KWASY NUKLEINOWE I STRUKTURA
CHROMATYNY
ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA
1. Wzory zasad purynowych i pirymidynowych występujących w RNA i DNA, nukleozydów i nukleotydów (powtórzenie wiadomości omawianych w trakcie kursu chemii bioorganicznej).
2. Struktura oligonukleotydów (rybo- i 2'-deoksyrybo-), zapis pełny i skrócony.
3. Struktura nukleosomu, histony i ich rola w stabilizacji struktury nukleosomu.
4. Podstawowe cechy struktury RNA i DNA.
5. Metody wykorzystywane do izolowania i analizy DNA.
6. Podstawowe różnice pomiędzy organizacją genomu pro- i eukariotycznego.
WPROWADZENIE
Podstawowe cechy struktury DNA i RNA
DNA jest nośnikiem informacji genetycznej zarówno u Procariota i Eucariota, a także niektórych wirusów.
Pojedynczy łańcuch DNA składa się z czterech deoksyrybonukleozydów, wielokrotnie powtarzających się w różnych sekwencjach (dAMP, dGMP, dCMP, dTMP), połączonych wiązaniami 3’,5’ fosfodiestrowymi. Pierwszy deoksyrybonukleotyd łańcucha DNA posiada wolną resztę fosforanową w pozycji 5’; a ostatni ma wolną grupę 3’-hydroksylową deoksyrybozy. W rezultacie każdy łańcuch DNA wykazuje polarność budowy – koniec 5’ jest odmienny od końca 3’.
Watson i Crick w 1953 roku opublikowali trójwymiarowy model struktury DNA. Na podstawie badań rentgenograficznych przeprowadzonych przez Franklin i Wilkinsa ustalili, że DNA zbudowany jest z dwóch helikalnie splecionych nici. Dwa łańcuchy DNA są ułożone antyrównolegle względem siebie, jedna nić zorientowana jest w kierunku 5’→3’, a druga odwrotnie – 3’→5’. Zasady są skierowane do wnętrza helisy, a łańcuch cukrowo-fosforanowy znajduje się na zewnątrz. Pomiędzy zasadami znajdującymi się w przeciwległych łańcuchach tworzą się wiązania wodorowe. Adenina tworzy parę z tyminą łącząc się dwoma mostkami wodorowymi. Guanina łączy się z cytozyną za pomocą trzech mostków wodorowych. W centralnym obszarze helisy między parami zasad powstają oddziaływania typu asocjacji warstwowej.
Dwupasmowy DNA istnieje przynajmniej w sześciu formach (A-E i Z). W warunkach fizjologicznych występuje zwykle helikalna forma B, w której na pojedynczy skręt przypada około 10 par zasad (pz). Skok helisy wynosi 3,4 nm, a jej średnica 2 nm.
Cząsteczki DNA mogą osiągać znaczne rozmiary. Długość cząsteczki DNA wirusa polioma wynosi 1,7 μm (5100 pz), Escherichia coli – 1,36 mm (4,6 x 106 pz), w największym chromosomie Drosophila melanogaster - 2,1cm (6,2 x 107 pz). Sumaryczna długość genomu człowieka wynosi około 1 metra (3 x 109 pz). Najkrótsza cząsteczka chromosomowego DNA człowieka osiąga rozmiar 1,6 cm, a najdłuższa – około 8,4 cm.
Cząsteczki DNA ulegają w komórce niewielkim modyfikacjom. Ograniczają się one do metylacji grup aminowych adeniny i cytozyny.
Kwas rybonukleinowy jest polimerem rybonukleotydów. Cząsteczki RNA zawierają w różnych sekwencjach rybonukleotydy adeniny, guaniny, cytozyny i uracylu. W niektórych klasach RNA mogą występować inne zasady, które powstają na skutek modyfikacji potranskrypcyjnych. Rybonukleotydy połączone są wiązaniami fosfodiestrowymi analogicznie jak w DNA. RNA jest zazwyczaj pojedynczą cząsteczką. W obrębie nici często występują odcinki dwuniciowe. Tworzą je sekwencje zawierające komplementarne zasady ułożone w odwrotnej polarności. W związku z tym cząsteczki RNA posiadają zdolność przybierania skomplikowanych struktur. Dużym udziałem sparowanych fragmentów charakteryzują się cząsteczki rybosomowych RNA (rRNA) i transportujących RNA (tRNA), drugorzędową strukturę wykazują także eukariotyczne informacyjne RNA (mRNA). RNA ulega bardzo zróżnicowanym modyfikacjom po transkrypcji, co odzwierciedla różnorodność jego funkcji pełnionych w komórce.
