1

3. OZNACZANIE AKTYWNOŚCI WIELOENZYMOWEGO UKŁADU FOTOSYNTETYCZNEGO

Sprawozdanie, wersja elektroniczna

Proszę nie kasować wprowadzonego tekstu i tabel, a jedynie uzupełnić sprawozdanie według podanych wskazówek. Proszę zmodyfikować
nazwę pliku poprzez zastąpienie n - nazwiskami

Oceny - wykonanie:

opis:

Ć

wiczenie wykonane przez (Ciepielska, [e-mail])

I. Analiza zmian stężenia tlenu

Integralną częścią sprawozdania jest załączenie pliku arkusza obliczeniowego (Exel) o nazwie 2009_cw3_n (n- nazwiska
studentów). Nazwa ma być tożsama z nazwą pliku tekstowego.

Arkusz kalkulacyjny powinien zawierać następujące dane:
1)

Zaimportowane w formacie ASCII dane zmian napięcia [mV] w czasie [s]. Należy pamiętać o pozostawieniu w arkuszu
kalkulacyjnym nagłówka pomiaru. Należy sporządzić odpowiednie wykresy i na podstawie prostoliniowych przebiegów
zmian napięcia elektrodowego metodą korelacji liniowej wyliczyć szybkość reakcji w mV s

-1

. Otrzymane wykresy

przekopiować do tego pliku tekstowego.

2)

Należy przeliczyć szybkość reakcji na ilość µmoli O

2

min

-1

mg

-1

chlorofilu. Kolumny przeliczeniowe powinny być

odpowiednio zatytułowane i zawierać lub przeliczać następujące wartości:
- szybkość reakcji w mV s

-1

- objętość naczynka pomiarowego, minimalną (0%) i maksymalną (100%) wartość stężenia tlenu
- ilość O

2

odpowiadającą 1 mV

- szybkość reakcji w O

2

min

-1

- stężenie chlorofilu w zawiesinie chloroplastów, zawartość chlorofilu w naczynku reakcyjnym
- szybkość reakcji w O

2

min

-1

mg

-1

chlorofilu

3)

Wykres hamowania wydzielania tlenu przez DCMU. Otrzymany wykres przekopiować do tego pliku tekstowego.

Tu skopiować, odpowiednio podpisane i opisane wykresy:

Aktywno

ść

PSII

y = 0,0241x - 3,988

0

2

4

6

8

0

200

400

600

czas [s]

n

a

p

i

ę

c

ie

[

m

V

]

Serie1

Serie2

Serie3

dopasowanie

2

Obliczenie ilości tlenu, odpowiadającej 1 mV:
Objętość naczynka

pomiarowego: 3 ml (V)

Stężenie tlenu w mieszaninie reakcyjnej: 0,25 mM. (C

mol

),

Minimalna (0%) wartość stężenia tlenu : 2,472 mV,
Maksymalna (100%) wartość stężenia tlenu: 16,483 mV.

Maksymalna ilość rozpuszczonego tlenu w naczynku pomiarowym to 0,75

µ

mol. (n =c V)

Różnica pomiędzy zmianami napięcia odpowiadającymi maksymalnej i minimalnej wartości stężenia tlenu wynosi 14 mV.

0,75

µ

mol

-

14 mV

x

-

1 mV

x= 0,05

µ

mol.

Obliczenie szybkość wydzielania tlenu [

µµµµ

mol O

2

/min]:

Szybkość reakcji (współczynnik a w równaniu korelacji): 0,0241

mV s

-1

.

0,05

µ

mol

-

1 mV

x

µ

mol

-

0,

0241

mV

x = 1,205 nmola s

-1

= 72,3 nmola min

-1

Obliczenie szybkości reakcji [O

2

min

-1

mg

-1

chlorofilu]:

Stężenie chlorofilu w zawiesinie chloroplastów = 3,36 mg/ml
Objętość dodawanych chloroplastów = 10

µ

l

Obliczenie zawartości chlorofilu w naczynku reakcyjnym:
3,36 mg

-

1 ml

x mg

-

0,010 ml

x= 0,0504mg
0,0504mg : 2 ml = 0,0252 mg/ml

72,3 nmola min

-1

: 0,0504mg = 1434,52n mola min

-1

mg

-1

= 1,435

µ

mola min

-1

mg

-1

Zmiana czasu (s)

100

Zmiana napięcia (mV)

2,2

Szybkość wydzielania tlenu (mV/min)

1,32

Szybkość wydzielania tlenu (µmol O2/min)

0,072

Szybkość reakcji (O

2

*min

-1*

mg

-1

chlorofilu)

1,435

Obj. naczynka (ml)

3

Wartość napięcia dla 0%nasycenia mieszaniny tlenem (mV)

2,472

Wartość napięcia dla 100%nasycenia mieszaniny tlenem (mV)

16,483

Stężenie tlenu w mieszaninie reakcyjnej (mM)

