Hybrydyzacja

kolonii

...

Cel: znalezienie klonu który zawiera transkrypt

w dużych ilościach

Wybrano przypadkowy klon, wyizolowano DNA.

• 

Po wycięciu insertu otrzymano sondę, którą wy-

• 

korzystano do przeszukiwania biblioteki klonów.

Wynik: Sonda została związana specyficznie tylko w 

jednym miejscu, tam skąd pobrano DNA. Trafiono na 

klon, który nie jest nadreprezentowany. Ścieżka ślepa.

Próba B: Wybrano kolejny przypadkowy klon. Od-

tworzono procesy.

Wynik: Po hybrydyzacji pojawia się wiele klonów. 

Oznacza to, że trafiono na klon, który jest obecny w 

wielu klonach innych. Mamy do czynienia z nadrepre-

zentowanym DNA.

znalezienie klonu, gdy nie dysponujemy informa-

• 

cją DNA ani RNA, ale posiadamy produkt białkowy.

Dla danego produktu białkowego można odtworzyć 

DNA, znając układ aminokwasów

najlepiej wybrać taką sekwencję aminokwasową, 

• 

której będzie odpowiadało najmniej kodonów. (np. Met 

– 1 kodon, Trp – 1 kodon)

Sonda musi być jak najbardziej zdegenerowana, tak 

by zawierała jak najmniej różnych sekwencji.

Sonda jest znakowana przy pomocy kinazy P4. Na-

stępuje przeszukanie biblioteki – Ale czy jest to wiąza-

nie specyficzne?

Jednoniciowa

sonda DNA

Hybrydyzacja

Peroksydaza chrzanowa

+ glutaraldehyd

HP

HP

HP

HP HP

HP

Chemiluminescencja

Dodanie luminolu

HP HP

Poszukiwanie  cDNA  klonu,  który  reprezentuje 

• 

transkrypt, występujący w komórkach w dużym nad-

miarze.  Transkrypt  występuje  w  specjalnym  klonie, 

który jest nadreprezetowany.

Np. komórki produkujące insulinę lub gliadyna

A

B

Biblioteka klonów

Sonda A

Sonda A

Sonda B

Sonda B

Hybrydyzacja

kolonii

Otrzymujemy trzy klasy (dwa sygnały słabe, trzeci 

mocny). Trzeci może być specyficzny. Zatem wrócono 

do  sekwencji  białka;  odnaleziono  inną,  również  zde-

generowaną. Powtórzono doświadczenie z inną sondą. 

Jeśli wynik znów pokaże ten sam klon, duża szansa, że 

klon zawiera szukaną przez nas sekwencję.

W różnych gatunkach wykorzystywane są różne 

• 

kodony. Istnieją tablice podające informacje na ten te-

mat. Dzeki temu można lepiej przewidywać sekwencje 

nukleotydów.

Hybrydyzacja  heterologiczna  pomędzy  gatun-

• 

kami polega na tym, iż tą samą sondąprzeszukujemy 

biblioteki klonów innych gatunków, by uzyskać infor-

macje,  jak  podobne  są  poszczególne  geny  względem 

siebie.

Wykład 5

16.03

Peroksydaza nie jest substratem, to białko. Zatem jak 

połączyć to białko z DNA? – Poprzez reakcję siecio-

wania aldehydem glutarowym. W ten sposób powstaje 

sonda,  zaznakowana  peroksydazą,  która  specyficznie 

wiąże się z DNA klonu.
Jak przeprowadzić detekcję? Jak wykryć te miejsca, w

których peroksydaza jest zlokalizowana?

Wykorzystuje  się  zjawisko  chemiluminescencji. 

Polega ona na tym, iż podczas reakcji chemicznej emi-

towana jest energia w postaci świetlnej. Substratem dla 

peroksydazy jest luminol.

Przykłady  technik  hybrydyzacyjnych  do  poszuki-

wania klonów

Hybrydyzacja  heterologiczna  w  obrębie  gatun-

• 

ku ma na celu zbadanie podobieństw w obrębie rodzin 

tych samych białek.

Szukamy ostatniej sytuacji...

Mamy sondę, która tylko częsciowo hybrydyzuje z 

sekwencją docelową. Podobieństwo białek należących 

do rodziny nigdy nie jest 100%.

