Michał Moskal , Biotechnologia IIr

Fotosynteza. Barwniki fotosyntetyczne, fotosystemy, łańcuchy transportu elektronów w błonach chloroplastów

Wprowadzenie

Synteza ATP i redukcja NADP+ w chloroplastach związana jest z absorpcją światła przez

dwa układy barwników - fotosystem I i II. Efektem fotochemicznego wzbudzenia układu

barwników są reakcje oksydacyjno-redukcyjne związane z transportem elektronów przez

kolejne przenośniki chloroplastowego łańcucha transportu elektronów. Układy barwników

fotosystemu I (PS I) i fotosystemu II (PS II) są zbudowane z centrów reakcji i barwników

towarzyszących. W skład centrum reakcji fotosystemu I wchodzą dwie cząsteczki chlorofilu a– P-700, a fotosystemu II dwie cząsteczki chlorofilu P-680. Zaabsorbowane kwanty światła wybijają elektrony z PS II, które są dostarczane przez szereg przenośników do PS I a stamtąd do NADP+. Ciągłym źródłem elektronów dopływających do PS II jest woda

Stosowanie odpowiednich sztucznych akceptorów lub donorów elektronów wraz z

odpowiednimi inhibitorami transportu elektronów pozwala na niezależne badanie aktywności

obydwóch fotosystemów. Np. hamowanie transportu elektronów na poziomie plastochinonu

przez DCMU i dostarczanie elektronów przez układ DCIP + askorbinian na cytochrom f

umożliwia oznaczanie aktywności PS I. Sztucznym akceptorem elektronów z PS I może być MV pozwalający na spektrofotometryczny pomiar szybkości jego redukcji.

Aktywne fotochemicznie chloroplasty izoluje się w izotonicznym środowisku wodnym

o pH 7.4. W czasie homogenizacji liści otrzymuje się kilka klas chloroplastów różniących się

stopniem zachowania integralności strukturalnej. Chloroplasty klasy A (zachowujące zdolność asymilacji CO2) muszą posiadać nienaruszone błony – zewnętrzną i wewnętrzną.

Badanie aktywności fotochemicznej oraz zdolności do fotofosforylacji można

wykonywać na chloroplastach, które mają częściowo rozerwane błony

Podczas zajęć zapoznaliśmy się z budową chloroplastów i reakcjami w nich zachodzących. Poznaliśmy proces fotosyntezy , zwłaszcza fazy jasnej , dzięki której powstaje NADP+ oraz ATP potrzebne w kolejnej fazie- fazie ciemnej , w której powstają heksozy.

Nasza część doświadczalna obejmowała izolacje chloroplastów oraz pomiar aktywności fotochemicznej PS II metodą spektrofotometryczną

Wykonanie doświadczenia

Na samym początku zaczęliśmy od izolacji chloroplastów z sałaty, przechowywanej uprzednio przez 24 godz. w ciemności w celu usunięcia skrobi. 20 g częściowo pociętych liści homogenizowaliśmy w schłodzonym moździerzu z 50 cm3 roztworu 0.3 M sacharozy przygotowanej w 50 mM buforze (K) fosforanowym, pH 7.4. W celu łatwiejszego roztarcia liści moździerz wyłożyliśmy gęstą nylonową siatką. Uzyskany homogenat przesączyliśmy przez potrójnie złożoną gazę lub nylon, a następnię wirowaliśmy przez 2 minuty przy 300 x g .Otrzymany supernantant zlaliśmy i poddaliśmy ponownemu wirowaniu przy 2000 x g przez 15 minut. Uzyskany osad zawierający „surową” frakcję chloroplastów dokładnie rozprowadziliśmy pipetą pasterowską w niewielkiej objętości roztworu zawierającego: 0.2 M sacharozę, 50 mM bufor fosforanowy, 10 mM KCl, a następnie w cylinder uzupełniliśmy tym samym roztworem do objętości 20 ml. każda para ćwiczeniowa pobrała po 5 ml klarownej zawiesiny chloroplastów.

Kolejnie wykonywaliśmy pomiar aktywności fotochmicznej PS II metodą spektrofotometryczną. K3[Fe(CN)6] używany jako sztuczny akceptor elektronów pochodzących z PS II. W wyniku naświetlania wyizolowanych chloroplastów żelazicjanek ulega redukcji do żelazocjanku zgodnie z reakcją:

PS II + światło

4 K3[Fe(CN)6] + 4 K+ + 2 H2O ---------------- 4 K4[Fe(CN)6] + 4 H+ + O2

Redukcji żelazicjanku towarzyszy spadek absorbancji mierzonej przy 420 nm. Mierząc

zmianę absorbancji możemy obliczyć ilość mmoli powstałego żelazocjanku w określonej

jednostce czasu, w przeliczeniu na mg chlorofilu lub mg białka chloroplastowego.

