transkrypcja chromatyny

problem:

problem:

kompleks pol II RNA

500 kD +

nukleosom:

145 bp

DNA

= 100 kD

rdzeń histonowy = 100 kD

skip:

split:

strip:

Jak to może działać

Jak to może działać

:

:

Skip czy Split czy Strip

?

dysocjacja

histonów?

NO

NO

YES

Thoma 1991 Trends Genet 7: 175

skip ?

Jak by to się mogło

Jak by to się mogło

dziać?

dziać?

Studitsky, Clark, Felsenfeld 1974 Cell 76, 371

przesuwanie się

wzdłuż pętli DNA

tak działa pol III RNA i fagowe pol RNA

(także zależne od ATP kompleksy

remodelujące)

Studitsky i in. 2004 Trends Bioch Sci 29: 127-135

split ?

Jak by to się mogło dziać?

Jak by to się mogło dziać?

w ME transkrybowana chromatyna wydaje się być

„gładka” (o jednakowej grubości), nić jest
grubsza niż gołe DNA,
przeciwciała wykrywają obecność histonów

czy to są

artefakty?

a

Lee & Garrard 1991 EMBO J. 10,
607

w transkrybowanej
chroma-tynie po
trawieniu DNazą I
pojawiają się
powtórzenia połówek
nukleosomów

+2.0kb

+2.5kb

+3.0kb

+3.5kb

C

IN

2

H

S

P

8

2

kb

3.53

2.03

1.58

1.33

0.98

0.82

Transcription

-

+

Prior & Allfrey 1983 Cell 34, 1a0a33a

transkrypcja eksponuje dwie normalnie ukryte

reszty

cysteinowe H3 na działanie czynników

modyfikujących

i chromatografię powinowactwa Hg
mononukleosomy wydają się być niesfałdowane w

postaci

dwu tetramerów histonów + nieduże białka

niehistonowe

powolna transkrypcja przez pol II RNA powoduje wyparcie z

nukleosomu jednego dimeru H2A-H2B

Studitsky i in. 2004 Trends Bioch Sci

29: 127-

135

strip ?

problem:

które histony są dostępne do tworzenia nukleosomów ?

synteza histonów

obrót histonów

faza S

faza

G

faza
G

2

mitoz
a

M

faza G

1

faza S

faza G

2

M

zależne od replikacji

konstytutywne zastępcze histony

u wszystkich eukariota H3.3, u roślin wysoce
zacetylowany H3.2

aktywna transkrypcja przez pol II RNA

powoduje rozpad

nukleosomów

Kulaeva i in. 2007 Mutat Res 618: 116-129

dynamika struktury

chromatyny

• w obrębie wysp CpG jest zależna od stanu

metylacji DNA

• modyfikacje histonów - „kod histonowy”

• remodelowanie chromatyny

* zależne od ATP
* niekiedy za pośrednictwem interferencji RNA

(RNAi)

NOBEL 2006 !

przykłady zależnej od RNA heterochromatynizacji:

- inaktywacja piętnowanego chromosomu X (Xi),

-

wyciszenie centromerów i loci typu

koniugacyjnego u droż-

dży rozszczepkowych

Schizosaccharomyces pombe

modyfikacje histonów

K – lizyna
S - seryna

acetylacja lizyn

metylacja lizyn (mono i di) oraz arginin (mono, di i tri)

fosforylacja seryn i treonin

ubikwitynacja C-końcowych lizyn

ADP-rybozylacja
koniugacja SUMO do lizyn

Allfrey i in. PNAS 51, 786-794
Bradbury, BioEssays 14, 9-16

H4 N-terminus

H3 N-terminus

Ac-S-G-R-G-

K

-G-G-

K

-G-L-G-

K

-G-G-A-

K

-R-H-R-

K

-V-L-R-D-

+

+

+

+

+

+

+ + +

+

Ac or Me

Ac

Ac

Ac

Ac

5

8

12

16

20

A-R-T-

K

-Q-T-A-R-

K

-S-T-G-G-

K

-A-P-R-

K

-Q-L-A-T-

K

-A-A-R-

K

-S-A-P-

Me

Ac or Me

Ac

Ac

Ac

Ac

+

+

+ +

+

+

+

+

+

4

9

14

18

23

27

lizyna

-N-Acetyl-Lysine

HAT (Histone
Acetyl-Transferase)

HDAC (Histone
Deacetylase)

odwracalne reakcje

O

N

C

C C

C

C

C

N

+

 







