KWASY NUKLEINOWE I STRUKTURA CHROMATYNY

ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA

1. Wzory zasad purynowych i pirymidynowych występujących w RNA i DNA, nukleozydów i nukleotydów (powtórzenie wiadomości omawianych w trakcie kursu chemii bioorganicznej).

2. Struktura oligonukleotydów (rybo- i 2'-deoksyrybo-), zapis pełny i skrócony.

3. Struktura nukleosomu, histony i ich rola w stabilizacji struktury nukleosomu.

4. Podstawowe cechy struktury RNA i DNA.

5. Metody wykorzystywane do izolowania i analizy DNA.

6. Podstawowe różnice pomiędzy organizacją genomu pro- i eukariotycznego.

WPROWADZENIE

Podstawowe cechy struktury DNA i RNA

DNA jest nośnikiem informacji genetycznej zarówno u Procariota i Eucariota, a także niektórych wirusów.

Pojedynczy łańcuch DNA składa się z czterech deoksyrybonukleozydów, wielokrotnie powtarzających się w różnych sekwencjach (dAMP, dGMP, dCMP, dTMP), połączonych wiązaniami 3',5' fosfodiestrowymi. Pierwszy deoksyrybonukleotyd łańcucha DNA posiada wolną resztę fosforanową w pozycji 5'; a ostatni ma wolną grupę 3'-hydroksylową deoksyrybozy. W rezultacie każdy łańcuch DNA wykazuje polarność budowy - koniec 5' jest odmienny od końca 3'.

Watson i Crick w 1953 roku opublikowali trójwymiarowy model struktury DNA. Na podstawie badań rentgenograficznych przeprowadzonych przez Franklin i Wilkinsa ustalili, że DNA zbudowany jest z dwóch helikalnie splecionych nici. Dwa łańcuchy DNA są ułożone antyrównolegle względem siebie, jedna nić zorientowana jest w kierunku 5'Ⴎ3', a druga odwrotnie - 3'Ⴎ5'. Zasady są skierowane do wnętrza helisy, a łańcuch cukrowo-fosforanowy znajduje się na zewnątrz. Pomiędzy zasadami znajdującymi się w przeciwległych łańcuchach tworzą się wiązania wodorowe. Adenina tworzy parę z tyminą łącząc się dwoma mostkami wodorowymi. Guanina łączy się z cytozyną za pomocą trzech mostków wodorowych. W centralnym obszarze helisy między parami zasad powstają oddziaływania typu asocjacji warstwowej.

Dwupasmowy DNA istnieje przynajmniej w sześciu formach (A-E i Z). W warunkach fizjologicznych występuje zwykle helikalna forma B, w której na pojedynczy skręt przypada około 10 par zasad (pz). Skok helisy wynosi 3,4 nm, a jej średnica 2 nm.

Cząsteczki DNA mogą osiągać znaczne rozmiary. Długość cząsteczki DNA wirusa polioma wynosi 1,7 μm (5100 pz), Escherichia coli - 1,36 mm (4,6 x 10⁶ pz), w największym chromosomie Drosophila melanogaster - 2,1cm (6,2 x 10⁷ pz). Sumaryczna długość genomu haploidalnego człowieka wynosi około 1 metra (3 x 10⁹ pz). Najkrótsza cząsteczka chromosomowego DNA człowieka osiąga rozmiar 1,6 cm, a najdłuższa - około 8,4 cm.

Cząsteczki DNA ulegają w komórce niewielkim modyfikacjom. Ograniczają się one do metylacji grup aminowych adeniny i cytozyny.

Kwas rybonukleinowy jest polimerem rybonukleotydów. Cząsteczki RNA zawierają w różnych sekwencjach rybonukleotydy adeniny, guaniny, cytozyny i uracylu. W niektórych klasach RNA mogą występować inne zasady, które powstają na skutek modyfikacji potranskrypcyjnych. Rybonukleotydy połączone są wiązaniami fosfodiestrowymi analogicznie jak w DNA. RNA jest zazwyczaj pojedynczą cząsteczką. W obrębie nici często występują odcinki dwuniciowe. Tworzą je sekwencje zawierające komplementarne zasady ułożone w odwrotnej polarności. W związku z tym cząsteczki RNA posiadają zdolność przybierania skomplikowanych struktur. Dużym udziałem sparowanych fragmentów charakteryzują się cząsteczki rybosomowych RNA (rRNA) i transportujących RNA (tRNA), drugorzędową strukturę wykazują także eukariotyczne informacyjne RNA (mRNA). RNA ulega bardzo zróżnicowanym modyfikacjom po transkrypcji, co odzwierciedla różnorodność jego funkcji pełnionych w komórce.

W komórkach eukariotycznych występują w dużej ilości niewielkie cząsteczki RNA. Drobne jądrowe snRNA uczestniczą w procesie dojrzewania mRNA i regulacji ekspresji genów. Szereg niskocząsteczkowych RNA posiada aktywność katalityczną, są to rybozymy. RNA jest jednocześnie przenośnikiem informacji genetycznej i cząsteczką zdolną do katalizy. Powyższe fakty pozwoliły na postawienie hipotezy, że w ewolucji życia RNA pojawił się przed DNA i białkiem.

Zasadnicze cechy organizacji genomu eukariotycznego i prokariotycznego

W jądrze DNA jest upakowany w chromosomy. Każdy chromosom zawiera jedną długą, liniową, dwuniciową cząsteczkę DNA.

Chromosomowy DNA występuje w połączeniu z białkami, tworząc chromatynę. Wśród białek chromatyny wyróżniamy histony oraz liczną grupę białek, zwanych niehistonowymi. Białka niehistonowe pełnią rozliczne funkcje. Wśród nich wyróżniamy enzymy biorące udział w procesach zachodzących na terenie jądra, białka o charakterze regulatorowym jak np. receptory hormonów steroidowych, a także białka utrzymujące strukturę jądra.

Histony są typowymi białkami strukturalnymi, tworzącymi zrąb chromatyny. Są to niewielkie białka, a w ich składzie około 25% sekwencji stanowią zasadowe aminokwasy - lizyna i arginina. Właściwości histonów oraz ich klasyfikacja zależą od zawartości tych dwóch aminokwasów. Wyróżnia się histony bogate w lizynę (H1), umiarkowanie bogate w lizynę (H2A i H2B) i bogate w argininę (H3 i H4). Histony u różnych gatunków wykazują duże podobieństwo składu aminokwasowego, co przemawia za ich małą zmiennością ewolucyjną. W trakcie życia komórki ulegają licznym modyfikacjom potranslacyjnym, które zmieniają strukturę chromatyny, a zarazem jej funkcję.

Podstawową jednostką chromatyny jest nukleosom. Nukleosom jest to elipsoidalna cząstka zbudowana z histonów i opleciona nicią DNA. Trzon nukleosomu stanowi kompleks ośmiu cząsteczek histonów - (H2A, H2B, H3, H4) x 2. Na oktamer histonowy, nawinięty jest odcinek DNA w postaci lewoskrętnej superhelisy o długości około 146 pz. Odcinek ten tworzy 1,75 obrotu, a następnie przechodzi w tzw. DNA łącznikowy, łączący dwie sąsiednie podjednostki. Zazwyczaj długość DNA łącznikowego wynosi około 60 pz. Cały odcinek DNA przypadający na nukleosom stanowi około 200 pz. Siłami podtrzymującymi nić DNA na oktamerze białkowym są oddziaływania elektrostatyczne pomiędzy dodatnio naładowanymi resztami aminokwasów zasadowych a ujemnie naładowanym ortofosforanem uczestniczącym w wiązaniach fosfodiestrowych łańcucha DNA. Długość DNA upakowanego w nukleosomach zmniejsza się około siedmiokrotnie. Strukturę chromatyny stabilizuje także histon H1 oraz białka niehistonowe. Histon H1 łączy się z odcinkami DNA poza rdzeniami nukleosomów. Dzięki tym oddziaływaniom, chromatyna może tworzyć struktury wyższego rzędu, jak np. solenoid. Tak utworzone włókno DNA jest przyłączone do centralnego rusztowania białkowego i tworzy serię pętli. Ogólny stopień skrócenia konturów DNA wynosi około 10⁴. Podczas metafazy chromosomy występują w postaci najbardziej skondensowanej, a ich długość wynosi od 1,3 do 10 μm.

DNA komórek bakterii jest kolistą dwuniciową cząsteczką, często określaną jako chromosom bakteryjny. Znajduje się on w rejonie komórki zwanym nukleoidem. Kolisty genom jest zorganizowany w 50-100 superhelikalnie zwiniętych pętli lub domen, których końce połączone są z błoną komórkową za pośrednictwem kompleksu białkowego. Zwojom DNA towarzyszą białka podobne do histonów.

W wielu komórkach bakteryjnych występują plazmidy. Są to niewielkie, koliste cząsteczki dwuniciowego DNA. Plazmidy posiadają zdolność autonomicznego namnażania się w komórkach bakteryjnych. DNA plazmidowy z reguły nie zawiera genów niezbędnych do życia bakterii. Wiele plazmidów posiada geny oporności na antybiotyki. Plazmidy są około 100 razy mniejsze od chromosomu bakteryjnego, ale posiadają podobny kolisty plan budowy i są superhelikalnie zwinięte.

Plazmidy stosowane w badaniach inżynierii genetycznej są sztucznie skonstruowanymi cząsteczkami DNA, pochodzącymi od naturalnego plazmidu E. coli. W biologii molekularnej często używanymi do analiz plazmidami jest pBR-322 o długości 4362 pz lub pUC 19 o długości 2686 pz. Znana jest ich sekwencja nukleotydowa, a także sekwencje rozpoznawane przez określone endonukleazy restrykcyjne.

Endonukleazy restrykcyjne bronią komórkę bakteryjną przed konsekwencją wnikania obcego DNA (np. wirusowego). Są to enzymy o bardzo dużej specyficzności działania i hydrolizują cząsteczki DNA w obrębie rozpoznawanej przez siebie sekwencji. Sekwencje te obejmują zazwyczaj cztery lub sześć ściśle określonych pz tworzących tzw. palindrom (Rys. 1).

Endonukleazy restrykcyjne z uwagi na bardzo wysoką specyficzność działania znalazły szerokie zastosowanie w badaniach genomów i w innych dziedzinach biologii molekularnej.

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

1. Izolowanie DNA z grasicy cielęcej

Metody stosowane do wyodrębnienia DNA z materiału biologicznego mają na celu otrzymanie preparatu czystego pod względem chemicznym i jednocześnie o możliwie nieuszkodzonej strukturze.

Preparatom DNA towarzyszą zanieczyszczenia białkami jądrowymi i RNA. Metody służące do oczyszczania DNA kładą nacisk na usunięcie tych substancji. W postępowaniu preparatywnym należy ograniczać działanie deoksyrybonukleaz. W tkankach pobranych do preparatyki zostają zaburzone systemy regulacyjne i nukleazy atakują DNA komórkowy, powodując jego stopniową degradację. Właściwości tkanki, z której izoluje się DNA, mogą wpływać na stopień trudności preparatyki. Istotna jest aktywność enzymów nukleolitycznych znajdujących się w danej tkance, stosunek ilościowy RNA/DNA oraz zawartość DNA. Przykładowo, wysoką aktywnością nukleaz charakteryzują się śledziona i trzustka, stosunkowo niską zaś grasica. Zawartość DNA w różnych tkankach waha się w szerokim zakresie od około 0,2% w wątrobie szczura do 2,5% w grasicy cielęcej. Stosunek RNA/DNA wynosi około 4 dla wątroby szczura, dla grasicy cielęcej tylko 0,4. Te kryteria powodują, że grasica cielęca jest dogodnym materiałem do izolowania DNA.

Zasada metody

Izolowanie DNA obejmuje dwa etapy:

1. Uzyskanie z grasicy deoksyrybonukleoproteidu (DNP), możliwie wolnego od zanieczyszczeń rybonukleoproteidem (RNP).

Grasicę należy poddać homogenizacji w roztworze NaCl o stężeniu 0,15 mol/dm³ z dodatkiem cytrynianu sodu. Homogenizacja powoduje zniszczenie komórek i uwolnienie z jąder komórkowych DNP i RNP. RNP w trakcie homogenizacji ulega rozpuszczeniu, DNP pozostaje nierozpuszczony. Cytrynian stosuje się jako związek wiążący jony metali dwuwartościowych, między innymi jony Ca²⁺ i Mg²⁺, które są niezbędne do działania deoksyrybonukleaz. Usunięcie tych jonów zabezpiecza DNA przed degradacją przez nukleazy.

2. Dysocjacji DNP w środowisku o dużej sile jonowej na białka i DNA.

DNP rozpuszcza się w roztworach o dużej sile jonowej, w tym przypadku w roztworze NaCl o stężeniu 2 mol/dm³. Rozpuszczone cząsteczki DNA wytrąca się z roztworu za pomocą etanolu.

Materiał i odczynniki

1. Roztwór SSC (0,15 mol/dm³ NaCl, 0,015 mol/dm³ cytrynian sodu, pH 7,0).

2. 4 mol/dm³ roztwór NaCl.

3. Grasica cielęca.

Wykonanie doświadczenia

etap wspólny dla całej grupy

1. Jeden gram grasicy cielęcej (świeżej lub zamrożonej) homogenizować w homogenizatorze nożowym 2 minuty w 150 cm³ wychłodzonego roztworu SSC.

2. Homogenat odwirować (15 min, 2500 obr./min).

3. Płyn nadosadowy, zawierający rozpuszczony RNP wylać.

4. Osad DNP przenieść do naczynia miksera, dodając 200 cm³ roztworu SSC.

5. Homogenizować 30 sek. w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny,

praca w zespołach

1. Pobrać do zlewki 10 cm³ homogenatu DNP.

2. Dodać 10 cm³ 4 mol/dm³ roztworu NaCl (stężenie końcowe 2 mol/dm³).

3. Preparat mieszać bez użycia bagietki aż do momentu, w którym roztwór stanie się wyraźnie lepki na skutek rozpuszczania się deoksyrybonukleoproteidu.

4. Z uzyskanego w ten sposób lizatu DNP należy otrzymać dwa oddzielne preparaty DNA przeznaczone do:

1. hydrolizy kwaśnej ( doświadczenia nr 2)

2. oznaczenia fosforu całkowitego (doświadczenie nr 4).

2. Hydroliza kwaśna DNA w 72% roztworze HClO₄

Zasada metody

Podczas ogrzewania DNA w 72% roztworze kwasu nadchlorowego następuje hydroliza wiązań N-glikozydowych i uwolnienie zasad azotowych. Reszty deoksyrybozy oraz inne zanieczyszczenia biologiczne ulegają zwęgleniu.

Odczynniki

1. 96% etanol.

2. Aceton.

3. 72% roztwór HClO₄.

Wykonanie doświadczenia

1. Do zlewki o pojemności 50 lub 100 cm³ pobrać 10 cm³ zlizowanego preparatu DNP, dodać równą objętość wychłodzonego 96% etanolu, wymieszać (bez użycia bagietki), aż utworzy się wyraźny, kłaczkowaty osad DNA.

2. DNA przenieść do szklanej probówki wirówkowej, dodać 2 cm³ 96% etanolu i wymieszać. Następnie etanol wylać, pozostawiając wytrącony DNA w probówce (na dnie).

3. Dodać około 1 cm³ acetonu i ponownie wymieszać. Wylać aceton, pozostawiając osad DNA na dnie.

4. Probówkę lekko ogrzać w ciepłym strumieniu powietrza, odparowując resztki acetonu.

5. Wysuszony kłaczek DNA zalać 0,2 cm³ roztworu 72% HClO₄ i po zakryciu probówki korkiem z chłodniczką zwrotną wstawić ją do łaźni wodnej o temperaturze 100⁰ C na 1 godzinę.

6. Po zakończonym ogrzewaniu należy dodać 0,3 cm³ wody i całość roztworu przenieść do probówki Eppendorfa.

7. Odwirować zwęglone zanieczyszczenia (5 min, mikrowirówka).

8. Płyn znad osadu ostrożnie przenieść pipetką do suchych probówek Eppendorfa.

9. Otrzymany preparat poddać dalszej analizie celem identyfikacji uwolnionych zasad azotowych. (Jeśli identyfikacja zasad za pomocą chromatografii bibułowej ma odbyć się na następnych zajęciach, probówki należy przechować w chłodni).

3. Chromatografia kwaśnych hydrolizatów DNA

Zasada metody

Uwolnione w trakcie hydrolizy DNA zasady purynowe i pirymidynowe można rozdzielić za pomocą chromatografii bibułowej wstępującej.