Do 3 probówek wirówkowych napipetowaliśmy po 1.5 ml zawiesiny chloroplastów

. W zaciemnionym pomieszczeniu dodaliśmy do każdej próby po 0.5 ml 6 mM K3[Fe(CN)6].

Próbę kontrolną umieściliśmy w całkowitej ciemności, natomiast pozostałe próby naświetlaliśmy rzutnikiem przez 2, 4 minut. W odpowiednim czasie reakcję hamowaliśmy dodając do naświetlanej próby 2 ml 10% TCA. Próbę natychmiast dobrze wytrząsaliśmy i odstawialiśmy do statywu. Po zahamowaniu reakcji w 2 próbie dodaliśmy 2 ml 10% TCA do próby kontrolnej. Wytrącone białka odwirowaliśmy przy 3000 obr/min. przez 10 minut.

W celu dokonania pomiarów ściągnęliśmy ostrożnie po 2 ml nadsączu z nad osadu do suchych probówek i zmierzyć absorbancję każdej próby (l = 420nm) względem wody destylowanej.

Wyniki i obliczenia

minuty	0	2	4
Absorpcja	0,778	0,659	0,575
delta A		0,119	0,203

Obliczenie stężenia zredukowanego K3[Fe(CN)6] przy dwóch minutach naświetlania

Wartość molowego współczynnik absorpcji dla K3[Fe(CN)6]=1040

1040=1M

Delta A= x M

x=$\frac{1M*Delta\ A}{1040}$

przy dwóch minutach delta A=0,119

x=$\frac{1M*0,119}{1040}$= 0,000114423M= 114,42 uM/2min

114,42uM/2min /2= 57,21 uM/1 min

57,21 uM/1 min – 1000ml

x uM - 4ml

x=$\frac{\mathbf{57,21}\mathbf{u}\mathbf{M}\mathbf{/1\ min}\mathbf{*4}\mathbf{\text{ml}}}{\mathbf{1000}\mathbf{\text{ml}}}$=0,2288 uM/4ml/1min

Ilość K4[Fe(CN)6] powstała w ciągu godziny

0,2288 uM/4ml/1min *60min=13,73076923 uM/4ml/1h =13730,76923 nM/4ml/1h

Obliczenie stężenia zredukowanego K3[Fe(CN)6] przy czterech minutach naświetlania

Wartość molowego współczynnik absorpcji dla K3[Fe(CN)6]=1040

1040=1M

Delta A= x M

x=$\frac{1M*Delta\ A}{1040}$

przy czterech minutach delta A=0,203

x=$\frac{\mathbf{1}\mathbf{M}\mathbf{*0,203}}{\mathbf{1040}}$= 0,000195192 M/4min= 195,192 uM/4min

195,192 uM/4min /4=48,798 uM/1 min

48,798 uM/1 min – 1000ml

x uM - 4ml

x=$\frac{48,798\mathbf{\ uM/1\ min}\mathbf{*4}\mathbf{\text{ml}}}{\mathbf{1000}\mathbf{\text{ml}}}$=0,195192308 uM/4ml/1min

Ilość K4[Fe(CN)6] powstała w ciągu godziny

0,195192308 uM/4ml/1min *60min= 11,71153846 uM/4ml/1h = 11711,53846 nM/4ml/1h

Wnioski

Dzięki stosowaniu odpowiednich sztucznych akceptorów lub donorów elektronów wraz z

odpowiednimi inhibitorami transportu elektronów możemy badać aktywność obydwóch fotosystemów. W naszym doświadczeniu stosowaliśmy K3[Fe(CN)6] jako sztuczny akceptor elektronów i dzięki temu mierzyliśmy aktywność fotosystemu II. Z uzyskanych wyników możemy wywnioskować ,że przy dłuższym naświetlaniu dużo mniejsza ilość K3[Fe(CN)6] zostało zredukowane. Przy naświetlaniu przez dwie minuty w naszych warunkach doświadczenia, obliczyliśmy że w ciągu 1 godziny powstanie 13730,76923 nM K4[Fe(CN)6] zaś przy czterech minutach tylko 11711,53846 nM. Jest to spora różnica, stąd możemy wnioskować , że dłuższy czas naświetlania wpływa negatywnie na redukcję akceptorów elektronów w PS II.