

APOPTOZA

W pojedynczych komórkach

rozsianych w tkance

prawidłowej

Fagocytoza przez rezydujące

komórki żerne (układ nerwowy –

mirkoglej)

oraz wędrujące makrofagi

ODPOWIEDŹ TKANKOWA

40

Ścieżki prowadzące do apoptozy

1. Z wykorzystaniem
receptorów śmierci
2. Mitochondrialna

Elementem obu ścieżek

aktywacja

KASPAZY 3

41

Ścieżka wykorzystująca receptory

śmierci

CD95 i TNFR1

1.Związanie przez CD95

ligandu (CD95L) powoduje

tworzenie kompleksu
pośredniczącego w

przekazywaniu sygnału

prowadzącego do apoptozy

2.

FADD

pośredniczy w

wiązaniu

kaspazy 8

42

Ścieżka mitochondrialna

1. Uszkodzenia DNA i

sygnały wewnątrzkomórkowe;

2.

Końcowym etapem jest

formacja

APOPTOSOMU:

- cytochrom c,

- Apaf-1

,

-

prokaspaza 9.

43

Kaspazy

są kluczowymi enzymami w

apoptozie

Proteazy cysteinowe, dzielone na:

- kaspazy inicjatorowe (8, 9, 10, 12)

(od momentu aktywacji kaspazy następuje ciecie i aktywacja

kolejnych kaspaz w kasadzie enzymatycznej);

- kaspazy efektorowe (3, 6, 7)

(tną białka jądrowe i szkieletu komórkowego)

44

Aktywacja kaspaz prowadzi do

utworzenia apoptosomu

45

Rodzina białek Bcl

Pro:

Bax

Bik

Bad

Bid

Bim

Smac/Diabl

o

PTEN

PP2

p53

Anty:

Rodzina
Bcl:
Bcl-2
Bcl-X

IAP

Akt

Około 12 różnych białek, które zapewniają zachowanie struktury
mitochondrium,
zapobiegają uwalnianiu cytochromu c i blokują aktywację kaspazy 9

Możliwe mechanizmy działania białek Bcl:

-tworzenie porów w błonie mitochondrium i oddziaływanie z białkami
mitochondrium
-heterodimeryzacja białek
-bezpośrednia regulacja kaspaz
-oligomeryzacja – tworzenie selektywnych kanałów jonowych

46

Faza indukcji apoptozy

FAS
(CD95)

FAS-L

FADD

PROKASPAZA 8

KASPAZA 8 (FLICE)

BID

Cytochrom C

Mitochondrium

JMW ‘2004

KASPAZA 3

47

Znaczenie apoptozy

1. Rozwój i morfogeneza:

-

utrata ogona przez kijankę

- tworzenie organów płciowych
- soczewka oka
- wczesny etap rozwoju układu

nerwowego (około 50% neuronów ginie)

- tworzenie palców stóp i rąk

2. Homeostaza w organizmie

48

Fizjologiczne „zastosowania” apoptozy

• Usuwanie komórek „nadmiarowych” lub uszkodzonych

bez wylania skladników cytoplazmy do otoczenia

• Embriogeneza

• Rozwój układu nerwowego ( optymalizacja sieci neuronów)

• Rozwój kończyn (usuwanie błon pławnych)

• Rozwój układu moczo-płciowego

• Odpowiedź immunologiczna

• Usuwanie komórek zainfekowanych przez wirusy

• Usuwanie komórek transformowanych nowotworowo

• Apoptoza limfocytów T zależna od aktywacji (AICD)

• Eliminacja komórek efektorowych po usunięciu antygenu

• Wymiana („obrót”) komórek w dojrzałych tkankach

• Usuwanie „starych”, „zużytych” komórek

49

Patologiczny

nadmiar

apoptozy

• AIDS (apoptoza limfocytów CD4+)

• Choroby neurodegeneracyjne (apoptoza neuronów)

• Choroba Alzheimera
• Choroba Parkinsona
• Stwardnienie boczne zanikowe
• Retinitis pigmentosa
• Padaczka

• Choroby infekcyjne

• Zapalenie płuc wywołane P. aeruginosa (apoptoza nabłonków)
• Zapalenia jelit (apoptoza nabłonków)

• Choroby hematologiczne (apoptoza prekursorów szpikowych)

• Anemia aplastyczna
• Zespół mielodysplastyczny
• Niedobór dehydrogenazy glukozo-6-fosforanu

• Uszkodzenia tkanek

• Zawał serca
• Udar mózgu
• Choroba niedokrwienna nerek

50

Patologiczne

zahamowanie

apoptozy

• Nowotwory

• Rak okrężnicy

• Glejak, neuroblastoma

• Rak prostaty

• Hepatoma

• Białaczki (zwłaszcza B-CLL) i chłoniaki

• Choroby autoimmunizacyjne

• Myastenia gravis  obniżona ekspresja FAS na

tymocytach

• Toczeń układowy  podwyższona ekspresja bcl-2 w

limfocytach T

• Choroby zapalne

• Dychawica oskrzelowa  apoptoza EOZYNOFILÓW w oskrzelach

• Infekcje wirusowe

• Adenowirusy (rola w kancerogenezie?)
• Bakulowirusy

51

Zaburzenia apoptozy w komórkach

nowotworowych

• Nadekspresja Bcl-2 (mutacja, translokacja)
• redukcja normalnie przebiegającej apoptozy
• redukcja apoptozy pod wpływem uszkodzeń