Odczynniki

1. Bibuła Whatman nr 1.

2. Solwent o składzie: izopropanol : stężony HCl : H₂O (170 : 41 : 39).

Wykonanie doświadczenia

1. Na arkusiku bibuły zaznaczyć ołówkiem w równych odstępach sześć ponumerowanych punktów, w odległości 2,5 cm od dolnej krawędzi bibuły.

2. Na cztery punkty nanieść kolejno wzorce adeniny, guaniny, cytozyny i tyminy, dotykając bibuły trzy razy kapilarką z odpowiednim roztworem. Miejsca nanoszenia każdorazowo suszyć suszarką. Plamki nie powinny mieć więcej niż 3-4 mm średnicy. Na punkt 5 nanieść analogicznie mieszaninę wszystkich wzorców, a na punkt 6 - przygotowany kwaśny hydrolizat DNA.

3. Wysuszoną bibułę wstawić do komory chromatograficznej i rozwijać chromatogram około 3,5 godziny.

4. Po wyjęciu chromatogramu należy go wysuszyć suszarką.

5. Obserwować uzyskane wyniki w świetle lampy UV (zasady purynowe i pirymidynowe pochłaniają światło nadfioletowe w zakresie 250-280 nm). Ołówkiem zaznaczyć położenie każdej zasady.

6. Porównać położenie plam wzorców z wynikami uzyskanymi z rozdziału kwaśnego hydrolizatu DNA.

4. Przygotowanie preparatu DNA do oznaczania fosforu całkowitego

Odczynniki

1. 96% etanol.

Wykonanie doświadczenia

1. 1 cm³ lizatu DNP przenieść do probówki skalowanej na 10 cm³, dodać 1,5 cm³ 96% etanolu. Zawartość probówki wymieszać bez użycia bagietki.

2. Po upływie jednej godziny etanol ostrożnie zlać, pozostawiając strącony DNA na dnie probówki. ( Jeśli dalsze badania mają się odbyć na następnych zajęciach, probówkę należy zakryć folią aluminiową i pozostawić w chłodni.)

5. Oznaczanie fosforu całkowitego w DNA oraz obliczanie procentowej zawartości DNA w grasicy. Zadanie indywidualne.

Zasada metody

Aby oznaczyć zawartość fosforu w DNA należy otrzymany preparat poddać mineralizacji. Mineralizacja polega na przemianie (utlenieniu) związków organicznych w nieorganiczne.

W stosowanej metodzie mineralizacja DNA odbywa się w wysokiej temperaturze (200 ⁰ C), a czynnikami utleniającymi są: stężony kwas siarkowy ( ulega redukcji do dwutlenku siarki), oraz stężony kwas nadchlorowy. W tych warunkach DNA ulega całkowitemu spaleniu do pierwiastków (C, H, N, O, P). Węgiel, wodór, azot i tlen ulotnią się z probówki w postaci dwutlenku węgla, tlenków azotu, pary wodnej, natomiast fosfor pozostanie na dnie probówki jako roztwór kwasu fosforowego - fosforan nieorganiczny.

Zasada oznaczenia fosforanów nieorganicznych polega na reakcji fosforanu z molibdenianem amonu. Powstały fosforomolibdenian przekształca się w "błękit molibdenowy" (mieszaninę tlenków molibdenu na niższym stopniu utlenienia) za pomocą reduktora, którym jest eikonogen. Powstające zabarwienie jest proporcjonalne do zawartości fosforanów, a reakcja przebiega ilościowo w 100⁰ C w środowisku silnie kwaśnym. Natężenie barwy - absorbancję roztworu barwnego mierzy się kolorymetrycznie przy określonej długości fali wykorzystując do obliczeń prawo Lamberta - Beer'a, które mówi o tym, że wartość absorpcji wiązki światła monochromatycznego przechodzącego przez roztwór jest wprost proporcjonalna do stężenia roztworu.

Powyższa metoda jest bardzo czuła i pozwala na wykrycie kilku μg fosforanów, a powstałe zabarwienie jest trwałe przez wiele godzin.

Wykonana równolegle krzywa wzorcowa pozwala na ilościowe oznaczenie fosforanów w próbie.

Oznaczenie ilości DNA opiera się na fakcie, że zawartość fosforu w cząsteczkach tego kwasu nukleinowego jest wartością stałą i wynosi 9% masy tego związku.

5. a ) Mineralizacja DNA

Odczynniki

1. Stężony H₂SO_{4 ,}

2. 6 mol/dm³ roztwór HClO_{4 .}

Wykonanie doświadczenia

1. Do probówki zawierającej preparat DNA dodać 0,5 cm³ stężonego H₂SO₄ i zawartość jej spalić w piecu elektrycznym w temperaturze około 200⁰ C. Próbki czernieją na skutek zwęglenia.

2. W celu utlenienia związków powstałych podczas mineralizacji należy dodać utleniacza - jedną kroplę 6 mol/dm³ roztworu HClO₄. Próbkę należy ogrzewać dalej około 5 minut i ponownie dodać kroplę roztworu kwasu nadchlorowego; czynność można kilka razy powtórzyć. Zakończenie procesu mineralizacji następuje wtedy, gdy roztwór w probówce będzie bezbarwny.

3. Po ukończonej mineralizacji probówkę wstawić do statywu, aby ostygła.

5. b ) Oznaczanie fosforanu nieorganiczneg po mineralizacji DNA i w zadaniu indywidualnym

Odczynniki

1. 5% roztwór molibdenianu amonu.

2. 0,2% roztwór eikonogenu (kwas 1-amino-2-naftolo-4-sulfonowy w 12% pirosiarczynie sodu i 1,2% siarczynie sodu).

3. Stężony H₂SO₄.

4. Wzorzec fosforu (roztwór KH₂PO₄ zawierający 4 μg P/ cm³).

Wykonanie doświadczenia

1. Do 9 probówek skalowanych na objętość 10 cm³ dodać kolejno odczynniki według tabeli .

2. Po dodaniu każdego odczynnika zawartość probówek należy starannie wymieszać.

3. Probówki uzupełnić wodą do objętości 10 cm³ i wymieszać.

4. Umieścić probówki we wrzącej łaźni wodnej na 20 minut, następnie wyjąć, oziębić i ponownie uzupełnić wodą do objętości 10 cm³.

5. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 680 nm wobec próby ślepej (probówka nr 6) i zapisać odczytane wartości absorbancji w zeszycie.

6. Dla wykonania krzywej wzorcowej wartości absorbancji - ( probówki od 1do 6) nanieść na układ współrzędnych. Wartości absorbancji wyznaczyć na osi rzędnych, a ilość fosforu w próbie na osi odciętych (μg P/próbę).

7. Z krzywej wzorcowej odczytać ilość μg fosforu w zadaniu indywidualnym dla każdego studenta - zadanie na zaliczenie.

8. Z krzywej wzorcowej odczytać ilość μg fosforu zawartego w fosforanach otrzymanych po mineralizacji DNA.

9. Obliczyć procentową zawartość DNA w grasicy, uwzględniając rozcieńczenia stosowane w toku preparatyki

Tabela

Nr probówki	1	2	3	4	5	6	7, 8	9
Ilość dodanych odczynników w cm^3
Preparat DNA	-	-	-	-	-	-	-	+
zadanie	-	-	-	-	-	-	1	-
Wzorzec fosforu	0,5	1,5	2,5	3,5	4,5	-	-	-
Woda	4,5	3,5	2,5	1,5	0,5	5	4	5
St. H2SO4	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	-
5% molibdenian amonu	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
0,2% eikonogen	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5

-probówki 1-5 służą do wyznaczenia krzywej wzorcowej ( tzn. wykresu zależności absorbancji od ilości μg P w próbie).

-probówka 6 - ślepa próba

-probówki 7, 8 - zadanie ilościowe indywidualne dla każdego studenta

-probówka 9 - preparat zmineralizowanego DNA

6. Wykazanie struktury nukleosomowej chromatyny

Preparat chromatyny należy uzyskać z wątroby cielęcej, poddanej wstępnej homogenizacji w izotonicznym roztworze sacharozy. Otrzymany po odwirowaniu osad jąder jest zanieczyszczony fragmentami błon komórkowych i erytrocytami, które usuwane są przez homogenizację osadu w izotonicznym roztworze sacharozy z dodatkiem detergentu (Triton X-100). Detergent powoduje rozpuszczenie struktur lipidowych.

Już w trakcie izolowania jąder, a następnie podczas inkubacji, zachodzi stopniowa degradacja DNA za pomocą endogennych nukleaz aktywowanych jonami Ca²⁺ i Mg²⁺. Deoksyrybonukleazy, mając utrudniony dostęp do DNA nawiniętego na oktamer histonowy, hydrolizują głównie wiązania fosfodiestrowe w obrębie DNA łącznikowego. Po działaniu enzymów powstają odcinki DNA odpowiadające długości 200 pz oraz fragmenty będące wynikiem niepełnej degradacji chromatyny, które są wielokrotnością 200 pz (Rys. 2).

a) Izolowanie jąder komórkowych z wątroby cielęcej

(etap wspólny dla całej grupy)

Materiał i odczynniki

1. Medium A (0,25 mol/dm³ roztwór sacharozy, 10 mmol/dm³ Tris-HCl pH 7,2,

10mmol/dm³ MgCl₂, 1 mmol/dm³ CaCl₂).

2. Medium B ( 25 mol/dm³ roztwór sacharozy, 10 mmol/dm³ Tris-HCl pH 7,2,

10 mmol/dm³ MgCl₂, 1 mmol/dm³ CaCl₂ , 0,2% Triton X-100 ).

3. Wątroba cielęca.

Wykonanie doświadczenia

1. 5 g wątroby cielęcej pokroić na drobne skrawki i zalać zimnym medium A.

2. Homogenizować tkankę w homogenizatorze szklanym (około 10-12 ruchów tłoka "góra-dół"). Uzupełnić do 200 cm³ tym samym roztworem. Przesączyć przez gazę.

3. Wirować (10 min, 2000 obr./min). Płyn znad osadu wylać, osad zalać 100 cm³ medium B, lekko homogenizować (4-5 ruchów tłoka "góra-dół").

4. Wirować (5 min, 2000 obr./min). Płyn znad osadu wylać. Osad jąder zawiesić w 20 cm³ medium A, lekko homogenizować. Otrzymany roztwór stanowi zawiesinę jąder komórkowych.

b) Hydroliza DNA chromatyny w zależności od czasu inkubacji z endogennymi nukleazami

Zasada metody

Aby wykazać nukleosomową strukturę chromatyny, zawiesinę jąder komórkowych należy inkubować w temperaturze 37⁰ C w buforze zawierającym jony wapnia i magnezu, a następnie oddzielić DNA od białek za pomocą detergentu (SDS) i roztworu KCl. Następnie przeprowadzić denaturację białek wytrząsając preparat z mieszaniną chloroformu i alkoholu izoamylowego, a cząsteczki DNA z fazy wodnej wytrąca się za pomocą etanolu.

Odczynniki

1. 10% roztwór siarczanu dodecylu sodu (SDS).

2. 3 mol/dm³ roztwór KCl.

3. Mieszanina chloroform: alkohol izoamylowy (24 : 1).

4. 96% etanol

Wykonanie doświadczenia

Każdy wyznaczony zespół izoluje tylko jeden preparat DNA z jąder inkubowanych w ustalonym przez asystenta czasie (0, 10, 20 lub 30 minut).

Uwaga: studenci, którzy izolują preparat DNA dla czasu "0", pobierają próbkę przed wstawieniem zlewki z zawiesiną jąder do łaźni wodnej.

1. Wstawić zlewkę z zawiesiną jąder komórek wątroby do łaźni wodnej o temperaturze 37⁰ C.

2. Po określonym czasie inkubacji zawartość zlewki zamieszać i pobrać 1 cm³

zawiesiny do probówki wirówkowej, w której znajduje się 0,1 cm³ 10%

roztworu SDS, dobrze wytrząsać - około 2 minut.

3. Dodać 0,2 cm³ 3 mol/dm³ roztworu KCl, dobrze wymieszać i wlać 1 cm³ mieszaniny chloroform : alkohol izoamylowy.

4. Wytrząsać przez 20 minut (można robić przerwy).

5. Zawartość probówek wirować (10 min, 3000 obr./min).

6. Pipetką plastikową ściągnąć górną warstwę wodną, zawierającą DNA uważając,

aby nie poruszyć osadu zdenaturowanych białek znajdującego się na granicy faz.

Roztwór wlać do probówki wirówkowej i wytrącić DNA przez dodanie 3,5 cm³

96% etanolu.

7. Jeżeli analiza DNA ma się odbyć na następnych zajęciach, należy zakleić wylot probówki parafilmem i pozostawić w chłodni.

c) Analiza DNA metodą elektroforezy w żelu agarozowym

DNA w połączeniu z bromkiem etydyny fluoryzuje w świetle ultrafioletowym i w żelu obserwuje się charakterystyczny układ prążków, odpowiadający pozycjom zajmowanym przez poszczególne fragmenty DNA. Celem ustalenia długości fragmentów DNA poddaje się elektroforezie wzorcowy DNA.

Odczynniki

1. Bufor TE (10 mmol/dm³ Tris-HCl pH 8,0, 1 mmol/dm³ EDTA).

2. Wzorzec mas cząsteczkowych DNA.

3. Bufor do obciążenia próbki (10 mmol/dm³ Tris-HCl pH 7,8, 1 mmol/dm³ EDTA,

0,05% błękit bromofenolowy, 50% mocznik, 10% sacharoza).

4. 0,8% żel agarozowy w buforze do elektroforezy z dodatkiem bromku

etydyny.

5. Bufor do elektroforezy (0,02 mol/dm³ roztwór Tris doprowadzony do pH 7,8 za

pomocą stężonego CH₃COOH, 1 mmol/dm³ EDTA).

Wykonanie doświadczenia

1. Odwirować preparat DNA (10 min, 3000 obr./min).

2. Osad DNA rozpuścić w 1 cm³ buforu TE.

3. Pipetą automatyczną pobrać 20 l analizowanego roztworu DNA i dodać 5 l roztworu barwnika.

4. Całość nanieść w odpowiedni otworek w żelu agarozowym. Równolegle nanieść DNA wzorcowy.

5. Włączyć prąd stały (stabilizator - napięcie 120 V, natężenie 0,1 A, czas około 1 godziny 30 minut, lub napięcie 160-170 V, natężenie 0,16 A, czas 1 godzina 10 minut).

6. Cząsteczki DNA wędrują od katody do anody. Obserwować poruszanie się barwnika

7. Przerwać elektroforezę, gdy znajdzie się on około 5 cm przed końcem żelu.

8. Żel oglądać w świetle ultrafioletowym.

9. Zinterpretować wyniki.

7. Analiza plazmidowego DNA metodą elektroforezy w żelu agarozowym

Elektroforetogram DNA plazmidu niepoddanego hydrolizie wykazuje obecność charakterystycznych prążków. Uwidocznione dzięki połączeniu z bromkiem etydyny prążki odpowiadają różnym formom plazmidowego DNA: CCC - cząsteczki koliste, wtórnie zwinięte, OC - formy koliste, powstające po przecięciu jednej nici DNA, wchodzącej w skład cząsteczki, L - cząsteczki liniowe powstające w wyniku przecięcia obu nici DNA.

Na rysunku 3 przedstawiono obraz rozdziału elektroforetycznego DNA plazmidowego, który pochodzi z dwóch odrębnych ścieżek na żelu. Najwolniej wędruje forma OC (nicked circles), następnie forma L (linear) i najszybciej forma CCC (supercoiled). Elektroforetogram plazmidu poddanego działaniu endonukleazy restrykcyjnej wykazuje obecność szeregu pasm o ściśle określonej ilości par zasad.

Materiał i odczynniki

1. Odczynniki do elektroforezy jak w ćwiczeniu 6c.

2. Roztwór DNA plazmidowego.

3. Roztwór DNA plazmidowego po hydrolizie wybraną endonukleazą restrykcyjną.

Wykonanie doświadczenia

Rozdziałowi poddać DNA plazmidowy oraz DNA plazmidowy zhydrolizowany wybraną nukleazą restrykcyjną. Wykonać rozdział elektroforetyczny tak jak w doświadczeniu nr 6 c.

KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNEJ

WYZNACZANIE STAŁEJ MICHAELISA

ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA

1. Budowa enzymów.

2. Podział enzymów na klasy.

3. Równanie Michaelisa-Menten i Lineweavera-Burka.

4. Pojęcia: szybkości maksymalnej i stałej Michaelisa.

5. Doświadczalne wyznaczanie stałej Michaelisa.

6. Reakcja katalizowana przez inwertazę.

7. Zasada metody oznaczania aktywności inwertazy.

Wprowadzenie

Enzymy są biokatalizatorami, syntetyzowanymi przez organizmy. Przy udziale enzymów zachodzą wszystkie procesy metaboliczne, a zmiany stężenia lub aktywności poszczególnych enzymów umożliwiają dostosowanie szybkości przebiegu procesów do aktualnych potrzeb organizmu oraz precyzyjną ich koordynację.

Enzymy zwiększają szybkość reakcji i tym samym obniżają czas osiągnięcia stanu równowagi. Enzym wykazuje swoją aktywność tylko wtedy, kiedy istnieją optymalne dla niego warunki. Dotyczy to utrzymania odpowiedniego pH, właściwej temperatury oraz obecności ewentualnych aktywatorów i kofaktorów. W przeciwieństwie do katalizatorów niebiałkowych większość enzymów charakteryzuje się wysoką specyficznością substratową, tzn. każdy z nich katalizuje przekształcenie jednego lub kilku pokrewnych substratów.

O specyficzności substratowej enzymu decyduje część białkowa - apoenzym, w której zlokalizowane jest tzw. centrum aktywne, miejsce do którego przyłącza się substrat. Jest to kilka łańcuchów bocznych aminokwasów, które dzięki strukturze przestrzennej enzymu znajdują się blisko siebie, bardzo często w obszarze hydrofobowym. Cząsteczka substratu może przyłączyć się do enzymu tylko wtedy, kiedy jest przestrzennie dopasowana do centrum aktywnego. Substrat zostaje związany z enzymem licznymi, słabymi oddziaływaniami, w których uczestniczą grupy łańcuchów bocznych aminokwasów centrum aktywnego, a następnie zostaje przekształcony w produkt, który odłącza się od enzymu.Czyli podczas reakcji enzymatycznej tworzy się nietrwały kompleks enzymu z substratem (kompleks ES). Ulega on dużo łatwiej właściwej reakcji chemicznej niż wolny substrat. Powstaje produkt reakcji oraz wolny enzym.

Przy niskim stężeniu substratu i przy stałej, określonej ilości enzymu, nie wszystkie cząsteczki enzymu są połączone z cząsteczkami substratu. Enzym nie jest wysycony substratem i nie wykazuje wtedy maksymalnej aktywności katalitycznej, a szybkość reakcji zależy nie tylko od stężenia enzymu, ale i od stężenia substratu.

Przy wystarczająco dużym stężeniu substratu enzym jest maksymalnie wysycony (enzym jest tylko w kompleksie ES) i reakcja osiąga szybkość maksymalną - V_max. Dalsze zwiększanie stężenia substratu nie może spowodować wzrostu szybkości reakcji. Szybkość ta jest stała, tzn. zależy tylko od stężenia enzymu - V_max = k₃ ∙ [S].

Zależność pomiędzy szybkością reakcji enzymatycznej i stężeniem molowym substratu określa równanie Michaelisa-Menten:

Wykreślona na podstawie tego równania zależność szybkości reakcji od stężenia substratu przyjmuje postać hiperboli (Rys. 1).

Wartości v dla poszczególnych stężeń substratu oznaczające przyrost ilości (stężenia) produktu w jednostce czasu dotyczą każdorazowo szybkości początkowej (v = v₀). Oznacza to, że reakcję należy prowadzić w warunkach, gdy ilość (stężenie) powstałego produktu reakcji jest wprost proporcjonalna do czasu.

Przy bardzo małych stężeniach substratu zależność v od [S] ma przebieg liniowy, szybkość reakcji jest proporcjonalna do stężenia substratu (reakcja I rzędu). Przy stężeniu substratu znacznie przewyższającym wartość K_m szybkość reakcji osiąga wartość maksymalną (V_max) i jest niezależna od dalszego wzrostu stężenia substratu (poziomy odcinek krzywej hiperbolicznej), zależy tylko od stężenia enzymu. Jeżeli [S] = K_m, to v = ½ V_max, tzn. szybkość reakcji osiąga połowę szybkości maksymalnej.

Takie stężenie substratu (w mol/dm³), przy którym szybkość reakcji osiąga połowę szybkości maksymalnej nosi nazwę stałej Michaelisa - K_m. Stała ta mówi o powinowactwie enzymu do substratu. Zazwyczaj K_m równa jest stałej dysocjacji kompleksu ES na E i S, tzn. im jest ona niższa, tym łatwiej kompleks ES powstaje, a trudniej rozpada się, gdyż jest silniejsze wiązanie enzymu z substratem. Wartości K_m dla większości enzymów wahają się w granicach od 10^-5 do 10^-3 mol/dm³.

Niska wartość K_m oznacza, że enzym ma duże powinowactwo do substratu, dzięki czemu reakcja osiąga szybkość maksymalną przy stosunkowo niskim stężeniu substratu. Duża wartość K_m wskazuje na małe powinowactwo enzymu do substratu, a reakcja osiąga V_max dopiero przy odpowiednio wyższym stężeniu substratu. Przy tym samym stężeniu substratu im niższa jest wartość Km, tym większa jest szybkość reakcji.

Doświadczalnie można wyznaczyć wartość K_m dla danego enzymu z pomiarów szybkości początkowych reakcji przy różnych stężeniach substratu. Jednak z wykresu hiperboli trudno jest oszacować, czy osiągnięta została rzeczywiście V_max reakcji. A co za tym idzie, nie ma wtedy pewności, że wyznaczona wartość K_m jest dokładna. Z tego powodu, do wyznaczania wartości Km wykorzystywana jest zależność 1/v od 1/s, czyli równanie Lineweavera-Burka, które jest przekształceniem równania Michaelisa-Menten:

Znajomość wartości K_m ma istotne znaczenie przy opracowywaniu metod oznaczania aktywności enzymów a także wpływu różnych związków na kinetykę katalizowanych reakcji

Opracowano szereg metod oznaczania aktywności enzymów, które wykorzystywane są w diagnostyce różnych chorób (do takich enzymów należy np. dehydrogenaza mleczanowa, aminotransferaza alaninowa, aminotransferaza asparaginianowa, kinaza kreatynowa). Są to enzymy wskaźnikowe, oznaczanie ich aktywności w surowicy krwi chorego pozwala wyciągać wnioski o stanie jego zdrowia. Szybkość każdej reakcji enzymatycznej (aktywność enzymu) należy oznaczać w takich warunkach, aby v = V_max, gdyż tylko wtedy szybkość reakcji zależy od stężenia enzymu. Stężenie substratu musi więc być dużo większe od K_m (minimum 10 razy).

Jest wiele enzymów, które wymagają do swojego działania koenzymu - grupy niebiałkowej, która uczestniczy w katalizowanej reakcji pełniąc rolę kosubstratu. Może być ona połączona z apoenzymem silnym wiązaniem kowalencyjnym i stanowi wtedy grupę prostetyczną enzymu lub wiązania są słabe i koenzym łatwo odłącza się od apoenzymu. W wiązaniu koenzymu z apoenzymem często uczestniczą kofaktory, które są jonami takich metali jak cynk, nikiel, żelazo, selen, miedz, mangan. Kofaktorami mogą być nukleotydy, np. ATP, CTP, UTP.

Budowa koenzymów jest różnorodna, bardzo wiele z nich zawiera w swoim składzie witaminę z grupy B. Są to: 1) tiamina (witamina B₁), 2) ryboflawina (witamina B₂), 3) niacyna (kwas nikotynowy, amid kwasu nikotynowego) (witamina B₃), 4) kwas pantotenowy (witamina B₅), 5) pirydoksyna, pirydoksal, pirydoksamina (witamina B₆ ), 6) biotyna (witamina H), 7) kobalamina (witamina B₁₂) oraz 8) kwas foliowy (kwas pteroiloglutaminowy). Ponieważ witaminy tej grupy są rozpuszczalne w wodzie, nadmiar ich jest wydalany z moczem. Z tych też przyczyn ich magazynowanie w ustroju jest ograniczone ( z wyjątkiem kobalaminy), co sprawia, że muszą być dostarczane regularnie. Wśród objawów chorobowych spowodowanych niedoborem wyżej wymienionych witamin są: a) choroba beri-beri (niedobór tiaminy), b) zajady, zapalenie języka, łojotok, światłowstręt (niedobór ryboflawiny), c) pelagra (niedobór niacyny), d) zapalenie nerwów obwodowych (niedobór pirydoksyny), e) niedokrwistość megaloplastyczna, acyduria metylomalonowa i niedokrwistość złośliwa (niedobór kobalaminy), f) niedokrwistość megaloplastyczna (niedobór kwasu foliowego).

Typ reakcji katalizowanej przez enzym stał się podstawą klasyfikacji enzymów. Zgodnie z tą zasadą Międzynarodowa Unia Biochemiczna dokonała podziału enzymów na sześć głównych klas, a każdy enzym uzyskał ściśle określający go numer klasyfikacyjny.

Oksydoreduktazy (pierwsza klasa enzymów) katalizują reakcje utleniania i redukcji, w tym włączanie tlenu do jakiejś cząsteczki. Do tej klasy należą takie grupy enzymów jak: dehydrogenazy, reduktazy, peroksydazy, oksydazy. Niektóre z nich wymagają do swojego działania koenzymów (np. NAD⁺, NADP⁺, NADPH+H⁺, FAD). Ogólna reakcja katalizowana przez oksydoreduktazy: A^- + B → A + B^-.

Transferazy (druga klasa) katalizujące reakcje, w których dochodzi do przeniesienia jakiejś grupy z jednego substratu na drugi. Niektóre transferazy wymagają do swojego działania koenzymów (np. fosforanu pirydoksalu, pirofosforanu tiaminy). Do tej klasy należą takie grupy enzymów jak: aminotransferazy, acylotransferazy, kinazy (fosfotransferazy).

Ogólna reakcja katalizowana przez transferazy: A + B -X → A-X + B.

Hydrolazy (trzecia klasa enzymów) katalizują reakcje hydrolizy, nie wymagają do swojego działania koenzymów. Większość enzymów tej klasy charakteryzuje się niską specyficznością substratową, skierowaną w stosunku do typu hydrolizowanego wiązania. Do tej klasy należą np.: glikozydazy, esterazy, peptydazy.

Ogólna reakcja katalizowana przez hydrolazy: A-B + H₂O → A-OH + BH.

Liazy (czwarta klasa) katalizują reakcje niehydrolitycznego rozpadu wiązań lub syntezy, która przebiega bez dostarczenia energii z rozpadu ATP. Należą tu takie grupy enzymów jak: syntazy, dekarboksylazy.

Ogólna reakcja katalizowana przez liazy: A-B ↔ A + B.

Izomerazy (piąta klasa) katalizują reakcje izomeryzacji: A-B-C ↔ A-C-B. Należą tu między innymi: mutazy, epimerazy, racemazy.

Ligazy (szósta klasa) przeprowadzają reakcje syntezy wiązań, które wymagają energii najczęściej z rozkładu ATP: A + B + ATP → A-B + ADP + P_i. Syntetazy i karboksylazy to grupy enzymów należące do tej klasy.

Jednostki aktywności enzymatycznej

Jednostka aktywości enzymatycznej (U) jest to ilość enzymu katalizująca przekształcenie jednego mikromola substratu w ciągu jednej minuty w warunkach optymalnych dla danego enzymu.

Jeden katal (kat) jest to aktywność katalityczna powodująca przekształcenie jednego mola substratu w ciągu jednej sekundy w warunkach optymalnych dla danego enzymu.

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

Doświadczenie składa się z dwóch etapów : z wyznaczenia krzywej wzorcowej do oznaczania cukrów redukujących wobec nadmiaru sacharozy oraz z wyznaczanie stałej Michaelisa dla inwertazy metodą ustalonego czasu. (Z wyznaczonej krzywej wzorcowej będzie można odczytać ilość mikromoli cukrów redukujących powstałych z hydrolizy sacharozy pod wpływem inwertazy drożdżowe).

1. Wyznaczanie krzywej wzorcowej do oznaczania cukrów redukujących wobec nadmiaru sacharozy

Zasada metody

Glukoza redukuje kwas 3,5-dinitrosalicylowy do barwnego związku, który wykazuje maksimum absorbancji przy długości fali 550 nm, a sama utlenia się do kwasu glukonowego. Reakcja przeprowadzana jest w środowisku zasadowym, w którym formy pierścieniowe monocukrów przekształcają się w formy łańcuchowe. Fruktoza również pośrednio powoduje powstanie pomarańczowego zabarwienia, ponieważ w środowisku zasadowym może przekształcić się w aldozę na skutek tautomerycznych przekształceń cząsteczki.

Absorbancja kolejnych prób o wzrastającym stężeniu cukrów redukujących będzie proporcjonalnie również wzrastać, co należy przedstawić w postaci krzywej wzorcowej. Wartości absorbancji wyznaczyć na osi rzędnych, a ilość μmoli cukrów redukujących w próbie na osi odciętych.

Odczynniki

1. Roztwór wzorcowy (0,005 mol/dm³ glukoza, 0,005 mol/dm³ fruktoza).

2. 1 mol/dm³ roztwór sacharozy.

3. 0,25 mol/dm³ bufor octanowy pH 4,7.

4. Odczynnik dinitrosalicylowy (1% kwas 3,5-dinitrosalicylowy, 1,6% NaOH, 30% winian sodowo-potasowy).

Wykonanie doświadczenia

Tabela 1

Nr probówki	1	2	3	4	5	6
	Ilości dodawanych odczynników w cm^3
Roztwór wzorcowy	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0	-
Woda	0,8	0,6	0,4	0,2	-	1,0
1 mol/dm^3 roztwór sacharozy	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
0,25 mol/dm^3 bufor octanowy pH 4,7	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Ilość μmoli cukrów redukujących w próbie	2	4	6	8	10	-

1. Do 6 probówek skalowanych na 10 cm³ dodać odczynniki według tabeli 1.

2. Do wszystkich probówek dodać po 2 cm³ odczynnika dinitrosalicylowe go,dokładnie wymieszać.

3. Probówki wstawić na 10 minut do wrzącej łaźni wodnej.

4. Probówki wyjąć z łaźni, oziębić i uzupełnić wodą do 10 cm³.

5. Dokonać pomiaru absorbancji przy długości fali 550 nm wobec próby ślepej (probówka 6).

6. Na papierze milimetrowym sporządzić wykres zależności absorbancji od ilości μmoli cukrów redukujących w próbie.

2. Wyznaczanie stałej Michaelisa dla inwertazy metodą ustalonego czasu

Inwertaza (sacharaza, β-fruktofuranozydaza) należy do klasy hydrolaz, katalizuje reakcję hydrolizy sacharozy na fruktozę i glukozę (Rys. 3 ).

Hydroliza sacharozy połączona jest z inwersją, czyli zmianą kierunku skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego. Roztwór sacharozy skręca płaszczyznę światła spolaryzowanego w prawo, roztwór glukozy również w prawo (+52,5⁰), a roztwór fruktozy w lewo (-92⁰). Powstała w wyniku hydrolizy sacharozy równo molowa mieszanina glukozy i fruktozy skręca płaszczyznę światła spolaryzowanego w lewo i nazywana jest cukrem inwertowanym.

Zasada metody

Stałą Michaelisa wyznacza się doświadczalnie z pomiarów szybkości reakcji przy różnych stężeniach początkowych substratu. Do określenia szybkości reakcji wykorzystuje się metodę kolorymetryczną oznaczania ilości powstającego produktu - glukozy. Metoda ta wykorzystuje właściwości redukujące glukozy (sacharoza jest dwucukrem, który tych właściwości nie posiada).Szybkość reakcji w opisanym poniżej doświadczeniu to przyrost ilości cukrów redukujących powstałych w jednakowym, ustalonym czasie inkubacji każdej próbki.

Odczynniki

1. 1 mol/dm³ roztwór sacharozy.

2. 0,25 mol/dm³ bufor octanowy pH 4,7.

3. Odczynnik dinitrosalicylowy (1% kwas 3,5-dinitrosalicylowy, 1,6% NaOH, 30% winian sodowo-potasowy).

4. Roztwór inwertazy.

Uwaga! 1 mol/dm³ roztwór sacharozy należy przygotowywać zawsze na świeżo przed każdym doświadczeniem.