W komórkach eukariotycznych występują w dużej ilości niewielkie cząsteczki RNA. Drobne jądrowe snRNA uczestniczą w procesie dojrzewania mRNA i regulacji ekspresji genów. Szereg niskocząsteczkowych RNA posiada aktywność katalityczną, są to rybozymy. RNA jest jednocześnie przenośnikiem informacji genetycznej i cząsteczką zdolną do katalizy. Powyższe fakty pozwoliły na postawienie hipotezy, że w ewolucji życia RNA pojawił się przed DNA i białkiem.
Zasadnicze cechy organizacji genomu eukariotycznego i prokariotycznego
W jądrze DNA jest upakowany w chromosomy. Każdy chromosom zawiera jedną długą, liniową, dwuniciową cząsteczkę DNA.
Chromosomowy DNA występuje w połączeniu z białkami, tworząc chromatynę. Wśród białek chromatyny wyróżniamy histony oraz liczną grupę białek, zwanych niehistonowymi. Białka niehistonowe pełnią rozliczne funkcje. Wśród nich wyróżniamy enzymy biorące udział w procesach zachodzących na terenie jądra, białka o charakterze regulatorowym jak np. receptory hormonów steroidowych, a także białka utrzymujące strukturę jądra.
Histony są typowymi białkami strukturalnymi, tworzącymi zrąb chromatyny. Są to niewielkie białka, a w ich składzie około 25% sekwencji stanowią zasadowe aminokwasy - lizyna i arginina. Właściwości histonów oraz ich klasyfikacja zależą od zawartości tych dwóch aminokwasów. Wyróżnia się histony bogate w lizynę (H1), umiarkowanie bogate w lizynę (H2A i H2B) i bogate w argininę (H3 i H4). Histony u różnych gatunków wykazują duże podobieństwo składu aminokwasowego, co przemawia za ich małą zmiennością ewolucyjną. W trakcie życia komórki ulegają licznym modyfikacjom potranslacyjnym, które zmieniają strukturę chromatyny, a zarazem jej funkcję.
Podstawową jednostką chromatyny jest nukleosom. Nukleosom jest to elipsoidalna cząstka zbudowana z histonów i opleciona nicią DNA. Trzon nukleosomu stanowi kompleks ośmiu cząsteczek histonów - (H2A, H2B, H3, H4) x 2. Na oktamer histonowy, nawinięty jest odcinek DNA w postaci lewoskrętnej superhelisy o długości około 146 pz. Odcinek ten tworzy 1,75 obrotu, a następnie przechodzi w tzw. DNA łącznikowy, łączący dwie sąsiednie podjednostki. Zazwyczaj długość DNA łącznikowego wynosi około 60 pz. Cały odcinek DNA przypadający na nukleosom stanowi około 200 pz. Siłami podtrzymującymi nić DNA na oktamerze białkowym są oddziaływania elektrostatyczne pomiędzy dodatnio naładowanymi resztami aminokwasów zasadowych a ujemnie naładowanym ortofosforanem uczestniczącym w wiązaniach fosfodiestrowych łańcucha DNA. Długość DNA upakowanego w nukleosomach zmniejsza się około siedmiokrotnie. Strukturę chromatyny stabilizuje także histon H1 oraz białka niehistonowe. Histon H1 łączy się z odcinkami DNA poza rdzeniami nukleosomów. Dzięki tym oddziaływaniom, chromatyna może tworzyć struktury wyższego rzędu, jak np. solenoid. Tak utworzone włókno DNA jest przyłączone do centralnego rusztowania białkowego i tworzy serię pętli. Ogólny stopień skrócenia konturów DNA wynosi około 104. Podczas metafazy chromosomy występują w postaci najbardziej skondensowanej, a ich długość wynosi od 1,3 do 10 μm.
