PUŁAPKOWANIE SPINOWE ERP

Cel:

1. Identyfikacja anionorodnika ponadtlenkowego generowanego w wyniku reakcji
utleniania ksantyny tlenem, katalizowanej przez oksydazę ksantynową.
2. Identyfikacja rodników hydroksylowych generowanych w reakcji Fentona.

Wprowadzenie

Ze względu na bardzo krótki czas życia wiele wolnych rodników nie można

zaobserwować przy pomocy bezpośredniej spektroskopii ESR w warunkach stacjonarnych. Ich
detekcja możliwa jest przy pomocy metody pośredniej, po zastosowaniu techniki tzw.
pułapkowania spinowego. W metodzie tej używa się diamagnetycznego nitronu lub związku
nitrozowego jako pułapki spinowej, która w wyniku oddziaływania z reaktywnymi wolnymi
rodnikami tworzy znacznie bardziej stabilne addukty spinowe o charakterze wolnych rodników
nitroksylowych. Reakcję pułapkowania spinowego rodnika

•

R można przedstawić w postaci

następującego schematu:

•

R + ST

→ ST-

•

R

Addukt spinowy wykazuje widmo ESR charakteryzujące się stałymi rozszczepienia

nadsubtelnego zależnymi od rodzaju spułapkowanego rodnika; stanowi to podstawę do
identyfikacji spułapkowanego wolnego rodnika. Wybór odpowiedniej pułapki spinowej opiera
się na następujących kryteriach: 1) łatwość identyfikacji spułapkowanego rodnika na podstawie
widma adduktu spinowego; 2) trwałość adduktu spinowego; 3) brak reaktywności chemicznej
pułapki spinowej w obecności diamagnetycznych utleniaczy i reduktorów; 4) wysokie stałe
szybkości reakcji z pułapkowanymi rodnikami. Teoretycznie, pułapkowanie spinowe może
dostarczać danych zarówno jakościowych jak i ilościowych o tworzeniu się rodnikowych
produktów przejściowych. Jednak w praktyce często okazuje się, że widmo adduktu spinowego
nie jest wystarczająco specyficzne aby jednoznacznie stwierdzić jaki rodnik został
spułapkowany. W dodatku, addukty spinowe mają skończony czas życia i ulegają rozpadowi np.
w wyniku utleniania lub redukcji poprzez kinetykę pierwszorzędową, lub w wyniku
dysproporcjonacji (kinetyka drugiego rzędu). Niestety nie istnieje jedna, uniwersalna pułapka
spinowa, która by się nadawała do pułapkowania wszystkich rodzajów rodników.

Pomimo tych ograniczeń, pułapki spinowe znajdują coraz częstsze zastosowanie w

badaniach biologicznych. Jedną z najważniejszych zalet techniki pułapkowania spinowego jest
możliwość wykonania pomiaru w warunkach fizjologicznych. Pułapkę spinową można
wprowadzić nie tylko do roztworu wodnego, pH 7,4 i przy 37

°C gdzie przebiega interesująca nas

reakcja wolnorodnikowa, ale również do hodowli komórkowej, izolowanych organów lub wręcz
do żywych zwierząt laboratoryjnych. Po określonym czasie mieszanina reakcyjna, homogenaty
tkanek lub płyny, takie jak krew czy mocz, zawierające pułapkę spinową są mierzone przy
pomocy spektroskopii ESR. Większość adduktów spinowych ma wystarczająco długi czas życia,

przynajmniej 10

4

- 10

5

razy dłuższy niż wolne rodniki z których się wywodzą. W układach

biologicznych pułapki spinowe stosowane są w stosunkowo wysokich stężeniach (10-100 mM w
przypadku układów pozaustrojowych lub 0,5 mmola DMPO/kg wagi ciała zwierzęcia), co jest
możliwe ze względu na niską toksyczność pułapek spinowych.
Najczęściej używanymi pułapkami spinowymi w układach biochemicznych i
biologicznych są:
1) 2-metylo-2-nitrozopropan, MNP
2)

α-fenylo-N-t-butylonitron, PBN

3) 5,5-dimetylo-1-pyrolino-N-tlenek, DMPO

Oddziaływanie tych pułapek z wolnymi rodnikami prowadzi do wytworzenia

charakterystycznych adduktów spinowych (Rys. 1). Zwykle addukty spinowe tworzone w
reakcjach nitronów (PBN lub DMPO) z wolnymi rodnikami są bardziej stabilne niż te, które
powstają ze związków nitrozowych (MNP).