0,25

Stężenie chlorofilu (mg/ml)

3,36

3

Krzywa hamowania wydzielania tlenu przez DCMU

0

20

40

60

80

100

120

0

0,042

0,084

0,126

st

ęż

enie DCMU [

µ

M]

w

y

d

a

jn

o

ś

ć

[

%

]

Serie1

5 µl – dawka DCMU dodawana do naczynka reakcyjnego

Bez DCMU

1 dawka

2 dawka

3 dawka

Zmiana czasu (s)

20

52

50

55

Zmiana napięcia (mV)

0,6

1,1

0,7

0,6

Szybkość wydzielania tlenu (mV/min)

1,8

1,269

0,84

0,655

Szybkość wydzielania tlenu (µmol O2/min)

0,06

0,0879

0,0603

0,027

Szybkość reakcji (O

2

*min

-1*

mg

-1

chlorofilu)

1,19

1,74

1,20

0,54

Stężenie inhibitora, przy którym obserwujemy zahamowanie reakcji o 50% to 0,078 µM

Aktywno

ść

PSII po dodaniu DCMU

y = 0,02x + 2,1911

R

2

= 0,7322

y = 0,0293x + 1,888

R

2

= 0,9663

y = 0,0201x + 2,7928

R

2

= 0,9127

y = 0,009x + 4,6165

R

2

= 0,7988

0

1

2

3

4

5

6

7

0

100

200

300

czas [s]

n

a

p

i

ę

c

ie

[

m

V

]

Serie1

Serie2

Serie3

Serie4

Serie5

dopasowanie

dopasowanie

dopasowanie

dopasowanie

4

Aktywno

ść

PSII po dodaniu kwasu

linolenowego

y = 0,0237x - 0,4526

R

2

= 0,9401

y = 0,0029x + 3,9331

R

2

= 0,4942

0

1

2

3

4

5

6

0

100

200

300

400

czas [s]

n

a

p

i

ę

c

ie

[

m

V

]

Serie1

Serie2

Serie3

dopasowanie

dopasowanie

bez kwasu z kwasem

Zmiana czasu (s)

65

150

Zmiana napięcia (mV)

1,37

0,83

Szybkość wydzielania tlenu (mV/min)

1,26

0,332

Szybkość wydzielania tlenu (µmol O2/min)

0,0711

0,0087

Szybkość reakcji (O

2

*min

-1*

mg

-1

chlorofilu)

1.41

0,173

Pod dodaniu kwasu linolenowego wydajność reakcji spadła do 12%.

5

działanie metyloaminy na ła

ń

cuch fotosyntetyczny

y = -0,0004x + 23,251

R

2

= 0,0007

y = -0,0087x + 22,286

R

2

= 0,8866

0

5

10

15

20

25

30

0

100

200

300

400

czas[s]

n

a

p

i

ę

c

ie

[

m

V

]

Serie1

Serie2

dopasowanie

dopasowanie

Przed dodaniem

Po dodaniu

Zmiana czasu (s)

60

290

Zmiana napięcia (mV)

0,3

3,3

Szybkość pobierania tlenu (mV/min)

0,3

0,683

Szybkość pobierania tlenu (µmol O2/min)

0,0012

0,0261

Szybkość reakcji (O

2

*min

-1*

mg

-1

chlorofilu)

0,024

0,052

Dodanie metyloaminy przyśpieszyło reakcję o 116%.

6

Działanie DBMIB na cały ła

ń

cuch

fotosyntetyczny

y = -0,0216x + 24,417

R

2

= 0,8646

y = 0,0007x + 18,476

R

2

= 0,0069

0

5

10

15

20

25

0

100

200

300

400

czas[s]

n

a

p

i

ę

c

ie

[

m

V

]

Serie1

Serie2

Serie3

dopasowanie

dopasowanie

przed

po dodaniu

Zmiana czasu (s)

100

100

Zmiana napięcia (mV)

2,1

0,2

Szybkość pobierania tlenu (mV/min)

1,26

0,12

Szybkość pobierania tlenu (µmol O2/min)

0,0648

0,00021

Szybkość reakcji (O

2

*min

-1*

mg

-1

chlorofilu)

1,286

0,04167

Po dodaniu DBMIB wydajność reakcji wynosiła zaledwie 3,24%

7

Oznaczanie aktywno

ś

ci PSI

y = -0,0856x + 20,119

R

2

= 0,9976

-2

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0

200

400

czas[s]

n

a

p

i

ę

c

ie

[

m

V

]

Serie1

Serie2

Serie3

dopasowanie

Zmiana czasu (s)

154

Zmiana napięcia (mV)

13,19

Szybkość pobierania tlenu (mV/min)

5,14

Szybkość pobierania tlenu (µmol O2/min)

0,257

Szybkość reakcji (O

2

*min

-1*

mg

-1

chlorofilu)