DNA komórek bakterii jest kolistą dwuniciową cząsteczką, często określaną jako chromosom bakteryjny. Znajduje się on w rejonie komórki zwanym nukleoidem. Kolisty genom jest zorganizowany w 50-100 superhelikalnie zwiniętych pętli lub domen, których końce połączone są z błoną komórkową za pośrednictwem kompleksu białkowego. Zwojom DNA towarzyszą białka podobne do histonów.
W wielu komórkach bakteryjnych występują plazmidy. Są to niewielkie, koliste cząsteczki dwuniciowego DNA. Plazmidy posiadają zdolność autonomicznego namnażania się w komórkach bakteryjnych. DNA plazmidowy z reguły nie zawiera genów niezbędnych do życia bakterii. Wiele plazmidów posiada geny oporności na antybiotyki. Plazmidy są około 100 razy mniejsze od chromosomu bakteryjnego, ale posiadają podobny kolisty plan budowy i są superhelikalnie zwinięte.
Plazmidy stosowane w badaniach inżynierii genetycznej są sztucznie skonstruowanymi cząsteczkami DNA, pochodzącymi od naturalnego plazmidu E. coli. W biologii molekularnej często używanymi do analiz plazmidami jest pBR-322 o długości 4362 pz lub pUC 19 o długości 2686 pz. Znana jest ich sekwencja nukleotydowa, a także sekwencje rozpoznawane przez określone endonukleazy restrykcyjne.
Endonukleazy restrykcyjne bronią komórkę bakteryjną przed konsekwencją wnikania obcego DNA (np. wirusowego). Są to enzymy o bardzo dużej specyficzności działania i hydrolizują cząsteczki DNA w obrębie rozpoznawanej przez siebie sekwencji. Sekwencje te obejmują zazwyczaj cztery lub sześć ściśle określonych pz tworzących tzw. palindrom (Rys. 1).
Endonukleazy restrykcyjne z uwagi na bardzo wysoką specyficzność działania znalazły szerokie zastosowanie w badaniach genomów i w innych dziedzinach biologii molekularnej.
CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA
1. Izolowanie DNA z grasicy cielęcej
Metody stosowane do wyodrębnienia DNA z materiału biologicznego mają na celu otrzymanie preparatu czystego pod względem chemicznym i jednocześnie o możliwie nieuszkodzonej strukturze.
Preparatom DNA towarzyszą zanieczyszczenia białkami jądrowymi i RNA. Metody służące do oczyszczania DNA kładą nacisk na usunięcie tych substancji. W postępowaniu preparatywnym należy ograniczać działanie deoksyrybonukleaz. W tkankach pobranych do preparatyki zostają zaburzone systemy regulacyjne i nukleazy atakują DNA komórkowy, powodując jego stopniową degradację. Właściwości tkanki, z której izoluje się DNA, mogą wpływać na stopień trudności preparatyki. Istotna jest aktywność enzymów nukleolitycznych znajdujących się w danej tkance, stosunek ilościowy RNA/DNA oraz zawartość DNA. Przykładowo, wysoką aktywnością nukleaz charakteryzują się śledziona i trzustka, stosunkowo niską zaś grasica. Zawartość DNA w różnych tkankach waha się w szerokim zakresie od około 0,2% w wątrobie szczura do 2,5% w grasicy cielęcej. Stosunek RNA/DNA wynosi około 4 dla wątroby szczura, dla grasicy cielęcej tylko 0,4. Te kryteria powodują, że grasica cielęca jest dogodnym materiałem do izolowania DNA.
Zasada metody
Izolowanie DNA obejmuje dwa etapy:
1. Uzyskanie z grasicy deoksyrybonukleoproteidu (DNP), możliwie wolnego od zanieczyszczeń rybonukleoproteidem (RNP).
Grasicę należy poddać homogenizacji w roztworze NaCl o stężeniu 0,15 mol/dm3 z dodatkiem cytrynianu sodu. Homogenizacja powoduje zniszczenie komórek i uwolnienie z jąder komórkowych DNP i RNP. RNP w trakcie homogenizacji ulega rozpuszczeniu, DNP pozostaje nierozpuszczony. Cytrynian stosuje się jako związek wiążący jony metali dwuwartościowych, między innymi jony Ca2+ i Mg2+, które są niezbędne do działania deoksyrybonukleaz. Usunięcie tych jonów zabezpiecza DNA przed degradacją przez nukleazy.