Te same aminokwasy – DNA może się różnić. Do-

świadczenia te doprowadziły do wielu odkryć rodzin, 

np. kinaz, białek homeotycznych.

Immunoscreening

Przeszukiwanie za pomocą przeciwciał:

przypadek w którym nie dysponujemy informa-

• 

cją na temat sekwencji DNA, czy białek. W tym celu 

musimy  dysponować  przeciwciałami  do  określonych 

białek oraz biblioteką ekspresyjną, tzn. taką, w której 

klony podlegają ekspresji.
W jaki sposób otrzymujemy bibliotekę ekspresyjną?

Potrzebujemy  wektory,  które  posiadają  promotor 

aktywny  w  komórce  bakteryjnej.  Pod  jego  kontrolą 

znajdują się inserty. Otrzymuje się cDNA. Następnie 

biblioteka ta jest ligowana z wektorem ekspresyjnym. 

Oczywiście mamy przeróżne fragmenty DNA, ale nie-

które cDNA pod kontrolą promotora bakteryjnego ule-

gają  ekspresji  takiej,  że  dają  produkt  polipeptydowy. 

Istotą znalezienia sekwencji kodującej jest odnalezie-

nie klonu, w którym ta ekspresja zachodzi

Ligacja do wektora

Transformacja

AAAAA

TTTTT

Dwuniciowe DNA

ends, ligate

cDNA

klony cDNA

klon gliadynowy

Jedyna różnica między biblioteką eksresyjną, a zwy-

kłą jest taka, że wektor zawiera promotor.

Białko A – zaznakowane izotopem jodu, pochodze-

nie bakteryjne, bardzo silnie wiąże immunoglobuliny.

Charakterystyka fagemidu pBlueScript SK (+)

Fagemid – wektor, który zawiera fragmenty

i faga i plazmidu.

Immunoscreening

Kolonie

Membrana

Liza komórek

(chloroform)

125

I

Fagemidy pBluescript II SK (+/–)

f1 (+) ori

f1 (-) ori

MCS

lacZ'

P lac

ampicylina

pUC ori

Kpn I

Sac I

pBluescript II SK (+/-)

3.0 kb

ampicilin – cecha nadająca oporność na ampicilinę

ori – miejsce z wektora pUC

P lac  –  promotor,  który  jest  pochodną  promotora 

z operonu laktozowego (promotor aktywny w komórce 

bakteryjnej)

lac Z’ – zatem może służyć do selekcji biało niebieskiej

MCS – sekwencja wielokrotnego klonowania (za-

wiera również promotory polimerazy T2 i T3).

SacI, Kpn1 – miejsca restrykcyjne

f1(+) ori – fragment z faga f1 (działanie: możemy 

cały  czas  używać  fagemidu  jako  zwykłego  wektora, 

a  po  zakażeniu  komórki  będzie  wykorzystywana  se-

kwencja f1(+) ori i od tej sekwencji zachodzić będzie 

replikacja, która zakończy kolistą cząsteczkę DNA jed-

ną z nici wektora).

Wersja (-) przy odwróconej sekwencji f1(+) ori.

Funkcje:

klonowanie fragmentów DNA

• 

separacja molekularna

• 

zwielokrotnienie ilości

• 

otrzymanie w postaci pojedynczej nici 

• 

wprowadzenie nadekspresji białka

• 

selekcja biało-niebieska

• 

otrzymanie transkryptów in-vitro

• 

Reakcja pCR

Reakcja  syntezy  DNA.  Cechą  szczególną  jest  to,  że 

syteza (w bardzo szczególnych warunkach) jest powta-

rzana wielokrotnie. Następuje amplifikacja sekwencji 

DNA.

Przed wynalezieniem metody PCR jedynym sposo-

bem otrzymania DNA było klonowanie (wbudowanie 

insertu do wektora i podział komórki).

Do reakcji PCR potrzebujemy:

startery

• 

matrycę DNA

• 

polimerazę

• 

Opis reakcji

Matryca jest denaturowana. Otrzymujemy dwie 

• 

nici,  do  których  są  hydrolizowane  startery.  Starte-

ry określają produkt, jaki będzie po reakcji (Długość 

DNA)

W  PCR  matrycą  jest  pojedyncza  cząsteczka  (nić) 

DNA  dostarczana  przez  denaturację  cząsteczki  DNA 

(w komórce nić dostarczona przy udziale białek, m.in. 

helikaz).