Rys. 1. Typowa reakcja addycji rodników do pułapki spinowej DMPO.

Nitroksylowe addukty spinowe powstające w wyniku reakcji niskocząsteczkowych

pułapek spinowych z reaktywnymi wolnymi rodnikami, charakteryzują się wyraźnymi sygnałami
ESR przy g ~ 2,004, rozszczepionymi na trzy linie struktury nadsubtelnej o jednakowych
intensywnościach wynikających z oddziaływania niesparowanego elektronu z magnetycznym
jądrem azotu

14

N (I = 1). Stała rozszczepienia nadsubtelnego związana z azotem a

N

zmienia się w

granicach 7-28 G w zależności od tego jaka grupa jest przyłączona do nitroksylu.
Każda z trzech linii jest zwykle rozszczepiona w wyniku oddziaływania z jądrami
pobliskich atomów o niezerowym spinie, przede wszystkim atomów wodoru. Addukty spinowe
MNP charakteryzują się dodatkowym rozszczepieniem nadsubtelnym (supernadsubtelnym)
związanym z oddziaływaniem z jądrami wodoru znajdującymi się w pozycji

α, β i czasami

również

γ cząsteczki MNP. W niektórych przypadkach dodatkowe rozszczepienie związane jest z

oddziaływaniem z jądrami atomów przyłączonego rodnika.

W przypadku adduktów spinowych powstających przy zastosowaniu PBN lub DMPO

jako pułapek, do identyfikacji spułapkowanego wolnego rodnika służy przede wszystkim

wielkość stałej rozszczepienia na jądrze wodoru

β. Najważniejsze stałe rozszczepień

nadsubtelnych wybranych adduktów spinowych zamieszczone są w Tab. 1.

Tab. 1. Stałe rozszczepienia nadsubtelnego wybranych adduktów spinowych w roztworach wodnych.

Rodnik Pułapka

spinowa

Stałe rozszczepienia struktury nadsubtelnej

O

2

 •

DMPO

PBN

a

N

= 14,3 G; a

H

β

= 14,3 G; a

H

β

=11,7 G; a

H

γ

= 1,25 G

a

N

= 14,28 G; a

H

β

= 2,25 G; a

H

γ

= 1,25 G

•

OH DMPO

PBN

a

N

= 14,9 G; a

H

β

=14,9 G

a

N

= 15,3 G; a

H

β

= 2,8 G

CH

3

C

•

HOH DMPO

PBN
MNP

a

N

= 15,8 G; a

H

β

= 22,8 G

a

N

= 15,94 G; a

H

β

= 3,34 G

a

N

= 15,5 G; a

H

β

= 1,8 G

N

3

•

DMPO

PBN

a

N

= 15,0 G; a

H

β

= 14,3 G; a

N

=3,17 G

a

N

= 15,25 G; a

H

β

= 2,35 G; a

N

= 2,0 G

Stałe szybkości oddziaływania pułapek spinowych z wolnymi rodnikami zależą od typu

pułapki i rodnika. I tak, stała szybkości pułapkowania rodników hydroksylowych przez DMPO
wynosi 3,4

×10

9

M

-1

s

-1

, natomiast w przypadku anionorodnika ponadtlenkowego wynosi zaledwie

10 M

-1

s

-1

, a dla OOH

•

- 6,6

×10

3

M

-1

s

-1

. Aby upewnić się, że obserwowane addukty spinowe

powstają na skutek oddziaływania danego rodnika z pułapką stosuje się dodatkowe testy
diagnostyczne, i tak gdy podejrzewamy, że w reakcji generowany jest anionorodnik
ponadtlenkowy stosujemy dysmutazę ponadtlenkową, która katalizując reakcję dysmutacji O