Wykonanie doświadczenia

Tabela 2

Nr probówki	1 1'	2 2'	3 3'	4 4'	5 5'	6 6'
	Ilości dodawanych odczynników w cm^3
1 mol/dm^3 roztwór sacharozy	0,05	0,1	0,2	0,4	0,6	1,0
Woda	0,95	0,9	0,8	0,6	0,4	-
Bufor octanowy pH 4,7	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
St. początkowe sacharozy	0,011	0,033	0,066	0,133	0,20	0,333

1. Przygotować 12 probówek skalowanych na 10 cm³ i oznaczyć je od 1 do 6 i od 1' do 6'.

2. Dodać odczynniki według tabeli 2, zawartość probówek dokładnie wymieszać.

3. Do probówek od 1' do 6' dodać po 1,5 cm³ wody.

4. Do probówek od 1 do 6 dodać po 1,5 cm³ roztworu inwertazy w odstępach co 30 sekund (1,5 cm³ enzymu dodać do probówki 1, po 30 sekundach dodać 1,5 cm³ roztworu enzymu do probówki 2, po dalszych 30 sekundach do probówki 3, itd.). Po dodaniu enzymu zawartość probówek wymieszać.

5. Dokładnie po 5 minutach od chwili dodania enzymu, do każdej probówki (1-6) dodać co 30 sekund (w podany powyżej sposób) po 2 cm³ odczynnika dinitrosalicylowego.

6. Do probówek od 1' do 6' dodać również po 2 cm³ odczynnika dinitrosalicylowego.

7. Zawartość wszystkich probówek dokładnie wymieszać i ogrzewać przez 10 minut we wrzącej łaźni wodnej.

8. Probówki ochłodzić, uzupełnić wodą do 10 cm³.

9. Dokonać pomiaru absorbancji prób od 1 do 6 przy długości fali 550 nm wobec prób ślepych (probówki od 1' do 6'). Wyniki zapisać w zeszycie.

10. Na podstawie otrzymanych wyników absorbancji odczytać z wykonanej krzywej wzorcowej (doświadczenie 1) ilości μmoli cukrów redukujących w próbie. Jest to ilość powstającego produktu, który przy stosowaniu stałego czasu inkubacji jest miarą szybkości reakcji.

11. Na papierze milimetrowym narysować:

1. wykres zależności szybkości reakcji-v (μmole/5 min) od początkowego stężenia sacharozy-substratu (mol/dm³). Na podstawie wykresu odczytać wartość K_m.

2. wykres zależności 1/v od 1/s. Na podstawie wykresu obliczyć wartość K_m.

GLIKOGEN

ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA

1. Struktura glikogenu.

2. Synteza i rozpad glikogenu (reakcje wzorami i enzymy). Hormony

regulujące te procesy.

3. Rola glikogenu wątrobowego i mięśniowego.

4. Metody izolowania i oznaczania procentowej zawartości glikogenu w

wątrobie.

WPROWADZENIE

Glikogen jest zapasowym materiałem energetycznym zwierząt i człowieka. Jest to rozgałęziony homoglikan, zbudowany z jednostek α,D-glukopiranozowych, które są połączone dwoma typami wiązań glikozydowych: α-1,4 i występującym średnio co dziewięć reszt glukozowych wiązaniem α-1,6.

Glikogen jest magazynowany głównie w wątrobie i mięśniach. Ilość glikogenu w wątrobie dochodzi do 6-8% masy tego narządu, natomiast w mięśniach jego zawartość może wynosić 0,7%. Jednak mięśnie, z powodu dużej masy, zawierają 3-4-krotnie większy zapas glikogenu niż wątroba. Rezerwa glukozy znajdująca się w glikogenie wątrobowym służy do utrzymywania odpowiedniego stężenia tego związku we krwi w przerwach między posiłkami. Prawidłowe stężenie glukozy we krwi waha się niewielkich granicach i wynosi 3,9-6,1 mmola/dm³ (70-110 mg/100 cm³). Zapas glikogenu zgromadzony w wątrobie wystarcza na uzupełnianie stężenia glukozy przez 12-16 godzin.

Utrzymywanie stałego stężenia glukozy we krwi jest niezwykle istotne dla organizmu. Glukoza stanowi podstawowe źródło energii dla większości tkanek. Ciągłe dostarczanie glukozy jest konieczne do sprawnego funkcjonowania układu nerwowego i erytrocytów, dla których glukoza jest jedynym materiałem energetycznym. Neurony nie katabolizują kwasów tłuszczowych i przy normalnej diecie glukoza jest głównym źródłem energii potrzebnej do podtrzymania procesów życiowych tkanki nerwowej. Już poniżej stężenia 70 mg glukozy na 100 cm³ pojawiają się pierwsze objawy hipoglikemii jak np.: senność, drażliwość, bóle głowy i poczucie głodu. Przy bardzo niskim stężeniu glukozy we krwi występuje zaburzenie czynności mózgu, które może doprowadzić do śpiączki a nawet zgonu.

W stanach przedłużonego głodzenia lub przy braku węglowodanów w pożywieniu większość energii niezbędnej dla życia neuronów pochodzi z katabolizmu tzw. ciał ketonowych - acetooctanu i 3-hydroksymaślanu, których synteza nasila się w tych warunkach. Związki te są także metabolizowane przez inne tkanki z wyłączeniem wątroby i krwinek czerwonych. Jednak podczas głodzenia stężenie glukozy nie powinno spadać znacznie poniżej dolnych granic normy. Niezbędna ilość glukozy wytwarzana jest wtedy na drodze glukoneogenezy - syntezy glukozy z substancji niewęglowodanowych.

Glikogen zmagazynowany w mięśniach nie służy utrzymywaniu stałego stężenia glukozy we krwi, a jedynie dostarcza energii w trakcie przedłużonego skurczu mięśnia. Po 12-18 godzinach głodzenia wątroba zostaje niemal zupełnie pozbawiona glikogenu, natomiast zapas glikogenu w mięśniach zmniejsza się po długotrwałym, intensywnym wysiłku.

Syntezę glikogenu katalizują dwa enzymy z klasy transferaz. Syntaza glikogenowa, która tworzy wiązania α-1,4-glikozydowe i enzym rozgałęziający (amylo[α-1→4]→[α-1→6]-transglukozydaza), który syntetyzuje wiązania α-1,6-glikozydowe. Syntaza glikogenowa może jedynie wydłużać już istniejący łańcuch. Do rozpoczęcia reakcji potrzebny jest inicjator, białko - glikogenina. Dodatkowy enzym, glukozylotransferaza, przyłącza kolejno do grupy -OH specyficznej reszty seryny w tym białku kilka reszt glukozy, łącząc je wiązaniami α-1,4- glikozydowymi. Właściwa reakcja katalizowana jest przez syntazę glikogenową. Substratem do syntezy glikogenu jest UDP-glukoza (Rys. 1).

Gdy łańcuch zostanie przedłużony, do co najmniej 11 reszt glukozowych, wówczas enzym rozgałęziający przenosi część łańcucha z jednego rozgałęzienia na inne, tworząc wiązanie α-1,6 glikozydowe i ustanawiając w ten sposób nowy punkt rozgałęzienia. Powstaje cząsteczka bardzo rozgałęziona. Zwiększenie liczby nieredukujących zakończeń łańcuchów glukozowych umożliwia przyśpieszenie zarówno syntezy glikogenu, jak i jego rozkładu na drodze fosforolizy.

Głównym enzymem przeprowadzającym rozpad glikogenu (glikogenolizę) jest fosforylaza glikogenowa, należąca do klasy transferaz. Enzym ten przy udziale ortofosforanu prowadzi fosforolizę glikogenu od nieredukujących zakończeń cząsteczki tworząc glukozo-1-fosforan.

glikogen_{(n reszt glukozy)} + P_i → glikogen_{(n-1 reszt glukozy)} + glukozo-1-fosforan

Fosforylaza glikogenowa rozłącza tylko wiązania α-1,4-glikozydowe, degradując stopniowo łańcuchy glukozowe, aż do miejsc oddalonych o cztery reszty glukozowe od punktu rozgałęzienia, stworzonego za pomocą wiązania α-1,6. Następnie bifunkcyjny enzym odgałęziający, α-[1→4]→[1→4]-transferaza glukanowa przenosi fragment trzech reszt glukozy na łańcuch główny. W ten sposób odsłania się miejsce odgałęzienia. Hydrolityczny rozkład wiązań α-1,6 zachodzi przy udziale drugiej aktywności enzymu bifunkcyjnego, tzn. amylo-α-[1→6]-glukozydazy, która uwalnia wolną glukozę.

Glukozo-1-fosforan, będący produktem działania fosforylazy, zostaje przekształcony w glukozo-6-fosforan za pomocą fosfoglukomutazy.

Dalsze losy glukozo-6-fosforanu zależą od rodzaju tkanki. W wątrobie występuje enzym fosfataza glukozo-6-fosforanowa, przekształcająca glukozo-6-fosforan w glukozę. Tylko wolna glukoza może być przenoszona przez błonę komórkową; dokonuje tego znajdujący się w błonie komórkowej układ transportujący. Rozkład glikogenu wątrobowego powoduje wzrost stężenia glukozy we krwi.

W mięśniach nie występuje fosfataza glukozo-6-fosforanowa i brak tego enzymu uniemożliwia przekształcenie glukozo-6-fosforanu do wolnej glukozy. Uwolniony glukozo-6-fosforan służy jako materiał energetyczny wykorzystywany podczas skurczu mięśnia.

Rozkład i synteza glikogenu zależy głównie od wpływu hormonów. Kontrolę nad tworzeniem i rozkładem glikogenu prowadzą przede wszystkim dwa hormony- glukagon i insulina. Glikogenolizę w mięśniach i wątrobie może także wywołać hormon stresu - adrenalina.

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

1. Wyznaczanie krzywej wzorcowej do oznaczania glukozy w glikogenie oraz w zadaniu indywidualnym

Zasada metody

Glukoza posiada właściwości redukujące i w środowisku zasadowym redukuje odczynnik dinitrosalicylowy, sama zaś utlenia się do kwasu glukonowego. Odczynnik dinitrosalicylowy po redukcji zmienia barwę z żółtej na pomarańczową o maksimum absorbancji mierzonej kolorymetrycznie przy długości fali 550 nm. Powstałe zabarwienie roztworu jest proporcjonalne do ilości glukozy w próbce.

Odczynniki

1. 0,01 mol/ dm³ roztwór glukozy.

2. 0,05 mol/dm³ bufor fosforanowy pH 6,9.

3. Odczynnik dinitrosalicylowy (1% kwas 3,5-dinitrosalicylosalicylowy, 1,6% NaOH, 30% winian sodowo-potasowy).

Wykonanie doświadczenia

1. Do 9 probówek skalowanych na 10 cm³ dodać kolejno odczynniki według tabeli.

2. Po dodaniu odczynników zawartość probówek dobrze wymieszać.

3. Probówki ogrzewać przez 10 minut we wrzącej łaźni wodnej.

4. Po wyjęciu z łaźni probówki oziębić, uzupełnić wodą do 10 cm³, wymieszać.

5. Dokonać pomiarów absorbancji przy długości fali 550 nm, wobec próby ślepej (probówka nr 7).

6. Sporządzić wykres zależności absorbancji od ilości μmoli glukozy w próbie - krzywa wzorcowa.

7. Odczytać z krzywej wzorcowej ilość μg glukozy w 1 cm³ zadania

- probówki 1-6 służą do wyznaczenia krzywej wzorcowej do oznaczania glukozy

- probówka 7 - ślepa próba

- probówka 8, 9 - zadanie ilościowe indywidualne dla każdego studenta

Nr probówki	1	2	3	4	5	6	7	8, 9
	Ilości dodawanych odczynników w cm^3
Zadanie	-	-	-	-	-	-	-	1
H2O	1,8	1,6	1,4	1,2	1,0	0,8	2,0	1
0,01 mol/ dm^3roztwór glukozy	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0	1,2	-	-
Bufor fosforanowy	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Odczynnik dinitro-salicylowy	2	2	2	2	2	2	2	2
μmole glukozy w próbie	2	4	6	8	10	12	-	?

2. Izolowanie glikogenu z wątroby zwierzęcej.

Zasada metody

Wiązania glikozydowe występujące w glikogenie są oporne na działanie hydrolityczne jonów OHˉ w podwyższonej temperaturze. W wysokiej temperaturze w środowisku zasadowym wiązania peptydowe białek, estrowe lipidów i fosfodiestrowe kwasów rybonukleinowych ulegają hydrolizie. W wyniku ogrzewania tkanki w roztworze KOH otrzymuje się roztwór glikogenu zanieczyszczony innymi wielocukrami, fragmentami zdenaturowanego DNA oraz związkami małocząsteczkowymi, które znajdowały się w tkance lub powstały na skutek hydrolizy. Dodanie alkoholu etylowego powoduje wytrącenie glikogenu, który jest w niewielkim stopniu zanieczyszczony zdenaturowanym DNA i wysokocząsteczkowymi heteroglikanami, które również strącają się w tych warunkach.

Odczynniki

1. 30% roztwór KOH.

2. 96% etanol.

3. NaCl in subst.

Wykonanie doświadczenia

1. Jeden gram wątroby umieścić w probówce wirówkowej zawierającej 2,5 cm³ 30% roztworu KOH. Probówkę zatkać korkiem z chłodniczką zwrotną i wstawić na 30 minut do wrzącej łaźni wodnej, wstrząsać, co kilka minut.

2. Po całkowitym rozpuszczeniu tkanki, probówkę wyjąć z łaźni, oziębić i dodać 4,5 cm³ 96% etanolu, dobrze wymieszać.

3. Probówkę ponownie zatkać korkiem z chłodniczką zwrotną i wstawić do gorącej łaźni wodnej (uwaga - nie odparowywać alkoholu, wyjąć natychmiast po osiągnięciu wrzenia).

4. Po ostudzeniu wytrącony osad glikogenu odwirować (5 min, 3000 obr./min).

5. Płyn znad osadu zlać, osad rozpuścić w 3 cm³ wody (mieszać bagietką)

6. Wytrącić glikogen przez dodanie 6 cm³ 96% etanolu (zawartość probówki dobrze wymieszać bagietką). Jeśli osad nie ulegnie wytrąceniu należy dodać kilka kryształków NaCl, zamieszać i wstawić na chwilę do ciepłej łaźni wodnej

7. Wytrącony glikogen odwirować jak poprzednio, płyn znad osadu ostrożnie wylać.

8. Osad osuszyć przez postawienie probówki do góry dnem na bibule

9. Osad rozpuścić w 10 cm³ wody destylowanej.

10. Powstały opalizujący roztwór używać do dalszych oznaczeń.

3. Hydroliza kwaśna glikogenu. Oznaczanie zawartości procentowej glikogenu w wątrobie na podstawie ilości uwolnionej glukozy.

Zasada metody

Glikogen ulega hydrolizie w 100⁰ C w środowisku silnie kwaśnym, gdyż w tych warunkach wiązania glikozydowe ulegają rozpadowi. Jeśli hydroliza będzie prowadzona przez odpowiednio długi okres czasu to cała ilość glikogenu ulegnie rozkładowi do wolnej glukozy. Na podstawie ilości uwolnionej glukozy można wyliczyć zawartość procentową glikogenu w wątrobie.

Odczynniki

1. 2 mol/dm³ roztwór HCl.

2. 1,2 mol/dm³ roztwór NaOH .

3. Odczynnik dinitrosalicylowy (1% kwas 3,5-dinitrosalicylosalicylowy, 1,6% NaOH, 30% winian sodowo-potasowy).

4. 0,05 mol/dm³ bufor fosforanowy pH 6,9.

Wykonanie doświadczenia

1. Otrzymany w doświadczeniu 2 roztwór glikogenu rozcieńczyć dwukrotnie: pobrać 5 cm³, dodać 5 cm³ wody i dokładnie wymieszać.

2. Przygotować dziesięć skalowanych probówek.

3. Do probówek 1-9 odmierzyć po 0,4 cm³ rozcieńczonego dwa razy roztworu glikogenu, do probówki nr 10 dodać 0,4 cm³ wody (próba ślepa).

4. Do wszystkich probówek dodać po 0,6 cm³ 2 mol/dm³ roztworu HCl i zanotować czas (t₀).

5. Zawartość probówki nr 1 i 10 natychmiast zobojętnić przez dodanie 1 cm³ 1,2 mol/dm³ roztworu NaOH.

6. Pozostałe probówki (2-9) wstawić do wrzącej łaźni wodnej.

7. Probówki od numeru 2 do 8 wyjmować z łaźni w odstępach co cztery minuty, a zawartość ich, natychmiast po wyjęciu, zobojętnić dodając 1cm³ 1,2 mol/dm³ roztworu NaOH.

