Fermentacyjne technologie

wytwarzania enzymów i białek

terapeutycznych wysokiej wartości

Porównanie cech preparatów enzymatycznych o niskiej czystości,

produkowanych w dużych ilościach i preparatów o wysokim stopniu

oczyszczenia

Enzymy do celów technologicznych,

wytwarzane w dużych ilościach (bulk)

Enzymy wysokiej czystości

Niewielki koszt jednostkowy, cena

kalkulowana na jednostki masy

Surowe preparaty, często poniżej 10%

białka

Obecność innych enzymów

Preparaty otrzymane w wyniku suszenia

rozpyłowego lub stężone roztwory

Brak stabilizatorów

Niewiele etapów oczyszczania

Próbki dostępne nieodpłatnie

Minimalne zamówienie 1-2 kg

Wysoki

koszt

jednostkowy,

cena

kalkulowana na jednostki aktywności

enzymu

Wysoka czystość, często powyżej 90%

Inne enzymy nieobecne, lub ich obecność

określona ilościowo

Liofilizaty lub zawiesiny w roztworze

siarczanu amonu

Obecne stabilizatory

Wiele etapów oczyszczania, w tym

techniki chromatograficzne

Brak takich próbek

Szeroki

zakres

dostępnych

ilości

(poczynając od bardzo niewielkich)

Produkcja enzymów

Warunki wytwarzania enzymu rekombinowanego

1. Producent bakteryjny– zwykle szczep E. coli zawierający plazmid
kodujący enzym w wektorze z markerem oporności na antybiotyk
i obszar induktorowy.

Fermentacja okresowa z zasilaniem. Wzrost początkowy w pożywce

minimalnej (glukoza + ekstrakt drożdżowy + sole + antybiotyk).
W fazie początkowej wzrostu dodawanie składników odżywczych
w kontrolowany sposób. Źródło azotu – sole amonowe, mocznik.
Po osiągnięciu fazy intensywnego wzrostu – dodanie induktora.

Proces trwający 24 – 48 h w temperaturze 24 – 28 C.

Osiąga się do 50% ogólnej puli białek, z wydajnością 10 – 15 g/L

2. Alternatywni producenci – drożdże (S. cerevisiae, Pichia pastoris),
grzyby – Aspergillus, Fusarium. Gen zintegrowany z chromosomalnym
DNA + efektywny promotor. Pożywki z tanimi źródłami węgla i azotu.
Fermentacja 4 – 8 dni. Enzymy często wydzielane poza komórkę,
co obniża koszty izolacji.

Schemat technologiczny wytwarzania enzymu

Przykłady enzymów stosowanych w diagnostyce

Enzym

Źródło (oryginalne)

Stosowany do oznaczania

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Oksydaza cholesterolowa Nocardia erythropolis

Cholesterol

lub Brevibacterium spp.

Kreatynaza

Pseudomonas spp.

Kreatyna

Kreatyninaza

j.w.

Kreatynina

-galaktozydaza

E. coli

jony Na

+

, ELISA

Oksydaza glukozowa Aspergillus niger

Glukoza

Dehydrogenaza Glc-6-P

Leuconostoc mesenteroides

Glukoza

-glukozydaza

S. cerevisiae

aktywność -amylazy

Oksydaza glicerolo-3-P

Aerococcus viridians

Triacyloglicerole

Heksokinaza

S. cerevisiae

Glukoza

Peroksydaza

Chrzan

Enzym wskaźnikowy,
testy ELISA

Oksydaza pirogronianowa Pediococcus spp.

Pirogronian, transami-

nazy

Oksydaza kwasu
moczowego

Arthrobacter protopharmiae

Kwas moczowy

Ureaza

Klebsiella aerogenes

Mocznik

Białka rekombinowane terapeutyczne

Białko

Leczona choroba

Rok zaakceptowania

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Insulina

Cukrzyca

1982

Ludzki hormon wzrostu

Karzełkowatość

1985

Interferon alfa

Wirusowe zapalenie wątroby

niektóre nowotwory

1986

Szczepionka przeciwko wiru-
sowemu zap. wątroby typu B

Zapobieganie WZW typu B 1986

Aktywator plazminogenu

Zawał serca, zator naczyniowy

1987

Erytropoetyna

Anemia związana z niewydolnoś-

cią nerek

1989

Interferon gamma

Chroniczna granulomatoza 1990

Czynnik stymulujący granulocyty Neutropenia, stany po przesz-

czepach szpiku

1991

Czynnik krzepliwości VIII

Hemofilia A

1992

Interferon beta

Stwardnienie rozsiane

1993

DNaza

Zwłóknienie torbielowate

1994

Glukocerebrozydaza

Choroba Gauchera

1994

Czynnik krzepliwości IX

Choroba Christmasa

1997

Interleukina-10

Zapobieganie trombocytopenii

1997

Białka, które są glikoproteinami nie mogą być wytwarzane
w komórkach bakteryjnych. Komórki grzybów wytwarzają
glikoproteiny o innej budowie niż komórki ssacze.

Pierwsze białko terapeutyczne wytwarzane

przez zwierzę transgeniczne

Atryn, pierwszy lek pochodzący od zmodyfikowanego
genetycznie zwierzęcia został dopuszczony do użytku
w Europie przez Europejską Agencję do spraw Leków
(EMEA) w roku 2006.
Atryn jest uzyskiwany z mleka genetycznie
zmodyfikowanych kóz, które mają gen kodujący
antyrombinę – białko hamujące patologiczne
krzepnięcie krwi.
Niedobór antytrombiny – choroba o podłożu
genetycznym (1 raz na 5 tys. osób).

Jedna koza może zastąpić 90 000 ludzkich dawców krwi.

Naturacja białek z ciał inkluzyjnych

1. Liza komórek; 2. Wydzielenie ciał inkluzyjnych poprzez wirowanie; 3. Rozpuszczenie w
roztworze 6-8 M mocznika (+ mieszania zredukowanego i utlenionego glutationu, w razie
potrzeby); 4. Powolne usuwanie czynnika denaturującego – rozcieńczanie, dializa

Problem tworzenia
agregatów podczas
fałdowania białek

Białka terapeutyczne rekombinowane I generacji

Insulina

Genentech, Eli Lilly

1. Osobna ekspresja łańcuchów A i B w E. coli jako białek fuzyjnych

z syntazą tryptofanową i -galaktozydazą;

2. Rozszczepienie bromocyjanem;
3. Połączenie łańcuchów przez chemiczną reoksydację

Novonordisk

Ekspresja proinsuliny w E. coli, potem usunięcie enzymatyczne

Gensulin (BIOTON)

Konstrukcja genu:

sekwencja kodująca Peptyd B-dipeptyd-Peptyd A-peptyd nośnikowy

Ekspresja w Escherichia coli

Produkt:

białko fuzyjne w ciałach inkluzyjnych

Etapy izolacji wstępnej:

rozbicie komórek, izolacja ciał inkluzyjnych, naturacja

Półprodukt:

prekursor z mostkami disiarczkowymi

Obróbka:

rozcięcie hydrolityczne – oddzielenie peptydu nośnikowego oraz

przecięcie wiązania peptydowego pomiędzy dipeptydem a peptydem A

Oczyszczanie:

chromatografia kolumnowa

Dalsza obróbka:

usunięcie dipeptydu przy użyciu karboksypeptydazy

Produkt:

insulina identyczna z ludzką, o czystości około 95%

Dalsze oczyszczanie:

HPLC, ekstrakcja, krystalizacja

Produkt:

insulina identyczna z ludzką, o czystości ponad 99,9%

Białka terapeutyczne rekombinowane I generacji