2. Dysocjacji DNP w środowisku o dużej sile jonowej na białka i DNA.
DNP rozpuszcza się w roztworach o dużej sile jonowej, w tym przypadku w roztworze NaCl o stężeniu 2 mol/dm3. Rozpuszczone cząsteczki DNA wytrąca się z roztworu za pomocą etanolu.
Materiał i odczynniki
1. Roztwór SSC (0,15 mol/dm3 NaCl, 0,015 mol/dm3 cytrynian sodu, pH 7,0).
2. 4 mol/dm3 roztwór NaCl.
3. Grasica cielęca.
Wykonanie doświadczenia
1 gram grasicy cielęcej (świeżej lub zamrożonej) homogenizować w homogenizatorze nożowym 2 minuty w 150 cm3 wychłodzonego roztworu SSC.
Homogenat odwirować (15 min, 2500 obr./min). Płyn nadosadowy, zawierający rozpuszczony RNP wylać, osad DNP przenieść do naczynia miksera, dodać 200 cm3 roztworu SSC, homogenizować 30 sek. w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny (etap wspólny dla całej grupy, dalej praca w zespołach).
Każdy zespół pobiera do zlewki 10 cm3 homogenatu DNP i dodaje 10 cm3 4 mol/dm3 roztworu NaCl (stężenie końcowe 2 mol/dm3). Preparat należy mieszać do momentu, w którym roztwór stanie się wyraźnie lepki na skutek rozpuszczania się deoksyrybonukleoproteidu. Z uzyskanego w ten sposób lizatu DNP należy otrzymać dwa oddzielne preparaty DNA przeznaczone do:
a) hydrolizy kwaśnej i zasadowej ( doświadczenia nr 2, 8, 9)
b) oznaczenia fosforu całkowitego (doświadczenie nr 4).
2. Hydroliza kwaśna DNA w 72% roztworze HClO4
Zasada metody
Podczas ogrzewania DNA w 72% roztworze kwasu nadchlorowego następuje hydroliza wiązań N-glikozydowych i uwolnienie zasad azotowych. Reszty deoksyrybozy oraz inne zanieczyszczenia biologiczne ulegają zwęgleniu.
Odczynniki
1. 96% etanol.
2. Aceton.
3. 72% roztwór HClO4.
Wykonanie doświadczenia
Do zlewki o pojemności 50 lub 100 cm3 pobrać 10 cm3 zlizowanego preparatu DNP, dodać równą objętość wychłodzonego 96% etanolu, wymieszać (bez użycia bagietki), aż utworzy się wyraźny, kłaczkowaty osad DNA. DNA przenieść do szklanej probówki wirówkowej, dodać 2 cm3 96% etanolu i wymieszać. Następnie etanol wylać, pozostawiając wytrącony DNA w probówce (na dnie), dodać około 1 cm3 acetonu i ponownie wymieszać. Wylać aceton, pozostawiając osad DNA na dnie, probówkę lekko ogrzać w ciepłym strumieniu powietrza, odparowując resztki acetonu. Wysuszony kłaczek DNA zalać 0,2 cm3 roztworu 72% HClO4 i po zakryciu probówki korkiem z chłodniczką zwrotną wstawić ją do łaźni wodnej o temperaturze 1000 C na 1 godzinę.
Po zakończonym ogrzewaniu należy dodać 0,3 cm3 wody i całość roztworu przenieść do probówki Eppendorfa. Następnie odwirować zwęglone zanieczyszczenia w ciągu (5 min, mikrowirówka). Płyn znad osadu ostrożnie przenieść pipetką do suchych probówek Eppendorfa. Otrzymany preparat poddać dalszej analizie celem identyfikacji uwolnionych zasad azotowych.
Jeśli identyfikacja zasad za pomocą chromatografii bibułowej ma odbyć się na następnych zajęciach, probówki należy przechować w chłodni.
3. Chromatografia kwaśnych hydrolizatów DNA
Zasada metody
Uwolnione w trakcie hydrolizy DNA zasady purynowe i pirymidynowe można rozdzielić za pomocą chromatografii bibułowej wstępującej.