8. Probówkę nr 9 wyjąć z łaźni po 40 minutach, następnie zobojętnić, jak poprzednio.

9. Do wszystkich probówek dodać po 0,5 cm³ 0,05 mol/dm³ buforu fosforanowego pH 6,9 w celu wyrównania we wszystkich probówkach wartości pH.

10. Dodać do wszystkich probówek 2 cm³ odczynnika dinitrosalicylowego. Zawartość probówek dobrze wymieszać i wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 10 minut.

11. Następnie probówki wyjąć, ochłodzić i uzupełnić do 10 cm³ wodą destylowaną, ponownie wymieszać.

12. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 550 nm, wobec próby ślepej (probówka nr 10).

13. Z krzywej wzorcowej do oznaczania glukozy (doświadczenie nr 1), odczytać ilość μmoli glukozy.

14. Sporządzić wykres zależności ilości μmoli uwolnionej glukozy od czasu trwania hydrolizy kwaśnej glikogenu.

15. Obliczyć ilość μg glukozy uwolnionej podczas całkowitej hydrolizy próbki glikogenu i obliczyć zawartość procentową glikogenu w wątrobie. Należy uwzględnić wszystkie stosowane rozcieńczenia preparatu glikogenu uzyskanego z jednego grama tkanki i ilość oznaczonej glukozy pomnożyć przez 0,9, aby uwzględnić fakt, że ze 162 g glikogenu powstaje 180 g glukozy (162:180).

Hemoglobina, produkty przemiany hemoglobiny metabolizm żelaza, ELEKTROFOREZA BIAŁEK

ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA

1. Transport O₂ i CO₂ przez hemoglobinę (Hb).

2. Katabolizm hemu, bilirubina wolna i związana.

3. Białka transportujące i magazynujące jony żelaza.

4. Metody wykorzystywane do oznaczania bilirubiny, Hb i żelaza.

5. Elektroforeza białek w żelu poliakryloamidowym.

WPROWADZENIE

Hemoglobina

Hemoglobina jest hemoproteiną zbudowaną z czterech łańcuchów polipeptydowych, a każdy łańcuch połączony jest z cząsteczką hemu. Bierze ona udział w transporcie tlenu z płuc do tkanek i w pewnym stopniu także CO₂ z tkanek do płuc. W naczyniach włosowatych pęcherzyków płucnych, do jonów Fe²⁺ znajdujących się w grupie hemowej cząsteczki hemoglobiny, przyłączają się cztery cząsteczki tlenu (1 g Hb wiąże 1,36 cm³ tlenu); powstaje oksyhemoglobina - hemoglobina utlenowana. W krwi żylnej tlen odłącza się i dyfunduje do komórek różnych tkanek.

Do wolnych grup aminowych w części białkowej cząsteczki Hb może przyłączyć się CO₂; powstają karbaminiany hemoglobiny. W tej postaci transportowane jest około 20% CO₂.

Prawidłowa zawartość Hb w 100 cm³ krwi pełnej wynosi u mężczyzn 14-18 g, u kobiet 12-16 g, a u noworodków 18-27 g.

Bilirubina

Rozpad erytrocytów zachodzi w komórkach układu siateczkowo-śródbłonkowego, głównie wątroby, śledziony i szpiku kostnego. Tam też następuje przemiana hemu w bilirubinę. W pierwszym etapie tego procesu bierze udział zlokalizowana w mikrosomach oksygenaza hemowa, związana z mikrosomalnym łańcuchem transportu elektronów. Przy udziale O₂ i NADPH+H⁺ prowadzi ona hydroksylację węgla w grupie metinowej znajdującej się między dwoma pierścieniami pirolowymi i następnie jego usunięcie w postaci CO. W wyniku tego następuje rozerwanie układu porfirynowego i powstaje niebieskozielony barwnik - biliwerdyna, posiadająca czteropirolowy układ łańcuchowy. Następnie biliwerdyna redukuje się pod wpływem reduktazy biliwerdyny i powstaje pomarańczowożółta bilirubina, która dyfunduje do krwi.

Reakcja katalizowana przez reduktazę biliwerdyny:

biliwerdyna + NADPH + H⁺ → bilirubina + NADP⁺

Bilirubina jest związkiem trudnorozpuszczalnym, transportowanym do wątroby w połączeniu z albuminami. Jedna cząsteczka albuminy łączy się z dwoma cząsteczkami bilirubiny. Jest to tzw. bilirubina wolna, nazywana także bilirubiną pośrednią lub przedwątrobową. Określenie „bilirubina pośrednia” wynika z faktu, że może ona wejść w reakcję z diazowanym kwasem sulfanilowym (odczynnik do oznaczania steżenia bilirubiny) dopiero po jej oddysocjowaniu od albuminy. W warunkach fizjologicznych w osoczu występuje tylko bilirubina wolna a jej stężenie waha się w granicach 0,1-1,0 mg/100 cm³. Jest ona wychwytywana przez komórki wątroby; po odłączeniu albuminy zostaje przeniesiona do wnętrza hepatocytu.

W wątrobie słabo polarna cząsteczka bilirubiny ulega dalszym przemianom, które zwiększają jej rozpuszczalność i umożliwiają sekrecję do żółci.

1) 75% bilirubiny wchodzi w reakcję z UDP-glukuronianem i powstają diglukuronidy bilirubiny (kwas glukuronowy tworzy wiązanie estrowe z grupą karboksylową bilirubiny). Reakcja katalizowana jest przez UDP-glukuronozylotransferazę bilirubiny:

bilirubina + 2 UDP-glukuronian → diglukuronid bilirubiny + 2 UDP

2) 15% bilirubiny wchodzi w reakcję z aktywnym siarczanem (5` fosfosiarczanem 3` fosfoadenozyny), przy udziale sulfotransferazy ulega ona estryfikacji i tworzą się siarczany bilirubiny.

3) 10% bilirubiny tworzy połączenia z glicyną, tauryną i metioniną.

Powstające pochodne bilirubiny tworzą tzw. bilirubinę związaną, nazywaną także bilirubiną bezpośrednią lub wątrobową. W tej postaci bilirubina aktywnie wydzielana jest do żółci i wraz z nią przechodzi do przewodu pokarmowego, gdzie ulega dalszym przemianom pod wpływem flory bakteryjnej. W warunkach prawidłowych bilirubina związana nie występuje w osoczu. Dla odróżnienia obu postaci bilirubiny (tzn. wolnej i związanej) wykonuje się odczyn van den Bergha. Dodatni wynik tej próby wskazuje na obecność we krwi bilirubiny związanej.

Stężenie bilirubiny w osoczu przekraczające 1 mg/100 cm³ oznacza bilirubinemię. Umiarkowany wzrost stężenia bilirubiny nie zawsze jest zjawiskiem patologicznym. U 5-7% populacji stwierdza się nieznaczną bilirubinemię bez towarzyszących zmian patologicznych.

Hiperbilirubinemia może być spowodowana upośledzeniem sprzęgania bilirubiny w wątrobie lub zaczopowaniem przewodów żółciowych, a także wytwarzaniem większej ilości bilirubiny niż jest w stanie wydzielić do przewodów żółciowych prawidłowo funkcjonująca wątroba. Przy stężeniu bilirubiny w osoczu przekraczającym 2-2,5 mg/100 cm³ dyfunduje ona do tkanek dając obraz kliniczny określany mianem żółtaczki. Oznaczanie stężenia bilirubiny w osoczu (pośredniej i bezpośredniej) ma duże znaczenie w diagnozowaniu żółtaczek. Wzrost stężenia bilirubiny przedwątrobowej (pośredniej) towarzyszy żółtaczce noworodków. Przyczyną tego stanu jest nadmierna hemoliza erytrocytów oraz niezdolność wątroby do skutecznego sprzęgania i wydzielania zwiększonej ilości bilirubiny. Stan taki uznaje się za fizjologiczny. Jednak, gdy stężenie bilirubiny wolnej u noworodków wzrośnie powyżej 20 mg/100 cm³ może ona przekraczać barierę krew-mózg. Następstwem tego stanu jest kernicterus - żółtaczka jąder podstawnych mózgu, prowadząca do upośledzenia umysłowego.

Przyczyną podwyższonego stężenia bilirubiny przedwątrobowej może być też niedokrwistość hemolityczna, a także dziedziczne zaburzenia sprzęgania bilirubiny w wątrobie spowodowane brakiem lub poważnymi niedoborami UDP-glukuronozylotransferazy bilirubiny (zespół Criglera-Najjara, typ I, typ II). Umiarkowanie podwyższone stężenie bilirubiny wolnej (1,2-3,0 mg/100 cm³) występuje też o osób dotkniętych zespołem Gilberta, obejmującym 3-10% populacji. Spowodowane jest to upośledzeniem wychwytu bilirubiny przez wątrobę lub znacznie częściej niedoborem UDP-glukuronozylotransferazy bilirubiny. Obecność dwu dodatkowych nukleotydów (TA) w regionie promotora genu tego enzymu powoduje jego obniżoną ekspresję.

Podwyższony poziom bilirubiny wolnej może być też spowodowany uszkodzeniem miąższu wątroby, powstałym w następstwie: wirusowego zapalenia wątroby, marskości wątroby, zatruć (chlorowcopochodnymi węglowodorów, α-amanityną), długotrwałego przyjmowania hepatotoksycznych leków. Takim stanom na ogół towarzyszy upośledzenie wydzielania do żółci sprzężonej bilirubiny.

Pojawienie się bilirubiny sprzężonej w osoczu może być wynikiem defektu wydzielania bilirubiny do żółci (zespół Dubina-Johnsona), ale przede wszystkim wskazuje na niedrożność przewodów żółciowych. Przyczyną niedrożności może być kamica żółciowa, nowotwór lub zwężenie przewodów żółciowych.

Hiperbilirubinemia spowodowana wzrostem stężenia bilirubiny sprzężonej wiąże się z obecnością bilirubiny w moczu (bilirubinuria), podczas gdy wolna bilirubina (skompleksowana z albuminą) nigdy nie pojawia się w moczu.

Metabolizm żelaza

Żelazo odgrywa zasadniczą rolę w metabolizmie energetycznym żywej komórki, biorąc udział w utlenianiu substancji organicznych. Znaczenie biologiczne tego pierwiastka warunkują jego dwie podstawowe własności.

1. Istnienie dwóch trwałych stanów wartościowości - Fe²⁺ i Fe³⁺ - co umożliwia udział w reakcjach utleniania i redukcji.

2. Zdolność tworzenia trwałych kompleksów z wieloma związkami o bardzo różnorodnej strukturze.

Jony żelaza mogą być składnikiem hemoprotein, gdzie wbudowane są w pierścień protoporfiryny, albo mogą występować w postaci związków niehemowych. Do hemoprotein należy szereg enzymów biorących udział w procesach utleniania i redukcji (np. cytochromy, oksydaza cytochromowa, katalaza, peroksydaza) oraz białka przenoszące tlen (hemoglobina i mioglobina). Do białek niehemowych należą: białko transportujące żelazo - transferyna, białka magazynujące żelazo - ferrytyna i hemosyderyna, a także szereg enzymów np. dehydrogenaza bursztynianowa, oksydaza ksantynowa, hydroksylaza fenyloalaninowa i inne.

Całkowita ilość żelaza w organizmie dorosłego mężczyzny o masie 70 kg wynosi około 3,8 g (u dorosłej kobiety o zbliżonej masie ciała jest nieco mniejsza): w hemoglobinie znajduje się około 2,5 g (65%), w ferrytynie i hemosyderynie około 1,0 g (25%), w mioglobinie i enzymach około 0,3 g (8%) i w transferynie 3-4 mg.

Żelazo zawarte w osoczu stanowi bardzo małą część całkowitej ilości żelaza w organizmie. Obrót metaboliczny żelaza jest bardzo szybki. W czasie 1 sekundy 3 miliony krwinek czerwonych ulega zniszczeniu; większość uwalnianego żelaza wraca do szpiku i jest wbudowywana w cząsteczki hemoglobiny.

Transferyna jest β₁-globuliną osocza o masie cząsteczkowej około 80000. Cząsteczka apotransferyny ma zdolność do przyłączenia dwóch jonów Fe³⁺ w obecności HCO₃^-. Powstały kompleks ma budowę: transferyna - (Fe³⁺)₂ - (HCO₃^-)₂. W warunkach prawidłowych transferyna jest wysycona żelazem w około 30%.

Ferrytyna jest to rozpuszczalne w wodzie połączenie apoferrytyny z Fe³⁺. Cząsteczka apoferrytyny (m. cz. około 430000 - 480000) jest białkiem zbudowanym z 20-24 podjednostek. Wewnątrz części białkowej znajduje się około 4000-5000 atomów Fe w postaci hydroksyfosforanów żelazowych. Całkowicie wysycona żelazem cząsteczka ferrytyny zawiera 17-23% żelaza. W warunkach prawidłowych ferrytyna występuje w bardzo małych ilościach w surowicy krwi - 12-250 μg/dm³.

Dzienne wydalanie żelaza jest bardzo małe: 0,5 - 1,0 mg (przez nerki, jelito grube, w wyniku złuszczania nabłonków). W warunkach prawidłowych powinna istnieć równowaga pomiędzy wydalaniem i wchłanianiem żelaza. Dieta dzienna zawiera średnio od 10 do 15 mg żelaza, z tego wchłaniane jest 5-10%, czyli około 1 mg. Stany, które wymagają większego zapotrzebowania na żelazo, np. przewlekłe krwawienia, ciąża, wzrost organizmu, stosunkowo łatwo naruszają stan równowagi i doprowadzają do utajonego niedoboru żelaza, tzn. do obniżenia jego zawartości w magazynach. Oznaczanie stężenia żelaza w surowicy nie jest dobrym wskaźnikiem dla oceny stanu magazynów.

W warunkach prawidłowych stężenie żelaza w surowicy wynosi około 120 μg/100 cm³.

Elektroforeza białek w żelu poliakryloamidowym

Mianem elektroforezy określa się wędrówkę cząsteczek obdarzonych ładunkiem w polu elektrycznym. Proces ten może przebiegać zarówno w roztworze elektrolitu bez udziału nośnika (wysokorozdzielcza elektroforeza kapilarna), jak i w różnego rodzaju nośnikach, takich jak: żel agarozowy czy też poli-akryloamidowy.Ze względu na bardzo wysoką rozdzielczość żelu poliakryloamidowego oraz łatwość standaryzacji procedury, elektroforezę białek najczęściej przeprowadza się w tym nośniku. Żel poliakrylo-amidowy powstaje podczas polimeryzacji akryloamidu i tworzącego z nim wiązania poprzeczne N,N'-metylenobis-akryloamidu. Rolę katalizatorów w procesie polimeryzacji pełni zazwyczaj nadsiarczan amonu i N,N,N',N'-tetrametyle-no-etylenodiamina (TEMED). Zmieniając stężenie akryloamidu oraz stosunek akryloamidu do N,N'-mety-leno-bis-akrylo-amidu można otrzymać żele o różnej wielkości porów, mające zastosowanie do frakcjonowania białek w szerokim przedziale mas cząsteczkowych. Przykładowo, w 15% żelu poliakryloamidowym najlepiej rozdzielają się białka o masach cząsteczkowych w zakresie 15-45 kDa, podczas gdy żel 7,5% stosuje się do rozdziału białek o masach cząsteczkowych 30-120 kDa.

Metody elektroforetyczne znajdują zastosowanie zarówno jako techniki analityczne (np. badanie czystości wyizolowanego białka, wyznaczanie masy cząsteczkowej) jak i preparatywne (np. wydzielenie jednego z białek ze złożonej mieszaniny).

Głównym czynnikiem powodującym rozdzielenie białek umieszczonych w polu elektrycznym są różnice ładunku elektrycznego pomiędzy poszczególnymi rodzajami cząsteczek (elektroforeza bez nośnika, np. kapilarna). W elektroforezach żelowych dochodzi dodatkowy parametr różnicujący ruchliwość badanych białek. Struktura żelu spełnia rolę sita, które łatwiej przepuszcza cząsteczki o mniejszych rozmiarach; w tych warunkach ruchliwość elektroforetyczna będzie zależała nie tylko od ładunku, ale i od masy cząsteczkowej oraz kształtu badanych białek. W konsekwencji, podczas elektroforezy w warunkach, w których nie dochodzi do denaturacji, cząsteczki białek o różnej wielkości mogą mieć taką samą ruchliwość elektroforetyczną.