2

 •

,

powinna zmniejszać obserwowaną intensywność sygnału DMPO_

•

OOH. Z kolei, aby

potwierdzić pułapkowanie rodników hydroksylowych, używa się np. etanolu lub azydku, w
stężeniach takich aby efektywnie konkurowały z DMPO (stała oddziaływania OH

•

z etanolem

wynosi 1,8

×10

9

M

-1

s

-1

, a z N

3



 1,1×10

10

M

-1

s

-1

). Powstają wówczas odpowiednio rodniki

etanolowe lub azydkowe, które reagują z DMPO tworząc charakterystyczne addukty spinowe
DMPO_

•

CHCH

3

OH i DMPO_

•

N

3

.

Wykonanie ćwiczenia:

1. Pułapkowanie anionorodnika ponadtlenkowego generowanego w wyniku reakcji utleniania

ksantyny tlenem, katalizowanej przez oksydazę ksantynową.

Oksydaza ksantynowa generuje anionorodnik ponadtlenkowy w aerobowych reakcjach z

purynami lub aldehydami. Wydajność generacji O

2

 •

zwiększa się ze wzrostem ciśnienia

parcjalnego tlenu i pH, maleje natomiast (chociaż w mniejszym stopniu) przy dużych stężeniach
substratu. W roztworach zrównoważonych z powietrzem przy pH 7.8 15% ze strumienia
elektronów zaangażowanych w reakcji katalizowanej enzymem zostaje zużytych do produkcji

O

2

 •

, natomiast przy pH 10.0 i przy ciśnieniu parcjalnym tlenu 1 atm ten udział wzrasta do

100%.

Odczynniki:
Bufor węglanowy, pH = 10,2 (0,1 M); bufor fosforanowy, pH = 7,4 (0,1 M); DMPO (1 M);
ksantyna (0,2 mM); roztwór oksydazy ksantynowej o podanej aktywności w przeliczeniu na ml
objętości; roztwór dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) o podanej aktywności w przeliczeniu na 1
ml objętości

Oksydaza ksantynowa w stężeniu odpowiadającym jednostce aktywności przekształca w ciągu 1 sekundy 1

µmol

ksantyny do kwasu moczowego przy pH 7.5 i w temperaturze 25

°C. Aktywność oksydazy ksantynowej można

mierzyć spektrofotometrycznie monitorując przekształcenie ksantyny do moczanu przy 295 nm. Zmiana molowego
współczynnika absorpcji wynosi około 11000 M

-1

cm

-1

przy pH 7.8.

Materiały:
Naczynia do przygotowywania próbek, pipety, końcówki, płaska kuweta kwarcowa ESR.

Aparatura:
Spektrometr ERP

a) Wylicz jakie objętości oksydazy ksantynowej powinno się wprowadzać do 0,2 ml próbki aby

w ciągu kilku minut przereagowała cała ksantyna obecna w próbce.

b) Przygotuj 0,2 ml próbki zawierającej
• 50 mM bufor fosforanowy (100 µl)
• 0,1 M DMPO (20 µl)
• 50 µM ksantyny (50 µl)
• wyliczoną objętość oksydazy ksantynowej (w razie potrzeby dopełnić próbkę do 0,2 ml

wodą).

c) Możliwie szybko po dodaniu oksydazy ksantynowej do próbki, wprowadź próbkę do kuwety

pomiarowej i umieśc wypełnioną kuwetę we wnęce rezonansowej spektrometru ESR.

d) Zarejestruj kilka kolejnych widm w czasie inkubacji próbki używając następujących

parametów aparaturowych: czas przemiatania: 20 - 40 s; stała czasowa: 160 - 320 ms;
modulacja amplitudy – 0,5 G, moc mikrofalowa - 10 mW, zakres przemiatania pola 100 G.

e) Przygotuj próbkę jak w p. c) ale zamiast buforu fosforanowego użyj buforu węglanowego.