Leki przeciwnowotworowe powodują apoptozę

zmienionych chorobowo
komórek

Carcinogenesis 2000

Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore

52

Zaburzenia apoptozy zaktywowanych

limfocytów T może prowadzić do procesów

chorobowych

53

Zaburzenia apoptozy w komórkach

nerwowych osób z chorobą

Alzheimer’a

54

HIV

Infekcja wirusem HIV związana jest z postępującym ubytkiem

ilości limfocytów CD4, a w konsekwencji zaburzeniami odporności.

55

Metody badania apoptozy

56

Apoptoza – fragmentacja DNA

57

Pomiar fragmentacji DNA

58

Metody cytometryczne stosowane do

oceny apoptozy komórek

• zmiana struktury powierzchniowej – Aneksyna V,
• zmiana potencjału mitochondriów – JC-1,
• pomiar ilości DNA – ocena fazy sub-G1.

59

Wykrywanie apoptozy – utrata symetrii

błony komórkowej

• błona komórkowa jest

asymetryczna,

• fosfatydyloseryna (PS)

występuje w

wewnętrznej

(cytoplazmatycznej)

warstwie błony,

• utrzymanie asymetrii

błony wymaga energii

(ATP) i aktywności

enzymów (flipaz),

• w komórkach

apoptotycznych PS

migruje na zewnątrz

błony

• PS wiąże białka z grupy

ANEKSYN

60

Badanie mitochondrialnego potencjału

błonowego



Utrata mitochondrialnego potencjału błonowego (ΔΨ) jest

pierwszym etapem wewnątrzpochodnej drogi apoptozy.



JC-1, lipofilowy, kationowy barwnik fluorescencyjny łatwo

penetruje przez błony komórkowe.



Monomery JC-1 (emitujące zieloną fluorescencję) przy

wysokim ΔΨ wchodzą do matrix mitochondrium i przy

odpowiednim stężeniu tworzą agregaty JC-1 – emitujące

czerwoną fluorescencję.



Utrata ΔΨ utrudnia akumulację JC-1 i agregaty nie mogą być

tworzone. Efektem takich właściwości JC-1 jest fakt, że

komórki apoptotyczne wykazują tylko fluorescencję

monomerów (zieloną), rozrzuconych po cytoplazmie.

61

From Per O.G.
Arkhammar,
BioImage A/S,
2000

Akumulacja JC-1

w

mitochondriach

62

1. Ocena proliferacji limfocytów T z krwi

obwodowej – pod wpływem stymulacji z
jednoczesną oceną fenotypu dzielących
się komórek.

2. Ocena podatności na apoptozę komórek

nowotworowych linii MOLT4 – mierzona
oceną spadku potencjału
mitochondrialnego.

Co będzie przedstawione na

ćwiczeniach?

63

Omówienie wyników

64

Badanie proliferacji

limfocytów T krwi obwodowej

znakowanych CFSE,

hodowanych przez 72 godziny,

bez stymulatora i ze stymulatorem.

Barwienie przeciwciałami anty-

CD25

PE i anty- CD4 RPE Cy5

po 3 dniach.

3 dzień

3 dzień

Omówienie wyników - proliferacja

65

Badanie proliferacji

limfocytów T krwi obwodowej

znakowanych CFSE,

hodowanych przez 4 dni,

bez stymulatora i ze stymulatorem.

Barwienie przeciwciałami anty-

CD25

PE i anty- CD4 RPE Cy5

po 4 dniach.

4 dzień

4 dzień

Omówienie wyników - proliferacja

66

Badanie proliferacji

limfocytów T krwi obwodowej

znakowanych CFSE,

hodowanych przez 6 dni,

bez stymulatora i ze stymulatorem.

Barwienie przeciwciałami anty-

CD25

PE i anty- CD4 RPE Cy5

po 6 dniach.

6 dzień

6 dzień

Omówienie wyników - proliferacja

67

Badanie proliferacji

limfocytów T krwi obwodowej

znakowanych CFSE,

hodowanych przez 7 dni,

bez stymulatora i ze stymulatorem.

Barwienie przeciwciałami anty-

CD25

PE i anty- CD4 RPE Cy5

po 7 dniach.

7 dzień

7 dzień

Omówienie wyników - proliferacja

68

Detekcja JC-1 odbywa się
na dwóch kanałach –

zielonym

dla

monomerów, i

czerwonym

– dla

agregatów.

Apoptoza (depolaryzacja
mitochondriów) jest
reprezentowana jako
przesunięcie w dół i/lub w
prawo na wykresie.

Reprezentatywna
analiza
mitochondrialnego
potencjału
błonowego JC-1 w
komórkach Jurkat
inkubowanych z
kamptotecyną
(inhibitor
topoizomerazy).

Analiza potencjału mitochondrialnego

metodą cytometrii przepływowej

69

Omówienie wyników - apoptoza

70