Często stosowaną metodą frakcjonowania białek jest elektroforeza w żelu poliakryloamidowym zawierającym anionowy detergent - sól sodową siarczanu dodecylu (SDS). SDS wykazuje bardzo wysokie powinowactwo do białek. Zastosowany w stężeniu 0,1% całkowicie wysyca łańcuchy polipeptydowe, przyłączając się w ilości jednej cząsteczki detergentu na dwie reszty aminokwasowe. Interakcja białka z SDS powoduje jego denaturację; dochodzi do zniszczenia wszystkich niekowalencyjnych wiązań w cząsteczce białka i rozfałdowania cząsteczki. Ponieważ każda cząsteczka SDS wnosi jeden ładunek ujemny, wobec tego polipeptyd o masie cząsteczkowej 40000 (zbudowany z około 360 aminokwasów) będzie miał w przybliżeniu 180 ładunków ujemnych, a więc wielokrotnie więcej niż może występować w cząsteczce białka w środowisku bliskim obojętnemu. W konsekwencji, wszystkie białka skompleksowane z SDS migrują w kierunku anody, z szybkością odwrotnie proporcjonalną do logarytmu ich masy cząsteczkowej. Przeprowadzając elektroforezę białek wzorcowych (o znanych masach cząsteczkowych) i badanego białka, można w przybliżeniu określić jego masę cząsteczkową. W tym celu należy sporządzić wykres zależności pomiędzy względną ruchliwością elektroforetyczną (R_f) białek wzorcowych, a logarytmem ich mas cząsteczkowych.

Jak pokazano na rysunku 1, taka zależność jest prostoliniowa. Znając wartość R_f badanego białka, z wykresu można odczytać wartość logarytmu jego masy cząsteczkowej. R_f wyznacza się ze stosunku drogi, jaką od początku żelu rozdzielczego przebyło białko, do drogi przebytej przez barwnik wskaźnikowy (błękit bromofenolowy).

Układ elektroforetyczny z SDS ma też dodatkowe zalety. Niektóre białka (np. błonowe) są bardzo trudno rozpuszczalne lub nierozpuszczalne w roztworach buforowych o niskiej sile jonowej, w jakich prowadzona jest elektroforeza i dodatek SDS umożliwia ich rozpuszczenie.

Inną metodą elektroforetyczną pozwalającą na frakcjonowanie białek jest ogniskowanie izoelektryczne. Ten rodzaj elektroforezy przeprowadza się w żelu poliakryloamidowym, w którym w wyniku elektroforezy amfoterycznych związków buforowych określanych mianem amfolitów (są nimi izomery i homologi kwasów poliaminopolikarboksy­lowych), zostaje wytworzony gradient pH. Po wprowadzeniu do takiego żelu innych cząsteczek o charakterze amfoterycznym, tj. białek, będą one wędrowały do stref, w których wartość pH odpowiada ich punktom izoelektrycznym. Ponieważ w tym miejscu ich sumaryczny ładunek elektryczny wynosi zero, migracja zakończy się. Zastosowanie tej techniki pozwala na rozdzielenie białek, dla których różnice wartości pH_i są rzędu 0,005 jednostki pH.

Pojedynczy prążek obserwowany na elektroforegramie nie wskazuje w sposób jednoznaczny na obecność w tym miejscu jednego rodzaju polipeptydów. Frakcjonując mieszaninę białek w żelu zawierającym SDS, może się zdarzyć, że kilka z nich ma identyczną lub bardzo podobną masę cząsteczkową, a zatem będą wędrowały jako pojedyncze pasmo. Podobnie, w żelu zawierającym amfolity, różne białka mające taki sam punkt izoelektryczny będą nierozróżnialne. Dlatego zawsze dla potwierdzenia jednorodności badanego białka, należy je analizować w kilku układach elektroforetycznych lub stosować elektroforezy dwukierunkowe, w których w każdym kierunku o sposobie frakcjonowania decyduje inny czynnik różnicujący np. w pierwszym kierunku punkt izoelektryczny, a w drugim masa cząsteczkowa.

Po przeprowadzonej elektroforezie należy uwidocznić rozdzielone białka. Opracowano bardzo wiele metod pozwalających na detekcję cząsteczek białkowych w żelu poliakryloamidowym. Najczęściej stosowane techniki można podzielić na cztery grupy.

1. Zastosowanie barwników wykazujących wysokie powinowactwo do białek

Rozfrakcjonowane białka można w prosty sposób uwidocznić poprzez 0,5 - 2 godzinną inkubację żelu w roztworze odpowiednich barwników. Czas barwienia zależy od stopnia usieciowania żelu; penetracja barwnika w mocno usieciowanym żelu zachodzi wolniej niż w słabo usieciowanym. Często stosowana kąpiel barwiąca zawiera błękit Coomassie lub czerń amidową, rozpuszczone w roztworze alkoholu etylowego lub metylowego z dodatkiem kwasu octowego. Alkohol pełni podwójną rolę; umożliwia rozpuszczenie barwników (są słabo rozpuszczalne w wodzie), a ponadto powoduje wytrącenie białka w żelu, co zapobiega jego dyfuzji, a więc poszerzaniu i rozmywaniu się uwidocznionych pasm białkowych. Nadmiar niezwiązanego z białkiem barwnika usuwa się poprzez płukanie żelu w roztworze o podobnym składzie jak barwiący, ale niezawierającym barwnika. Ten sposób detekcji charakteryzuje się średnią czułością i pozwala na uwidocznienie około 1-10 μg białka w pojedynczym prążku.

2. Metody fluorescencyjne

Wyższą czułość niż konwencjonalne metody barwienia (błękit Coomassie) oferują techniki fluorescencyjne. Dodatkową zaletą tej grupy metod jest możliwość śledzenia wędrówki wyznakowanych cząsteczek białkowych pod lampą UV, gdyż wiele znaczników fluorescencyjnych można skompleksować z białkiem przed elektroforezą. Pozwala to zakończyć rozdział w najdogodniejszym momencie. U podstaw luminescencji, w tym również fluorescencji leży wzbudzenie atomów lub cząsteczek. Fluorescencja obserwowana jest wówczas, gdy elektron przechodzi bezpośrednio ze stanu wzbudzonego do stanu o niższej energii. Wiele związków absorbuje promieniowanie ultrafioletowe i daje fluorescencję przy wyższych długościach fal. Można również sporządzić fluoryzujące pochodne wielu makromolekuł. Do często stosowanych znaczników fluorescencyjnych, pozwalających na uwidocznienie białka w żelu należą: chlorek dansylu, aldehyd o-ftalowy i fluoreskamina. Chlorek dansylu (długość fali absobancji (λ_A) = 335 nm; długość fali emisji (λ_E) = 500 nm) łączy się z N-końcową grupą aminową w cząsteczce białka oraz z ε-aminowymi grupami lizyny, zgodnie z reakcją przedstawioną na rysunku 2.

3. Znakowanie białek izotopami promieniotwórczymi

Najwyższą czułość detekcji można uzyskać znakując białka przed elektroforezą izotopami promieniotwórczymi. Często stosowanymi znacznikami są ¹²⁵J (okres połowicznego rozpadu 60 dni) i ³²P (okres połowicznego rozpadu 14 dni).

Jedna z częściej stosowanych metod jodowania polega na utlenieniu jonu jodkowego (w Na¹²⁵J) do jodu atomowego, które przeprowadza się najczęściej przy pomocy chloraminy T w obecności białka - akceptora jodu. Powstający jod atomowy przyłącza się do obecnych w cząsteczkach białka reszt tyrozylowych zgodnie z przedstawioną reakcją (Rys. 3).

Znakowanie białek ³²P przeprowadza się enzymatycznie, najczęściej przy udziale serynowo-treoninowych kinaz białek (transferaz), które przenoszą skrajną resztę fosforanową z γ³²P-ATP na grupę -OH akceptorowego aminokwasu (seryny lub treoniny) (Rys. 4). Znakowanie enzymatyczne obok wielu zalet, wnosi jednak pewne ograniczenia, związane z dużą na ogół specyficznością stosowanych kinaz. W związku z tym niektóre białka, pomimo obecności w ich cząsteczkach reszt serylowych i treonylowych, nie ulegają fosforylacji przy udziale niektórych kinaz. Przykładowo, najlepiej jak dotąd poznana kinaza białek A, aktywowana w obecności cAMP, efektywnie estryfikuje grupy -OH reszt serylowych i treonylowych tylko w przypadku, gdy po ich N-końcowej stronie występuje para aminokwasów zasadowych, oddzielona od reszty akceptorowej aminokwasem obojętnym, zazwyczaj alaniną (Z-Z-Ala-Ser/Thr; Z-aminokwas zasadowy - lizyna lub arginina). Po elektroforezie wyznakowanych w ten sposób białek, w celu ich uwidocznienia wykonuje się autoradiogram; obraz białek rozfrakcjonowanych w żelu zostaje odwzorowany na błonie rentgenowskiej.

4. Metody srebrowe

Rozpowszechnione są też srebrowe metody detekcji białek w żelach poliakryloamidowych. Ich największe zalety to wysoka czułość (opisano techniki pozwalające wykryć kilka femtogramów białka), wyeliminowanie izotopów promieniotwórczych i prostota wykonania. Zasada metody polega na skompleksowaniu rozfrakcjonowanych białek z jonami srebra (wiązanie jest niespecyficzne) i redukcji tych jonów do srebra metalicznego po uprzednim odmyciu nadmiaru niezwiązanych soli srebrowych.

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

1. Oznaczanie bilirubiny całkowitej w surowicy i w zadaniu

Zasada metody

Słabe wiązania między cząsteczkami bilirubiny i białka ulegają rozpadowi w obecności kofeiny. W środowisku zasadowym bilirubina pod wpływem diazowanego kwasu sulfanilowego przechodzi w barwnik azowy dzięki czemu możemy

ocenić jej stężenie, posługując się metodą kolorymetryczną. Wymaga to uprzedniego przygotowania krzywej wzorcowej, określającej zależność absorbancji od stężenia bilirubiny.

Materiał i odczynniki

1. Wzorcowe roztwory bilirubiny - 1 mg/100 cm³, 2 mg/100 cm³, 3 mg/100 cm³,

(bilirubina rozpuszczona jest w roztworze zawierającym 0,06% NaHCO₃, 0,3%

NaCl, 70% etanol).

2. Odczynnik kofeinowy (5% kofeina, 7,5% benzoesan sodu, 12,5% octan sodu).

3. Odczynnik diazo I (0,5% kwas sulfanilowy, 2% HCl).

4. Odczynnik diazo II (0,1% roztwór NaNO₂).

5. Odczynnik Fehlinga II (5% NaOH, 1,65% winian sodowo-potasowy).

6. Surowica krwi.

Wykonanie doświadczenia

Bezpośrednio przed oznaczeniem przygotować odczynnik diazowy przez zmieszanie diazo I i diazo II w stosunku 10 : 0,3.

1. Przygotować 7 ponumerowanych probówek:

2. Do trzech dodać po 2 cm³ roztworu bilirubiny o stężeniu: 1 mg/100 cm³, 2 mg/100 cm³ i 3 mg/100 cm³ - krzywa wzorcowa.

3. Do probówki czwartej - 2 cm³ wody - próba ślepa.

4. Do piątej - 2 cm³ surowicy

5. Do szóstej i siódmej - po 2 cm³ zadania.

6. Do wszystkich probówek dodać po 3 cm³ odczynnika kofeinowego i 1 cm³ odczynnika diazowego, wymieszać.

7. Po 10 minutach dodać po 2 cm³ odczynnika Fehlinga II, wymieszać.

8. Odstawić na 10 minut (ciemność).

9. Zawartość probówek przesączyć.

10. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 600 nm.

11. Wykreślić krzywą wzorcową

12. Stężenie bilirubiny w surowicy i zadaniu odczytać z krzywej wzorcowej.

2. Badanie bilirubiny bezpośredniej wg Hejmansa van den Bergha

Materiał i odczynniki

1. Odczynnik diazo I ( 0,5% kwas sulfanilowy, 2% HCl).

2. Odczynnik diazo II (0,1% roztwór NaNO₂).

3. Surowica krwi.

Wykonanie doświadczenia

Do 2-4 kropli surowicy dodać 1-2 krople odczynnika diazowego uprzednio przygotowanego do ćw. 1.

1. Jeżeli w ciągu 30 sekund powstanie czerwonofioletowe zabarwienie, to wynik interpretujemy jako odczyn bezpośredni, dodatni, natychmiastowy (obecność bilirubiny związanej).

2. Jeżeli w ciągu 30 sekund nie pojawi się zabarwienie, lecz wystąpi później, np. po upływie 10 minut, jest to odczyn bezpośredni, dodatni, opóźniony (obecność bilirubiny związanej w małym stężeniu).

3. Jeżeli w ciągu 30 minut nie powstanie zabarwienie jest to odczyn bezpośredni, ujemny (brak bilirubiny związanej).

3. Oznaczanie hemoglobiny (Hb)

Zasada metody

Hemoglobina i niektóre jej pochodne są utleniane przez K₃[Fe(CN)₆] do methemoglobiny, a następnie przekształcane pod wpływem KCN w trwały związek cyjanmethemoglobinę, której natężenie barwy mierzymy kolorymetrycznie przy przy długości fali 540 nm i obliczamy stężenie Hb stosując podany poniżej wzór.

Materiał i odczynniki

1. Odczynnik Drabkina (0,03% K₃[Fe(CN)₆], 0,1% NaHCO₃, 0,005% KCN).

2. Krew.

Wykonanie doświadczenia

1. Do 5 cm³ odczynnika Drabkina dodać 0,025 cm³ krwi.

2. Po upływie 10 minut odczytać absorbancję wobec odczynnika Drabkina (ślepa próba) przy długości fali 540 nm.

Obliczenia

A_bad × 64400 × 201

Hb (g/100 cm³ krwi) = __________

44 × 10 × 1000

201 - rozcieńczenie krwi = 5,025 : 0,025

64400 - masa molowa Hb (g/mol)

44 - milimolowy współczynnik absorbancji przy λ = 540 nm

(jest to absorbancja jaką wykazuje roztwór o stężeniu 1 mmol/dm³ i grubości warstwy 1 cm)

dzielnik 10 - wynika z przeliczenia z 1 dm³ na 100 cm³

dzielnik 1000 - wynika z przeliczenia z milimoli na mole

4. Oznaczanie żelaza w surowicy i w zadaniu

Zasada metody

Siarczyn sodu redukuje Fe³⁺ do Fe²⁺ a w obecności 2,2'-dipirydylu (w środowisku kwaśnym) powstaje związek kompleksowy o czerwonofioletowym zabarwieniu. Natężenie barwy jest proporcjonalne do ilości żelaza w próbie. Do wytrącenia zdenaturowanych białek stosowany jest chloroform. Aby określić stężenie żelaza w badanej próbie (surowicy/zadaniu) należy równolegle przeprowadzić doświadczenie z roztworem wzorcowym, o znanym stężeniu Fe³⁺ i porównać absorbancje obu roztworów.

Materiał i odczynniki

1. 0,1 mol/dm³ roztwór Na₂SO₃ .

2. Odczynnik dipirydylowy (0,1% 2,2`-dipirydyl w 3% roztworze CH₃COOH).

3. Chloroform.

4. Roztwór wzorcowy Fe³⁺ o stężeniu 100 µg Fe/100 cm³.

5. Surowica krwi.

Wykonanie doświadczenia

1. Przygotować 5 ponumerowanych probówek.

1-Próba właściwa - odmierzyć 2 cm³ surowicy

2-Próba wzorcowa - 2 cm³ roztworu wzorcowego Fe³⁺.

3-Próba ślepa - 2 cm³ H₂O.

4, 5-Zadanie na zaliczenie: po 2 cm³ zadania.

2. Do wszystkich probówek dodać po 2 cm³ 0,1 mol/dm³ roztworu Na₂SO₃ oraz po 2 cm³ 0,1% odczynnika dipirydylowego, wymieszać

3. Wstawić probówki na 5 minut do wrzącej łaźni wodnej.

4. Probówki oziębić.

5. Do próby właściwej (probówka 1) dodać 2 cm³ chloroformu. Wstrząsać 30 sekund.

6. Zawartość probówki przelać do probówki wirówkowej i wirować (5 minut/3000 obr./min). Jeżeli warstwa górna (wodna) lub dolna (chloroformowa) jest mętna należy wirowanie powtórzyć.