P

O

O

O

P

O

-

wiązanie
DNA

brak wiązania DNA

O

N

C

C C

C

C

C

N



O

C

C

Acetyl-CoA

CoA

P

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

acetylacja konserwowanych lizyn

(N końce H3 i H4 oraz wzorce ich acetylacji są konserwowane)

wielość kompleksów HAT

modyfikacje lizyny

Peterson, Laniel 2004 Curr. Biol. 14:R546-51

kod histonowy daje możliwość

acetylacji H4 - w 4 pozycjach,
fosforylacji H3 – w 2 pozycjach…

>4 000 kombinacji modyfikacji pojedynczego
nukleosomu

kod histonowy

H4AcK8
H3AcK14
H3PhS10

H3MeK9 (trimetylacja)
brak acetylacji H3 lub

H4

H4AcK4
H4AcK12

H2APhS1
H2APhT119
H3PhT3
H3PhS10
H3PhS28

= represja transkrypcji

= tworzenie nowych nukleosomów w
fazie S

= transkrypcja

= skondensowana mitotyczna chromatyna

Peterson, Laniel 2004 Curr Biol 14,
R546

ogólne cechy chromatyny

nieaktywnej

aktywnej

* deacetylacja histonów

* H4AcK5, H3AcK9/14

* H4MeK12

* H3MeK9

* 5mCpG

* brak metylacji DNA

* obecność HP1 (izoformy α,β,γ)

* m-sca nadwrażliwe na

DNazę I

acetylacja histonów na

promotorach

represja

transkrypcji

receptor hormonu

tarczycy

przykład czynnika

transkrypcyjnego

korepresor

TAF 250

II

TB

P

HAT

TA

TA

TACCCG

N-CoR

Sin3

RPD3

HDAC

brak hormonu

Wolffe 1997 Nature 387: 16 zmienione

TAF 250

II

TB

P

HAT

TA

TA

pol.II

HAT

GCN5

ACGGTC

ADA2
ADA3

aktywacja
transkrypcji

koaktywator

HAT

TR/RXR

TH

h

o

rm

o

n

+

HAT

P/CAF

p300
CPB

HAT

TACCCG

TH

aktywacja
genów fazy
S

Ait-Si-Ali et al. Nature 396, 184 (1998) zmienione

kontrola przejścia
G1-S punkt R
(ang. Restriction)

HDAC1 (ang. Histone
Deacetylase)

Rb

TAF 250

II

TB

P

HAT

TA

TA

geny fazy S WYŁĄCZONE

korepresor Rb

CPB

HA

T

P

TAF 250

II

TB

P

HAT

TA

TA

geny fazy S WŁĄCZONE

aktywny HAT

(ang. Histone

Acetyl

Transferase)

Rb

P

słaba aktywność

H

A

T

CPB

niska aktywność HAT

koaktywator

S

G1

G2

mitoza

R

cyklina E/

/kinaza

cdk2

P

+

pol.II

korepresor

deacetylacja chromatyny

wyciszenie transkrypcyjne – inaktywacja chromosomu X

Nan et al. Mol.Cell.Biol. 16, 414 (1996); Cell 88, 1 (1997); Jones et al. Nat.Genet. 19, 187 (1998)

metylacja C w CpG występuje w

wyciszonych genach i inaktywowanych
chromosomach X

metylacja CpG jest utrzymywana po

replikacji dzięki metylazie DNA
specyficznej dla hemimetylowanego DNA

5mC wiąże represor transkrypcyjny MeCP2

(MethylC-binding Protein-2)

MeCP2 wiąże korepresor Sin3 z deacetylazą

histonów RPD3

+

+

hypoacetylowane wyciszone włókno chromatyny

represor transkrypcji

HDAC

Sin3

RPD3

MeCP2

5’

..

p

C

p

G

p

..

3’

me

5

 

3’

..

p

G

p

C

p

..

5’

5

me

korepresor

acetylacja domen

chromatynowych

Hebbes, Clayton, Thorne, Crane-Robinson 1994 EMBO J. 13, 1823

przykład: domena kurzych genów -globinowych

 wysoki poziom acetylacji chromatyny w całych domenach (pętlach

DNA) indukuje ogólną wrażliwość chromatyny na DNazę I

 wewnątrz tych domen w obrębie funkcjonalnych genów lub miejsc wiązania

czynników transkrypcyjnych w strukturze chromatyny występują małe miejsca
nadwrażliwe na DNazę I

domain
boundary

domain

boundary







H



A





0

10

20

30kb

m-sce nadwraż-
liwe na DNazę I

geny -globiny

kompleksy nukleoso-
mów z antyAcK

DNA loop domain

ogólna wrażliwość
na DNazę I

kontrola:
nieaktywny gen

kurzej
owalbuminy

0 1 2

DNase I (u/ml)

D

N

A

r

e

m

a

in

in

g

DNase I

różnice gatunkowe

interakcji metylacji

DNA i histonów

owady – Dnmt2 nie ma N-końcowej

domeny odpowiedzialnej za
interakcje z in. białkami -
metylacja DNA i his - tonów nie są
powiązane

