CYTOMETRIA

CYTOMETRIA

PRZEPŁYWOWA W

PRZEPŁYWOWA W

DIAGNOSTYCE

DIAGNOSTYCE

NIEDOBORÓW

NIEDOBORÓW

ODPORNOŚCI

ODPORNOŚCI

Cytometria

Analiza wieloparametrowa jednej komórki w

aparacie, w momencie gdy ruch komórek w cieczy

jest uporządkowany.

- komórki się nie zlepią, będą oddzielne w słupie

- na pojedynczą komórkę pada laser w komorze

pomiarowej

FSC (forward scatter)- pomiar światła

rozproszonego, mierzonego w przedłużeniu

promienia lasera, światło pada prawie pod katem

0⁰, charakteryzuje wielkość komórki

SSC (side scatter)- pomiar światła

rozproszonego, mierzone pod kątem 90⁰, pozwala

na analizę ziarnistości komórki

FL- ocena intensywności fluorescencji (FL1,

FL2…)

PRZEPŁYW KOMÓREK

PRZEPŁYW KOMÓREK

tu
nakładam
y
próbkę

fluorescencja

fluorescencja

promień lasera

promień lasera

ciecz osłaniająca

Purdue University Cytometry Laboratories

DETEKTORY FLUORESCENCJI

detektor boczny

laser

Detektor
przedni

SS

90 Degree Scatter

0 200

400

600

800

1000

F

o

rw

a

rd

S

ca

tt

e

r

0

2

0

0

4

0

0

6

0

0

8

0

0

1

0

0

0

LIMFOCYTY

MONOCYTY

NEUTROFILE

FS

Schematyczny rozkład

leukocytów na cytogramie

FFC/SSC

FL1 (-izotiocyjanian
fluoresceiny FITC)

FL2 (-
fiko
erytryn
a PE)

Dwie populacje limfocytów :

CD3+CD4+ oraz CD3- CD4+

Dwie populacje limfocytów :

CD3+CD4+ oraz CD3- CD4+

LIMFOCYTY CD3+CD4+

LIMFOCYTY CD3+CD4+

LIMFOCYTY CD3- CD4+

LIMFOCYTY CD3- CD4+

„Multi parametric investigation of immunem system during major surgery by LSC”

• FUNKCJONALNE



ładunek powierzchniowy,

ładunek powierzchniowy,



ekspresja receptorów powierzchniowych,

ekspresja receptorów powierzchniowych,



integralność błony (żywotność),

integralność błony (żywotność),



aktywność endocytarna,

aktywność endocytarna,



organizacja cytoszkieletu,

organizacja cytoszkieletu,



aktywność enzymów,

aktywność enzymów,

• FUNKCJONALNE

 ładunek powierzchniowy,

ładunek powierzchniowy,

 ekspresja receptorów powierzchniowych,

ekspresja receptorów powierzchniowych,

 integralność błony (żywotność),

integralność błony (żywotność),

 aktywność endocytarna,

aktywność endocytarna,

 organizacja cytoszkieletu,

organizacja cytoszkieletu,

 aktywność enzymów,

aktywność enzymów,

•

STRUKTURALNE

STRUKTURALNE



rozmiar,

rozmiar,



kształt,

kształt,



cytoplazmatyczna ziarnistość,

cytoplazmatyczna ziarnistość,



zawartość barwnika np.: hemoglobina, barwniki fotosyntetyczne,

zawartość barwnika np.: hemoglobina, barwniki fotosyntetyczne,

porfiryny,

porfiryny,



aminokwasy fluoryzujące w białkach np.:tryptofan, tyrozyna,

aminokwasy fluoryzujące w białkach np.:tryptofan, tyrozyna,



zawartość DNA, RNA, wszystkich białek, lipidów, cukrów

zawartość DNA, RNA, wszystkich białek, lipidów, cukrów

powierzchniowych, antygenów,

powierzchniowych, antygenów,

•

STRUKTURALNE

STRUKTURALNE

 rozmiar,

rozmiar,

 kształt,

kształt,

 cytoplazmatyczna ziarnistość,

cytoplazmatyczna ziarnistość,

 zawartość barwnika np.: hemoglobina, barwniki fotosyntetyczne,

zawartość barwnika np.: hemoglobina, barwniki fotosyntetyczne,

porfiryny,

porfiryny,

 aminokwasy fluoryzujące w białkach np.:tryptofan, tyrozyna,

aminokwasy fluoryzujące w białkach np.:tryptofan, tyrozyna,

 zawartość DNA, RNA, wszystkich białek, lipidów, cukrów

zawartość DNA, RNA, wszystkich białek, lipidów, cukrów

powierzchniowych, antygenów,

powierzchniowych, antygenów,

Mierzone parametry za pomocą cytometrii

Zalety cytometrii:

-szybki, obiektywny i zautomatyzowany pomiar

pojedynczych komórek w dużych populacjach

komórkowych, z dużą powtarzalnością

-wykrywanie śladowych subpopulacji

-równoległa ocena kilku parametrów

-ilościowa i jakościowa ocena stanu układu

immunologicznego, poszczególnych populacji

Wady:

-niemożność korelacji wyników pomiarów

fluorescencji z morfologią komórek

-technika przygotowania materiału do badań,

wymagająca izolacji z tkanki pojedynczych komórek

-wysoki koszt badań

OCENA FENOTYPÓW KOMÓREK UKŁADU

ODPORNOŚCIOWEGO

- monitorowanie chorób autoimmunizacyjnych , leczenia

immunosupresyjnego, po przeszczepach, niedoborów odporności,

głównie przez ocenę struktur powierzchniowych komórek

(łatwiejsze, dzięki rozpowszechnieniu szerokiego spektrum mAb),

rzadziej antygenów wewnątrzkomórkowych

IMMUNOFENOTYPOWANIE LIMFOCYTÓW

niezbędne w monitorowaniu:

-kondycji immunologicznej chorych z nabytym niedoborem

odporności (HIV pozytywnych): ocena subpopulacji limfocytów

CD4 i CD8 oraz współczynnika CD4/CD8 np.:

44%/27% -zdrowy (1,63)

7,7%/54%- pacjent z pełnoobjawowym niedoborem

odporności (0,14)

-we wrodzonych zaburzeniach odpowiedzi humoralnej, związanych

z niedoborem limfocytów B: określa się liczbę komórek

cechujących się występowaniem markerów CD19/CD20, będących

wykładnikiem tej populacji

Badania czynnościowe komórek układu odpornościowego
-liczba komórek nie zawsze musi być wykładnikiem
zaburzeń zachodzących w organizmie

-test proliferacji limfocytów, służący do oceny
odpowiedzi proliferacyjnej, nieprawidłowości której
widoczne są w niektórych niedoborach odporności:
ocena ekspresjiCD69 (Ag ki-67), pojawiającego się jako
pierwszy na komórkach proliferujących (alternatywa dla
met. izotopowej), po pobudzeniu mitogenem (PHA, ConA),
Ag (Ab anty-CD3)

-ocena zdolności do fagocytozy, wybuchu tlenowego i
fagocytozy (BURSTTest, FAGOBURST), stosowana w
częstych nawracających infekcjach bakteryjnych: pozwala
określić równolegle aktywność neutrofili oraz monocytów.
Indukcja E. coli – wskazuje na zdolności żerne a LPS czy
fMLP jest wykładnikiem w kontekście wybuchu tlenowego

DZIĘKUJĘ ZA UWAGĘ!