7. Górną warstwę zebrać ostrożnie pipetą, przenieść do kuwety i zmierzyć absorbancję przy 520 nm wobec ślepej próby (3).

8. Zmierzyć absorbancję zadania (probówki 4,5) i próby wzorcowej (probówka 2) wobec próby ślepej (probówka 3). (W próbach 2, 3 i 4 nie ma białka, więc niepotrzebne było dodawanie chloroformu i wirowanie).

Obliczenia:

A _{zad (sur)}

μg Fe/100 cm³ zadania (surowicy krwi) = ────── × stężenie wzorca

A _wz

5. Przeprowadzenie elektroforezy białek w żelu poliakryloamidowym zawierającym SDS

Celem doświadczenia jest wyznaczenie mas cząsteczkowych badanych białek oraz zapoznanie się z dwoma sposobami detekcji białka w żelu (barwienie białek błękitem Coomassie, technika fluorescencyjna).

Elektroforezę przeprowadza się w dwuwarstwowym żelu poliakryloamidowym. Górną warstwę stanowi krótki, słabo usieciowany żel zagęszczający, a dolną żel rozdzielczy.

Odczynniki

1. Żel poliakryloamidowy do frakcjonowania białek. Żel zagęszczający zawiera 6% akryloamid, 0,3% N,N'-metyleno-bis-akryloamid, 0,1% SDS, 0,025% TEMED, 0,025% nadsiarczan amonu oraz 0,125 mol/dm³ Tris-HCl, pH 6,8. Żel rozdzielczy zawiera 12% akryloamid, 0,24% bisakryloamid, 0,1% SDS, 0,025% TEMED, 0,025% nadsiarczan amonu oraz 0,75 mol/dm³ Tris-HCl, pH 8,8.

2. Bufor elektrodowy o składzie: 0,1% SDS, 0,05 mol/dm³ Tris, 0,38 mol/dm³ glicyna, pH 8,3.

Białka przeznaczone do elektroforezy:

a) albumina i lizozym wyznakowane fluorescencyjnie chlorkiem dansylu,

b) mieszanina białek wzorcowych. Białka związane są ze znacznikiem - niebieskim barwnikiem, umożliwiającym obserwowanie ich wędrówki podczas elektroforezy (prestained kit for molecular weights firmy Sigma). Mieszanina wzorców zawiera:

α₂-makroglobulinę osocza ludzkiego (180 kDa),

β-galaktozydazę z E. coli (116 kDa),

fosfofruktokinazę z mięśni królika (84 kDa),

kinazę pirogronianową z mięśni kurczęcia (58 kDa),

fumarazę z serca świni (48 kDa),

dehydrogenazę mleczanową z mięśni królika (36,5 kDa),

izomerazaę triozofosforanową z mięśni królika (26 kDa),

c) białka badane, skompleksowane z barwnikiem (prestained kit for molecular weights firmy Sigma). Należy określić ich masę cząsteczkową. Każdy zespół otrzymuje inne białko do analizy.

Wszystkie próbki białek zostały wymieszane w stosunku 1:1 z buforem do nanoszenia próbek, zawierającym: 0,125 mol/dm³ Tris-HCl, pH 6,8, 4% SDS, 30% glicerol, 5% β-merkaptoetanol oraz 0,01% błękit bromofenolowy i ogrzewane przez 3 minuty we wrzącej łaźni wodnej. Rolą glicerolu jest zwiększenie gęstości roztworu, co umożliwia naniesienie próbek na żel. β-merkaptoetanol niszczy mostki dwusiarczkowe, zatem wraz z SDS powoduje zniszczenie struktury trzeciorzędowej polipeptydu. Jeśli białko złożone jest z kilku polipeptydów połączonych wiązaniami dwusiarczkowymi, to pod wpływem β-merkaptoetanolu rozpadnie się na podjednostki. Błękit bromofenolowy wyznacza linię frontu w elektroforezie. Ponieważ żaden polipeptyd nie przemieszcza się w polu elektrycznym szybciej niż barwnik, pozwala on ocenić, kiedy należy zakończyć elektroforezę, aby nie dopuścić do wyjścia z żelu białek o największej ruchliwości elektroforetycznej (jest to istotne przy przeprowadzaniu elektroforezy białek niezawierających barwnych lub fluorescencyjnych znaczników).

Wykonanie doświadczenia

1. Napełnić buforem elektrodowym górną i dolną komorę aparatu do elektroforezy.

2. Usunąć "grzebień" z żelu poliakryloamidowego.

3. Nanieść pipetą automatyczną próbki białek przeznaczone do elektroforezy.

4. Połączyć aparat do elektroforezy z zasilaczem. W żelu zawierającym SDS białka będą wędrowały od katody do anody. Podczas migracji barwnika (błękit bromofenolowy) przez żel zagęszczający (górna, około 2 cm warstwa żelu) napięcie powinno wynosić 100 V, a po wejściu barwnika w żel rozdzielczy należy je zwiększyć do 160 V.

5. W trakcie ćwiczeń można obserwować przebieg elektroforezy, ponieważ wszystkie białka związane są ze znacznikiem (niebieskim barwnikiem lub chlorkiem dansylu). Po zakończeniu elektroforezy i obejrzeniu wyniku pod lampą UV należy wyznaczyć wartości R_f białek wzorcowych i badanych (tylko skompleksowanych z barwnikiem) a następnie sporządzić wykres zależności R_f od logarytmu masy cząsteczkowej białek wzorcowych i na podstawie wykresu wyznaczyć masę cząsteczkową badanych białek.

6. Po wyznaczeniu wartości R_f,_, żel należy umieścić w roztworze barwiącym o składzie: 0,1% błękit Coomassie, 50% metanol, 12% kwas octowy i pozostawić w tym roztworze na 2 godziny. Wybarwione żele będą udostępnione do oglądania na następnych ćwiczeniach.

PRODUKTY PRZEMIANY AZOTOWEJ ORAZ LIPIDY OSOCZA

ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA

1. Powstawanie kwasu moczowego i jego rola w organizmie człowieka.

2. Synteza mocznika (reakcje i enzymy).

3. Metabolizm kreatyny (reakcje i enzymy).

4. Rola cholesterolu w organizmie człowieka.

5. Frakcje lipoproteinowe surowicy i ich rola.

6. Metody wykorzystywane do oznaczania w surowicy krwi stężenia kwasu moczowego, kreatyniny, mocznika i cholesterolu. Prawidłowe stężenia tych związków we krwi.

WPROWADZENIE

Kwas moczowy

Kwas moczowy jest końcowym produktem katabolizmu zasad purynowych w organizmie człowieka. Nukleotydy w komórkach ulegają stałym przemianom. Związki te są rozkładane za pomocą enzymów, a także ulegają samorzutnemu rozpadowi na skutek wpływu środowiska.

Nukleotydazy rozkładają hydrolitycznie nukleotydy do nukleozydów. Z nukleozydów fosforylazy nukleozydowe uwalniają wolne zasady i rybozo-1-fosforan. Większość uwolnionych zasad purynowych zostaje ponownie użyta do tworzenia nukleotydów na drodze rezerwowych szlaków metabolicznych.

Niewielka część uwolnionych zasad ulega przekształceniu do kwasu moczowego i jest wydalana z moczem.

Główne szlaki metaboliczne przemiany AMP i GMP prowadzące do utworzenia kwasu moczowego nieco się różnią. Katabolizm AMP rozpoczyna deaminaza AMP:

AMP + H₂O → IMP + NH₃

IMP i GMP są substratami dla 5' nukleotydazy, która przekształca je w nukleozydy.

IMP + H₂O → inozyna + P_i

GMP + H₂O → guanozyna P_i

Następnie nukleozydy są rozkładane za pomocą fosforylazy nukleozydów purynowych.

inozyna + P_i → hipoksantyna + rybozo-1-fosforan

guanozyna + P_i → guanina + rybozo-1-fosforan

Guanina pod wpływem hydrolazy - guanazy (deaminazy guaninowej) przekształcana jest do ksantyny.

guanina + H₂O → ksantyna + NH₃

Hipoksantyna i ksantyna są przekształcane w kwas moczowy przy udziale oksydazy ksantynowej.

hipoksantyna → ksantyna→ kwas moczowy

Mechanizm tej reakcji jest złożony, enzym do swojego działania wymaga udziału O₂, FAD, jonów molibdenu i żelaza. Jeden atom tlenu cząsteczkowego, utleniacza w obu reakcjach, zostaje dołączony do pierścienia puryny, drugi zaś zostaje zredukowany do H₂O_2. Nadtlenek wodoru następnie jest rozkładany przez katalazę do H₂O i O_2.

Przyłączenie tlenu do pierścienia puryny powoduje zwiększenie polarności, a zatem zwiększa rozpuszczalność związku w wodzie. Jednak kwas moczowy jest nadal związkiem trudno rozpuszczalnym. Lepiej rozpuszczalne są jego sole - moczany, które tworzą się w pH obojętnym i zasadowym. Kryształy moczanów wytrącają się w roztworach przekraczających stężenie 7 miligramów tego związku na 100 cm³ wody. Dlatego też znaczna część moczanów w osoczu zaadsorbowana jest na albuminach, co przeciwdziała ich wytrącaniu.

Prawidłowe stężenie kwasu moczowego (głównie w postaci moczanów) we krwi dorosłych kobiet wynosi od 2 do 6 mg/100 cm³, u mężczyzn od 3 do 7,5 mg/100 cm³. Stężenie kwasu moczowego w osoczu zależy także od diety, niższe stężenia tego związku występują u ludzi stosujących dietę wegetariańską.

W ciągu doby organizm zdrowego, dorosłego człowieka wytwarza przeciętnie od 400 do 800 miligramów kwasu moczowego, który następnie jest wydalany z moczem.

Nadmierne jego wytwarzanie powoduje podwyższenie jego stężenia we krwi (hiperurykemia) i jest przyczyną zmian chorobowych, wywołanych przez wytrącanie się kryształów moczanu sodu szczególnie w stawach i nerkach. Choroba ta jest znana jako dna moczanowa. Większość ssaków przekształca dalej kwas moczowy do łatwo rozpuszczalnej substancji - alantoiny. Brak możliwości przekształcania kwasu moczowego do alantoiny jest jednak korzystnym czynnikiem selekcyjnym. Moczany bardzo łatwo się utleniają i są bardzo wydajną substancją usuwającą wysoce reaktywne, szkodliwe formy tlenu, np.: rodniki hydroksylowe, aniony ponadtlenkowe. Obecność moczanów w osoczu może wydatnie przyczyniać się do wydłużenia życia ludzkiego i do zmniejszenia zapadalności na choroby nowotworowe. Moczany jak również bilirubina są przykładami reguły, że niektóre produkty końcowe pochodzące ze szlaków metabolicznych odgrywają ważną rolę jako czynniki ochronne.

Mocznik

Mocznik powstaje w organizmie w tzw. cyklu mocznikowym. Związek ten pochodzi głównie z przemiany azotowej białek.

Podczas deaminacji aminokwasów tworzy się bardzo toksyczny amoniak. Powstaje on również w mniejszej ilości, w przemianach innych związków, np. nukleotydów purynowych i pirymidynowych oraz amin. Proces syntezy mocznika pełni ważną biologiczną rolę w przekształcaniu amoniaku w łatwo rozpuszczalny, nietoksyczny w stężeniach fizjologicznych związek, który następnie jest wydalany z moczem.

Zdrowy, dorosły człowiek, na prawidłowej diecie jest w stanie tzw. równowagi azotowej. Dobowa ilość azotu wydalana z organizmu jest równa ilości azotu przyjmowanego z pożywieniem. Przy spożyciu białka w ilości około 100 gramów na dobę wydalane jest 16 gramów azotu. 80 - 90% całkowitej puli wydalanego azotu stanowi mocznik. Ilość wytworzonego w organizmie dorosłego człowieka mocznika zależy głównie od zawartości białka w pożywieniu i przeciętnie wynosi od 20 do 40 g na dobę. Stężenie tego związku we krwi w warunkach prawidłowych waha się w szerokich granicach, od 20 do 40 mg/100 cm³, a nawet może osiągać 50 mg/100 cm³.

Synteza mocznika zachodzi wyłącznie w wątrobie. Amoniak łączy się z CO₂ tworząc karbamoilofosforan, reakcja ta wymaga udziału dwóch cząsteczek ATP, jako źródła energii. Karbamoilofosforan następnie reaguje z ornityną, tworząc cytrulinę. Cytrulina przy udziale energii pochodzącej z hydrolizy ATP kondensuje z asparaginianem, który jest dawcą drugiego atomu azotu. Powstały argininobursztynian ulega rozszczepieniu na argininę i fumaran. Arginina hydrolizuje dając mocznik i ornitynę, zamykając w ten sposób jeden obrót cyklu. Dwie pierwsze reakcje zachodzą w mitochondriach komórek wątroby, pozostałe trzy przebiegają w cytoplazmie.

Kreatynina

Kreatynina jest produktem degradacji kreatyny. Kreatyna występuje głównie w mięśniach i w postaci fosforanu jest magazynem energii. Cykl mocznikowy jest także punktem wyjścia do syntezy tego ważnego metabolitu. Arginina, metabolit cyklu mocznikowego, ulega w komórkach nerki kondensacji z glicyną. Powstaje guanidynooctan, który jest metylowany przez S-adenozylometioninę (SAM) do kreatyny. Kreatyna jest następnie fosforylowana za pomocą ATP i przechodzi w fosforan kreatyny, stanowiący zapas łatwo uruchamianej energii w mięśniu. Ostatni etap przemiany odbywa się bez udziału enzymów. W ciągu doby około 1,6% fosfokreatyny przekształca się w bezwodnik - kreatyninę (Rys. 2).

Kreatynina jest wydalana z moczem, przeciętnie od 1 do 1,8 gramów na dobę. Prawidłowe stężenie kreatyniny w surowicy wynosi u dorosłych kobiet od 0,5 do 1 mg/100 cm³, a u mężczyzn 0,6 - 1,2 mg/100 cm³. Znacznie niższe stężenie kreatyniny występuje u małych dzieci do trzech lat (0,2-0,4 mg/100 cm³). W miarę dorastania stężenie to stopniowo wzrasta, aby osiągnąć w wieku 17 lat wartości charakterystyczne dla ludzi dorosłych.Podwyższone stężenie kreatyniny we krwi może wystąpić w chorobach nerek, mięśni i zatruciach witaminą D.

Cholesterol

Cholesterol występuje we wszystkich komórkach organizmu, a zwłaszcza w tkance nerwowej i narządach miąższowych. Jest jednym z najważniejszych składników błon komórkowych i lipoprotein krwi. Występuje często w połączeniu z kwasami tłuszczowymi jako estry cholesterolu. Cholesterol jest także prekursorem hormonów steroidowych, witaminy D₃ oraz kwasów żółciowych, które są naturalnymi detergentami niezbędnymi przy trawieniu tłuszczów.

Jest on dobrze przyswajanym składnikiem pożywienia, znajduje się w pokarmach pochodzenia zwierzęcego. Związek ten jest także syntetyzowany z acetylo-CoA w cytoplazmie wielu tkanek, przede wszystkim w wątrobie. W ciągu dnia organizm człowieka traci około 1 grama cholesterolu, głównie w postaci kwasów żółciowych wydalanych z kałem oraz ze złuszczającymi się nabłonkami. Zwykle około połowy dziennego zapotrzebowania pochodzi z syntezy własnej, pozostała część cholesterolu jest dostarczana z pokarmem.

Cholesterol jest także czynnikiem patogennym. Jest on głównym składnikiem kamieni żółciowych i złogów miażdżycowych powodujących arteriosklerozę.

Cholesterol jako związek trudno rozpuszczalny jest transportowany we krwi za pomocą lipoprotein. Najwięcej cholesterolu i jego estrów z kwasami tłuszczowymi znajduje się we frakcji LDL, która stanowi przekształconą formę lipoproteiny typu VLDL. Obie te lipoproteiny pośredniczą w przenoszeniu tego związku do wielu tkanek.

Nadmiar cholesterolu jest ponownie odprowadzany do wątroby przez cząstki HDL i tam może być przekształcony w kwasy żółciowe. Lipoproteina HDL spełnia ważną rolę w tzw. odwróconym transporcie cholesterolu.