5,095

8

Do tabeli odpowiednio wpisać wyniki końcowe:

Układ pomiarowy

(fotosystem, donor,

akceptor, inhibitor)

Szybkość reakcji

O

2

min

-1

mg

-1

chlorofilu

% kontroli, stopień hamowania lub stymulacji

Wydzielanie tlenu

1,435

Układ bez DCMU

1,19

100%

1 dawka DCMU

1,74

70,5%

2 dawka DCMU

1,20

46,6%

3 dawka DCMU

0,54

36,4%

Układ przed dodaniem

kwasu linolenowego

1,41

100%

Układ po dodaniu kwasu

linolenowego

0,173

12%

Układ bez metyloaminy

0,024

100%

Układ z metyloaminą

0,052

216%

Układ bez DBMIB

1,286

100%

Układ z DBMIB

0,04167

3,24%

PSI

5,095

Wnioski

(max 2 strony A4)

Na podstawie uzyskanych wyników omówić działanie użytych akceptorów i inhibitorów łańcucha fotosyntetycznego. Należy
odnieść się do danych literaturowych, w szczególności opisać, na ile przeprowadzone badania dostarczają informacji o
funkcjonowaniu układów bioenergetycznych.
Można skorzystać ze stron Internetowych

http://www.life.illinois.edu/govindjee/photoweb/index.html

http://www.hansatech-instruments.com/index.htm

Celem ćwiczenia jest zbadanie aktywności PSI i PSII (łańcuch fotosyntetyczny) u roślin na przykładzie grochu oraz działania
sztucznych akceptorów, donorów elektronów i inhibitorów na aktywność fotoukładów.

Doświadczenie:

•

Izolacja chloroplastów z liści grochu

•

Oznaczanie stężenia chlorofilu

•

Oznaczanie aktywności fotosyntetycznego transportu elektronów( pomiary):

Kontrola- wydzielanie tlenu przez choroplasty

Aktywność PSII po dodaniu DCMU (inhibitora)- pomiar wydzielania tlenu

Aktywność PSII po dodaniu kwasu linolenowego- pomiar wydzielania tlenu

Działanie metyloaminy na cały łańcuch fotosyntetyczny- pomiar pobierania tlenu

Działanie DBMIB na cały łańcuch fotosyntetyczny- pomiar pobierania tlenu

Aktywność PSI

9

Omówienie:

•

W fotoskładzie II ,chlorofil a pobiera elektrony z fotolizy cząsteczki wody dzięki reakcji Hilla. Produktem w tej reakcji
jest tlen, dlatego aktywność PSII można mierzyć na podstawie zmian stężenia tlenu.

•

DCMU to inhibitor PSII, natomiast nie wpływa na aktywność PSI. Działa poprzez blokowanie miejsca wiązania
plastochinionu, jednocześnie przerywając łańcuch transportu elektronów.

•

Kwaś linolenowy to inhibitor PSII. Jego działanie- rozprzęga łańcuch oddechowy, początkowo przyspieszając przepływ
elektronów)

•

Metyloamina rozprzęga fotosyntezę. Substancja ta jest dodawana w układzie z metylowiologenem( sztuczny akceptor
elektronów z PSI) przejmuje elektrony z łańcucha oddechowego i pobiera tlen z otoczenia (reakcja Mehlera)

•

DBMIB to inhibitor całego łańcucha fotosyntetycznego. Powoduje zahamowanie fotosyntezy poprzez wiązanie się z
centrum cytochromu b (oddziałuje z PSII)

•

Aktywność PSI- zmierzona za pomocą zahamowania PSII, dodano TMPD- sztuczny donor elektronów oraz
metylowiologen- sztuczny akceptor elektronów.

Wyniki:

Oznaczenie aktywności PSII:

•

W układzie z DCMU obserwujemy spadek wydzielania tlenu wzrasta z podawanymi kolejnymi porcjami DCMU.
Jednak spadek jest powolny. Dopiero przy stężeniu DCMu w mieszaninie

0,078 wydajność reakcji spadła 50%.

•

W drugim układzie dodawany był kwas tłuszczowy- linolenowy. Dawką, którą zastosowałam było aż 15
µ

l. Spowodowała ona obniżenie wydajności reakcji katalizowanej przez ten fotosystem aż do 12%.

Oznaczenie aktywności całego łańcucha fotosyntetycznego

•

Pierwszy układ badał wpływ metyloaminy.

Dodanie tego związku powoduje wzrost szybkości pobierania

tlenu, który również był wynikiem mojego doświadczenia. Metyloamina przyśpieszyła reakcję aż o
116%

•

W drugim układzie badany był wpływ DBMIB. Związek ten jest na tyle silnym inhibitorem, że dodanie
nawet małej dawki powoduje natychmiastowe zatrzymanie reakcji. W naszym przypadku wydajność
reakcji po jednorazowym dodaniu DBMIB spadła do ok. 3%