Próbka  jest  następnie  ochłądzana  (temperatura 

znacznie niższa niż przy denaturacji). Wartość tempe-

ratury  jest  określana  przez  charakter  starterów,  które 

łączą się z obiema niciami.

Synteza prowadzona przez termostabilną polime-

• 

razę DNA na obu niciach. Temperatura powyżej 70°C 

(około 74°C)

Krytycznym etapem dla osiągnięcia specyficzności 

jest etap hybrydyzacji.
Skąd bierze sę amplifikacja?

Z powtarzalności cylki (głównie od cyklu 3) mamy 

już matrycę o zdefiniowanej długości.

1 cykl: Produkty, które są syntezowane mają dłu-

gość określoną przez czas syntezy.

2 cykl: Mamy nić matrycową i produkt 1, znów na-

stępuje hybrydyzacja. Powstaą produkty, które maą już 

określoną długość.

Możliwe jest hybyrydyzowanie ze sobą cząsteczek 

pierwonych matrycy, ale preferowane jest hybrydyzo-

wanie ze starterem. Startery są zawsze w nadmiarze, są 

to krótsze fragmenty, ddlatego są one preferowane.

3 cykl: Hybrydyzująze sobą produkty cyklu drugie-

go, które mają już określoną długość  (w ten sposób 

określana jest ostateczna długość produktów PCR).

Zwykle  produkty  PCR  analizujemy  przy  pomocy 

elektroforezy żelowej.
Co wpływa na powodzenie eksperymentu?

Przede  wszystkim  odpowiednie  zaprojektowanie 

starterów.

Startery są projektowane w oparciu o znaną już se-

kwencę, okalają odcinek DNA, który ma być powie-

lany.

Starter przedni – sekwencja nici górnej.

Starter tylni – sekwencja nici dolnej.

Starter musi być specyficzny! Co to znaczy?

W całym genomie starter powinien parować tylko z 

jedną komplementarą sekwencją! Taki wynik jest uzy-

skiwany za pomocą:

odpowiedniej  długości  startera  (szacuje  się,  że 

• 

dla startera o długości 17 pz można znaleźć sekwencję, 

która się powtórzy tylko raz)

konkretne temperatury

• 

Typowy profil temperaturowy

100

90

80

70

60

50

40

Temperatura °

C

1

0

2

3

4

5

6

7

Czas (minuty)

Denaturacja

(1 min)

(2 min)

Należy  zwrócić  uwagę  na  temperaturę  wiązania 

starterów

3 sytuacje hipotetyczne

Ekstremalne wartości pH wpływają na denatura-

• 

cję DNA

Wysoka temperatura powoduje rozerwanie wią-

• 

zań wodorowych i dysocjację DNA. Zatem przy zbyt 

wysokiej temperaturze startery nie hybrydyzują.

Temperatura jest za niska – starter hybrydyzuje 

• 

tylko prezz niektóre reszty. Są to słabe oddziaływania. 

Zależy nam, aby wszystkie reszty hybrydyzowały.

Temperatura topnienia DNA – temperatura, w któ-

rej połowa cząsteczek DNA jest rozdysocjowana (po-

łowowa cząsteczek związana lub nie)

Jak to oszacować?

T

m

= (4 × [G + C ]) + (2 × [A + T ])°C

prawdziwe dla względnie krótkich długości DNA

Temperatura hybrydyzuje – o 1-2°C niższa od tem-

peratury topnienia → konieczność wykorzystania poli-

meraz termostabilnych.

Proces  należy  powtarzać  około  trzydzieści  razy 

(teoretycznie powinno się uzyskać 2

n-2

 cząsteczek).

Produktu może być trochę mniej, ponieważ polime-

raz  traci  swoją  aktywność  podczas  wzrostu  tempera-

tury  oraz  substraty  ulegają  rozkładowi  częściowemu. 

mimo  to  ilość  produktu  DNA  jest  wystarczająca  do 

dalszych badań.