Zarejestruj kilka kolejnych widm jak w p. e).

f) W celu upewnienia się, że otrzymany addukt spinowy powstaje w wyniku oddziaływania

DMPO z anionorodnikiem ponadtlenkowym przeprowadź test z dysmutazą ponadtlenkową
(SOD). Przygotuj próbkę jak w p. b) lub e) zawierającą dodatkowo odpowiednią ilość SOD

(wylicz na podstawie podanej aktywności ile należy dodać SOD aby efektywnie zmniejszyć
ilość pułapkowanego anionorodnika ponadtlenkowego).

g) Po wprowadzeniu kuwety z próbką do wnęki rezonansowej zarejestruj kilka kolejnych widm

jak w p. e).

h) Zmierz stałe rozszczepień nadsubtelnych i porównaj je z wartościami literaturowymi dla

adduktu spinowego DMPO-

•

OOH. Używając odpowiedniego programu do symulacji widm

wygeneruj widmo DMPO-

•

OOH w oparciu o dane literaturowe i porównaj je z widmami

zebranymi doświadczalnie.

i) Przedyskutuj otrzymane wyniki.

2. Pułapkowanie rodników hydroksylowych generowanych w reakcji Fentona

Rodniki hydroksylowe generowane są w wyniku reakcji Fentona, tzn. utleniania

zredukowanych jonów metali tj. żelazo(II) lub miedź(I) przez nadtlenek wodoru:

H

2

O

2

+ Fe

2+

→ OH



+ OH

•

+ Fe

3+

Odczynniki:
2 mM siarczan żelaza (II) przetrzymywany na lodzie w przeargonowanej wodzie w obecności 3
mM EDTA; 4 mM roztwór H

2

O

2

; 0,1 M roztwór DMPO; etanol; 1 M azydek sodu; woda

redestylowana; 20 mM bufor fosforanowy pH 7,4.

Materiały:
Naczynia do przygotowywania próbek, pipety, końcówki, kwarcowa kuweta ESR.

Aparatura:
Spektrometr ESR

a) Przygotuj 200

µl próbki zawierającej:

„

10 mM bufor fosforanowy

100

µl

„

0,4 mM H

2

O

2

20

µl

„

10 mM DMPO

20

µl

„

woda

50

µl

„

0,2 mM FeSO

4

/EDTA

20

µl

b) Zarejestruj kilka kolejnych widm w czasie inkubacji próbki używając następujących

parametrów aparaturowych: czas przemiatania: 20 - 40 s; stała czasowa: 160 - 320 ms;
modulacja amplitudy - 1 G, moc mikrofalowa - 10 mW, zakres przemiatania pola 100 G).
Sprawdź czy otrzymane widmo adduktu można przypisać do DMPO-

•

OH.

c) Przygotuj próbkę jak poprzednia ale zamiast 50

µl wody wprowadź 30 µl wody i 20 µl

etanolu. Zarejestruj kilka kolejnych widm jak w p. c). Sprawdź czy otrzymane widmo można
przypisać adduktowi DMPO_

•

CHCH

3

OH.

d) Przygotuj próbkę jak poprzednia ale tym razem zamiast 50

µl wody wprowadź 30 µl wody i

20

µl azydku sodu. Zarejestruj kilka kolejnych widm jak w p. c). Sprawdź czy otrzymane

widmo można przypisać adduktowi DMPO-

•

N

3

.

e) Przedyskutuj otrzymane wyniki.

Literatura:

Sarna, T.: Udział tlenu singletowego i wolnych rodników w reakcjach fotouczulanych i
zjawiskach fotodynamicznych. Zagadnienia Biofizyki Współczesnej 14(1): 5-30, 1989.

Bartosz, G.: "Druga twarz tlenu" PWN, Warszawa, 1995.