Neurospora, Arabidopsis,

człowiek – metylacja DNA i
histonów współdziałają w
wyciszaniu genów

kolejność
deacetylacji
histonów,
metylacji
histonów,
metylacji DNA
jest różna

DNMT oddziałują z:
deacetylazami histonów (HDACs)
metylazami histonów (HMTases)
zależnymi od ATP kompleksami
remodeluja- cymi chromatynę
białkami strukturalnymi chromatyny (z

rodzi-

ny HP1)

kooperatywna i samowzmacniająca się
organizacja maszyneri modyfikujących
chromatynę i DNA odpowiedzialnych za
wyciszanie genów w komórkach normalnych
i nowotworowych

www.med.ufl.edu/biochem/keithr/fig4pt1.html

 

wiązanie DNMT do odpowiednich regionów

prawdopodobnie zachodzi dzięki interakcjom białko–białko

http://www.med.ufl.edu/biochem/keithr/fig3.html

komórki normalne –

metylacja DNA dotyczy
regionów
repetytywnych a
większość wysp CpG w
promotorach jest
niezmetylowana

komórki nowotworowe –

powtarzalne DNA traci
metylację, a wyspy
CpG promotorów
zyskują metylację, co
powoduje wyciszenie
bliskiego genu

Esteller, Almouzni 2005 EMBO Rep 6: 624-8

modyfikacje histonów i metylacja DNA integrują funkcje
jądrowe

zależność struktury nukleosomowej, lokalizacji

chromosomowej i aktywności transkrypcyjnej.

nukleosom

metylowan
e CpG

DNA

ATP- zależne kompleksy remodelujące chromatynę

3

klasy kompleksów konserwowane pomiędzy S.c., D.m., H.s.

Peterson 2002 EMBO Rep 3: 319–322

biochemiczna aktywność ATP-zależnych

kompleksów remodelujących chromatynę

interakcje z czynnikami
transkrypcyjnymi decydują o
kierowaniu kompleksów do miejsc
docelowych

etapy działania kompleksów
prowadzące do przesunięcia,
transferu, rozpadu
nukleosomu

Vignali i in. 2000 Mol Cell Biol 20: 1899-1910

regulacja cyklu komórkowego

przez kompleks SWI/SNF

oddziaływania między:

kompleksami HAT,

kompleksami
remodelującymi

i

czynnikami transkrypcyjnymi

umożliwiają utworzenie

PIC

(ang. preinitiating

complex)

A.

promotor drożdżowego

genu HO - przed powstaniem
PIC aktywator

Swi5p

rekrutuje

SWI/SNF

i

HAT

(Gcn5p), co zwabia aktywator
SBF

B.

promotor ludzkiego IFN-β –

związane wyżej aktywatory
rekrutują

HATy

podczas

tworzenia PIC, acetylacja
histonów ułatwia
przyłączenie

SWI/SNF

, który

niszczy strukturę nukleosomu
związanego z promotorem

C.

promotor ludzkiego α

1

-AT-

kompleksy

HAT

(CBP, P/CAF) i

SWI/SNF

przyłączają się do

promotora po utworzeniu PIC
stymulując ekspresję

enzymy remodelujące chromatynę ułatwiają różne etapy aktywacji genów

białe owale – czynniki

transkrypcyjne związane z

rdzeniami enhancerów,

promotorem i -2.4-kb

silencerem;

TR- receptor hormonu tarczycy,

związany do -2.4-kb silencera

obok m-sca CTCF

CH

3

i Ac - m-sca metylacji DNA

i acetylacji histonów

szare kółka – nukleosomy
owale z linia kreskowaną –

kompleksy czynników

transkrypcyjnych obecne w

niektórych komórkach lub

stabilizowane po stymulacji

LPS

strzałki czarne i szare –

odpowiednio silne i słabe m-

sca nadwrażliwe na DNazę I

Lefevre i in. 2003
Mol. Cell. Biol. 23: 4386-4400

zmiany struktury chromatyny, rekrutacji czynników
transkrypcyjnych i kofaktorów w rejonie regulatorowym

locus

lizozymu

w linii erytroblastów HD37 (Lys

¯ ¯

), komórkach

prekursorowych HD50 MEP (

Lys

¯

), niestymulowanych (

Lys

+

) i

stymulowanych LPS komórkach HD11 (

Lys

++

)

Lys

¯

¯

Lys

¯

Lys

+

Lys

++

Wood i in. 2006 Combinatorial chromatin
modifications and memory storage: A code for
memory? Learn Mem 13: 241-244

naprawa DNA – NER, NHEJ,
rekombinacja homologiczna, naprawa
genów transkrypcyjnie aktywnych
Shim i in. 2005 Mol Cell Biol 25: 3934-
44
Kruhlak i in. 2006 Cell Biol 172: 823-
834

Chai i in. 2005 Genes Dev 19: 1656-
1661

inne procesy zachodzące przy udziale enzymów

modyfikacji histonów i/lub remodelujących chromatynę

Mayer i in. 2006 Intergenic
transcripts regulate the
epigenetic state of rRNA genes
Mol Cell 22: 351-361

kompleks

remodelujący

NoRC wycisza

geny rRNA