Nadmierne stężenie cholesterolu we krwi odgrywa decydującą rolę w procesach patologicznych towarzyszących powstawaniu miażdżycy. Wraz z rosnącym stosunkiem stężenia cholesterolu LDL do cholesterolu HDL nasilają się procesy miażdżycy. Stężenie HDL jest odwrotnie proporcjonalne do częstości występowania miażdżycy naczyń wieńcowych. Całkowite stężenie cholesterolu we krwi zwiększa się wraz z wiekiem i wynosi dla populacji ludzkiej średnio 3,9-7,2 mmola/dm³ (150 - 280 mg/100 cm³).

Stężenie cholesterolu we frakcji LDL uzależnione jest również od wieku. Górne granice zawartości cholesterolu frakcji LDL wynoszą 170 mg/100 cm³ (do 29 roku życia) i dochodzą do 210 mg/100 cm³ powyżej 50 lat. Stężenia cholesterolu HDL wahają się średnio w granicach 45 - 60 mg/100 cm³.

Górne wartości średniej zawartości cholesterolu LDL i całkowitego cholesterolu krwi dla populacji ludzkiej przekraczają zalecane normy dla tego związku.

Według The European Consensus Conference optymalne, całkowite stężenie cholesterolu w osoczu nie powinno przekraczać 200 mg/100 cm³, stężenie cholesterolu LDL powinno wynosić poniżej 135 mg/100 cm³, a stężenie cholesterolu HDL powinno być wyższe od 35 mg/100 cm³.

Obecnie uznaje się, że całkowite stężenie cholesterolu osocza przewyższające 240 mg/100 cm³ stanowi już poważne zagrożenie dla zdrowia człowieka.

Lipoproteiny osocza krwi

Lipidy nie rozpuszczają się w wodzie i w osoczu tworzą złożone cząstki zwane lipoproteinami. Frakcjami lipoprotein są: chylomikrony, lipoproteiny typu VLDL, LDL, IDL i HDL. Cząstki lipoprotein utworzone są z rozpuszczalnych w osoczu kompleksów białkowo-lipidowych. Na powierzchni lipoprotein znajdują się polarne grupy białek, fosfolipidów i cholesterolu, a we wnętrzu znajdują się apolarne rdzenie, złożone z estrów cholesterolu i triacylogliceroli.

Chylomikrony powstają w komórkach jelita i transportują głównie tłuszcze proste pochodzące z diety. Stanowią one średnio około 88% masy tej lipoproteiny. Chylomikrony także transportują wchłonięty z pożywienia cholesterol w postaci wolnej lub zestryfikowany kwasem tłuszczowym oraz witaminy rozpuszczalne w tłuszczach. Cząstki te posiadają białko apoB-48, integrujące całą cząstkę, białko apoE oddziałujące z receptorami znajdującymi się na powierzchni komórek oraz niewielkie domieszki innych białek.

Tłuszcze proste znajdujące się w lipoproteinach krwi rozkładane są przez lipazę lipoproteinową znajdującą się na powierzchni naczyń włosowatych.

Chylomikrony na skutek działania tego enzymu przekształcają się w tzw. ciałka resztkowe (remnanty) bogate w cholesterol, które są wychwytywane przez wątrobę za pomocą receptorów apoE lub LDL. Oczyszczanie krwi z chylomikronów jest szybkie, biologiczny czas półtrwania tych cząstek we krwi wynosi poniżej jednej godziny.

Frakcja lipoprotein typu VLDL powstaje głównie w wątrobie. Transportuje wytworzone w tym organie tłuszcze proste, fosfolipidy oraz cholesterol. Białkiem integrującym całość tej lipoproteiny jest apoB-100, występuje też białko receptorowe apoE i inne białka. Lipoproteiny tego typu są wychwytywane przez komórki za pomocą receptorów LDL i wprowadzane do ich wnętrza w wyniku endocytozy.

Lipoproteiny VLDL, również na skutek działania lipazy lipoproteinowej, stopniowo tracą tłuszcze proste przekształcając się w lipoproteiny o pośredniej gęstości - IDL. Lipoproteiny IDL następnie na skutek działania tego samego enzymu stają się lipoproteinami o małej gęstości - LDL.

Podstawowymi składnikami LDL są estry cholesterolu (około 48% masy lipoproteiny) i wolny cholesterol (10%). Lipoproteiny typu LDL na skutek utraty białka receptorowego apoE są bardzo źle wychwytywane przez komórki za pomocą receptorów LDL. Półokres trwania lipoproteiny LDL w osoczu w porównaniu z innymi lipoproteinami jest bardzo długi i wynosi ponad dwa dni. W tym czasie wiązania podwójne występujące w kwasach tłuszczowych lipidów LDL są atakowane przez tlen, co powoduje powstanie toksycznych, utlenionych pochodnych. Utlenione formy LDL mają tendencję do odkładania się w ścianach naczyń, tworząc złogi miażdżycowe.

Lipoproteiny o dużej gęstości - HDL powstają w wątrobie i w mniejszym stopniu w komórkach jelita. Są one odpowiedzialne za tzw. odwrócony transport cholesterolu z tkanek, złogów i innych lipoprotein do wątroby. Nadmiar cholesterolu z wątroby jest wydalany z żółcią w postaci wolnej lub po przekształceniu w sole kwasów żółciowych. Sole kwasów żółciowych i cholesterol są w dużej mierze wchłaniane przez komórki jelita i powracają ponownie do wątroby w krążeniu jelitowo-wątrobowym. Część kwasów żółciowych jest jednak wydalana z kałem, przeciętnie około jednego grama na dobę. Oznaczanie ilości poszczególnych frakcji lipoprotein, a także zawartości w nich cholesterolu, jest obecnie szeroko stosowane w diagnostyce laboratoryjnej. Wielu chorobom towarzyszą zmiany w składzie lipoprotein.

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

1. Oznaczanie kwasu moczowego w surowicy krwi i w zadaniu

Zasada metody

Kwas moczowy w środowisku alkalicznym redukuje sole kwasu fosforowolframowego do tlenków wolframu na niższym stopniu utlenienia, mających zabarwienie niebieskie, a sam utlenia się do alantoiny (Rys. 1). Natężenie powstałej barwy należy zmierzyć kolorymetrycznie po odbiałczaniu surowicy poprzez denaturację białek za pomocą soli metali ciężkich ( w tym przypadku jonów wolframu) i w zadaniu ilościowym indywidualnym dla każdego studenta (bez odbiałczania), a następnie obliczyć stężenie kwasu moczowego w surowicy i zadaniu przy znanym stężeniu wzorca i po zmierzeniu absorbancji wzorca).

Odczynniki

1. 10% roztwór wolframianu sodu.

2. 0,3 mol/dm³ roztwór H₂SO₄.

3. Wzorcowy roztwór kwasu moczowego o stężeniu 1 mg/100 cm³.

4. 10,3% roztwór Na₂CO₃.

5. Odczynnik fosforowolframowy (4% Na₂WO₄ x 2 H₂O w 3% roztworze H₃PO₄).

a) Odbiałczanie surowicy

Wykonanie doświadczenia

1. Do probówki odmierzyć 8 cm³ wody i 1 cm³ surowicy.

2. Dodać 0,5 cm³ 10% roztworu wolframianu sodu, a następnie 0,5 cm³ 0,3 mol/dm³ roztworu H₂SO₄ i dokładnie wymieszać.

3. Odstawić na 30 minut.

4. Odwirować (15 min, 3000 obr./min),

5. Do dalszych oznaczeń pobrać płyn znad osadu.

b) Oznaczenie ilościowe kwasu moczowego

Wykonanie doświadczenia

1. Przygotować 5 probówek.

1 -próba badana - odmierzyć 3 cm³ płynu znad osadu po odbiałczeniu surowicy

2 - próba wzorcowa - 3 cm³ roztworu wzorcowego kwasu moczowego.

3- próba ślepa - 3 cm³ wody.

4, 5 -zadanie ilościowe indywidualne dla każdego studenta - z otrzymanej próby pobrać po 3 cm³ zadania

2. Do wszystkich probówek dodać po 0,6cm³ 20 % roztworu węglanu sodu i wymieszać.

3. Następnie odmierzyć po 0,15 cm³ odczynnika fosforowolframowego, dokładnie wymieszać.

4. Odczytać absorbancję po 15 minutach, przy 610 nm wobec próby ślepej.

Uwaga: Jeśli w badanej próbce wytrącił się osad, należy przed pomiarem spektrofotometrycznym roztwór przesączyć.

Obliczenia:

Współczynnik 10 wynika z faktu, że surowica w trakcie doświadczenia została dziesięć razy rozcieńczona.

2. Oznaczanie mocznika w surowicy krwi metodą ureazową

Zasada metody

Mocznik ulega hydrolizie w reakcji katalizowanej przez ureazę (enzym pochodzenia cm³roślinnego lub bakteryjnego). Powstałe jony amonowe reagują z odczynnikiem Nesslera i tworzy się barwny produkt. Natężenie barwy należy zmierzyć kolorymetrycznie po odbiałczaniu surowicy poprzez denaturację białek za pomocą soli metali ciężkich (10% roztwór ZnSO₄.i 0,5 mol/dm³ roztwór NaOH.), a nastepnie obliczyć stężenie mocznika w surowicy (w mg/100 cm³ ).

Odczynniki

1. Roztwór ureazy z ziaren soi w buforze Tris-HCl o pH 7,4.

2. 10% roztwór ZnSO₄.

3. 0,5 mol/dm³ roztwór NaOH.

4. Wzorzec do oznaczania mocznika (roztwór NH₄Cl o stężeniu 1 mg N/100 cm³).

5. Odczynnik Nesslera (zasadowy roztwór K₂[HgJ₄]).

a) Odbiałczanie surowicy

Wykonanie doświadczenia

1. Do probówki wirówkowej odmierzyć 1 cm³ wody i 0,2 cm³ surowicy.

2. Następnie dodać 2 cm³ roztworu ureazy w buforze Tris-HCl, pH 7,4.

3. Probówkę zakryć parafilmem, wstawić do łaźni wodnej o temp. 37⁰ C i inkubować 20 minut.

4. Po inkubacji dodać 0,5 cm³ 10% roztworu ZnSO₄ i 0,3 cm³ 0,5 mol/dm³ roztworu NaOH w celu wytrącenia białek.

5. Zawartość probówki dokładnie wymieszać i odwirować (5 min, 3000 obr./min). Płyn znad osadu zdenaturowanych białek zlać do suchej probówki.

b) Oznaczenie ilościowe mocznika

Wykonanie doświadczenia

1. Przygotować trzy probówki.

1- próba badana - odmierzyć 2 cm³ płynu nadosadowego i 5 cm³ wody,

2- próba wzorcowa - dodać 1 cm³ roztworu wzorcowego i 6 cm³ wody

3. próba ślepa - 7 cm³ wody

2. Zawartość probówek wymieszać.

3. Do wszystkich trzech probówek dodać po 1 cm³ odczynnika Nesslera, wymie szać.

4. Absorbancję odczytać po 5 minutach, przy długości fali 470 nm, wobec próby ślepej.

Obliczenia

1 mg azotu odpowiada 2,14 mg mocznika (60:28, 60 - względna masa cząsteczkowa mocznika, 28 - względna masa cząsteczkowa azotu), współczynnik 10 wynika z rozcieńczenia surowicy - w końcowej objętości znajduje się 0,1 cm³ surowicy, a 1 cm³ wzorca.

3. Oznaczanie kreatyniny w surowicy krwi i w zadaniu

Zasada metody

Kreatynina z kwasem pikrynowym tworzy kompleks o zabarwieniu czerwonym. Natężenie powstałej barwy należy zmierzyć kolorymetrycznie po odbiałczaniu surowicy poprzez denaturację białek za pomocą soli metali ciężkich ( w tym przypadku jonów wolframu), i w zadaniu ilościowym indywidualnym dla każdego studenta (bez odbiałczania), a nastepnie obliczyć stężenie kreatyniny w surowicy i zadaniu.

[Reakcja jest mało swoista i w zależności od warunków (temperatura, czas inkubacji, pH środowiska) intensywność zabarwienia może zmieniać się nieproporcjonalnie. Rzeczywista zawartość kreatyniny w osoczu stanowi zwykle około 80% wartości oznaczanej tą metodą].

Odczynniki

1. 10% roztwór Na₂WO₄.

2. 0,3 mol/dm³ roztwór H₂SO_4,

3. 1 mol/dm³ roztwór NaOH.

4. 1,5% roztwór kwasu pikrynowego.

5. Wzorcowy roztwór kreatyniny o stężeniu 4 mg/ 100 cm³.

Wykonanie doświadczenia

a) Odbiałczanie surowicy

1. Do probówki wirówkowej pobrać 3 cm³ surowicy.

2. Dodać 1,5 cm³ 10% roztworu Na₂WO₄ i 1,5 cm³ 0,3 mol/dm³ roztworu H₂SO₄ celem zdenaturowania białek.

3. Dokładnie wymieszać.

4. Odstawić na 30 minut.

5. Odwirować (15 min, 4000 obr./min).

6. Płyn znad osadu zlać do suchej probówki.

b) Wykonanie oznaczenia ilościowego

1. Przygotować 5 probówek.

1 -próba badana - odmierzyć 2cm³ płynu znad osadu po odbiałczeniu surowicy

2 - próba wzorcowa - 1 cm³ roztworu wzorcowego kreatyniny i 1 cm³ wody.

3- próba ślepa - 2 cm³ wody.

4, 5 - zadanie ilościowe indywidualne - z otrzymanej próby pobrać po 1 cm³ zadania i dodać1 cm³ wody.

2. Do wszystkich probówek dodać po 1 cm³ 1,5% roztworu kwasu pikrynowego i 1 cm³ 1 mol/dm³ roztworu NaOH i wymieszać.

3. Odczytać po 15 min absorbancję przy 520 nm wobec próby ślepej.

Obliczenia

5. Rozdział lipoprotein surowicy ludzkiej w żelu poliakrylamidowym

Najłatwiej rozdzielić frakcje lipoproteinowe przy pomocy elektroforezy w żelu poliakryloamidowym lub agarozowym. Poszczególne frakcje uwidacznia się za pomocą barwienia odczynnikami lipofilnymi. Metoda elektroforezy w trzech warstwach żeli poliakryloamidowych o różnej gęstości umożliwia rozdział lipoprotein surowicy na cztery podstawowe klasy: chylomikrony, β (LDL), pre-β (VLDL), i α (HDL). Frakcje te są zbiorem cząstek o różnej masie, dlatego tworzą w żelu rozmyte pasma. Przy lepszych warunkach rozdziału można uzyskać w obrębie głównych frakcji więcej podfrakcji.

Do rozdziału lipoprotein zastosowano trójwarstwowy żel o rosnących stężeniach poliakrylamidu: 2,5%, 3,5% i 7%. W tych warunkach chylomikrony pozostają w pobliżu miejsca startu, β (LDL), i pre-β (VLDL) ze względu na wielkość swoich cząstek, nie przechodzą do warstwy 7% żelu i rozdzielają się w warstwie 3,5% żelu. VLDL jako kompleksy o większych rozmiarach wędrują wolniej, pozostając w tyle za LDL. Do żelu 7% wchodzą lipoproteiny typu HDL, które ze względu na złożony skład mogą następnie ulec dalszemu rozfrakcjonowaniu.

Odczynniki

1. 0,05 mol/dm³ roztwór Tris-HCl pH 8,3 - (w żelu i naczyniach do elektroforezy).

2. Warstwowy żel poliakryloamidowy o stężeniu 2,5%, 3,5% i 7%.

3. Surowica do rozdziału elektroforetycznego (do 0,3 cm³ surowicy krwi ludzkiej dodać 0,15 cm³ 1% roztworu czerni sudanowej B w glikolu etylenowym i pozostawić na 12 godzin w temperaturze 4⁰ C celem wybarwienia lipoprotein, następnie dodać 0,15 cm³ 20% roztworu sacharozy do obciążenia próbki).

Wykonanie doświadczenia

Studenci otrzymują aparat z żelem i przygotowane do rozdziału próbki surowicy. Surowicę w ilości od 50 do 75 l należy nanieść w odpowiednie otwory w żelu. Elektroforezę przeprowadzać przy napięciu 160 V i natężeniu prądu około 0,1 A. Lipoproteiny wędrują od katody do anody.

Cały czas należy utrzymywać możliwie niską temperaturę żelu, ponieważ lipoproteiny w wyższych temperaturach ulegają rozpadowi. W trakcie elektroforezy obserwować rozdzielanie się poszczególnych frakcji.

27

---