Odczynniki
1. Bibuła Whatman nr 1.
2. Solwent o składzie: izopropanol : stężony HCl : H2O (170 : 41 : 39).
Wykonanie doświadczenia
Na arkusiku bibuły zaznaczyć ołówkiem w równych odstępach sześć ponumerowanych punktów, w odległości 2,5 cm od dolnej krawędzi bibuły. Na cztery punkty nanieść kolejno wzorce adeniny, guaniny, cytozyny i tyminy, dotykając bibuły trzy razy kapilarką z odpowiednim roztworem. Miejsca nanoszenia każdorazowo suszyć suszarką. Plamki nie powinny mieć więcej niż 3-4 mm średnicy. Na punkt 5 nanieść analogicznie mieszaninę wszystkich wzorców, a na punkt 6 – przygotowany kwaśny hydrolizat DNA. Wysuszoną bibułę wstawić do komory chromatograficznej i rozwijać chromatogram około 3,5 godziny. Po wyjęciu chromatogramu należy go wysuszyć suszarką i obserwować uzyskane wyniki w świetle lampy UV (zasady purynowe i pirymidynowe pochłaniają światło nadfioletowe w zakresie 250-280 nm). Ołówkiem zaznaczyć położenie każdej zasady. Porównać położenie plam wzorców z wynikami uzyskanymi z rozdziału kwaśnego hydrolizatu DNA.
4. Przygotowanie preparatu DNA do oznaczania fosforu całkowitego
Odczynniki
1. 96% etanol.
Wykonanie doświadczenia
1 cm3 lizatu DNP przenieść do probówki skalowanej na 10 cm3, dodać 1,5 cm3 96% etanolu. Zawartość probówki wymieszać bez użycia bagietki. Po upływie jednej godziny etanol ostrożnie zlać, pozostawiając strącony DNA na dnie probówki.
Jeśli dalsze badania mają się odbyć na następnych zajęciach, probówkę należy zakryć folią aluminiową i pozostawić w chłodni.
5. Oznaczanie fosforu całkowitego w DNA oraz obliczanie procentowej zawartości DNA w grasicy
Zasada metody
Aby oznaczyć zawartość fosforu w DNA należy otrzymany preparat poddać mineralizacji. Podczas mineralizacji próbek biologicznych organiczne związki fosforanowe przechodzą w fosforany nieorganiczne.
Zasada oznaczenia fosforanów nieorganicznych polega na reakcji z molibdenianem amonu. Powstały fosforomolibdenian przekształca się w "błękit molibdenowy" (mieszaninę tlenków molibdenu na niższym stopniu utlenienia) za pomocą reduktora, którym jest eikonogen. Powstające zabarwienie jest proporcjonalne do zawartości fosforanów, a reakcja przebiega ilościowo w 1000 C w środowisku silnie kwaśnym. Powyższa metoda jest bardzo czuła i pozwala na wykrycie kilku μg fosforanów, a powstałe zabarwienie jest trwałe przez wiele godzin.
Wykonana równolegle krzywa wzorcowa pozwala na ilościowe oznaczenie fosforanów w próbie.
Oznaczenie ilości DNA opiera się na fakcie, że zawartość fosforu w cząsteczkach tego kwasu nukleinowego jest wartością stałą i wynosi 9% masy tego związku.
a) Mineralizacja DNA
Odczynniki
1. Stężony H2SO4 ,
2. 6 mol/dm3 roztwór HClO4 .
Wykonanie doświadczenia
Do probówki zawierającej preparat DNA dodać 0,5 cm3 stężonego H2SO4 i zawartość jej spalić w piecu elektrycznym w temperaturze około 2000 C. Próbki czernieją na skutek zwęglenia. W celu utlenienia zwiazków powstałych podczas mineralizacji należy dodać utleniacza - jedną kroplę 6 mol/dm3 roztworu HClO4. Próbkę należy ogrzewać dalej około 5 minut i ponownie dodać kroplę roztworu kwasu nadchlorowego; czynność można kilka razy powtórzyć. Zakończenie procesu mineralizacji następuje wtedy, gdy roztwór w probówce będzie bezbarwny. Po ukończonej mineralizacji probówkę wstawić do statywu, aby ostygła.
b) Oznaczanie fosforu w fosforanach otrzymanych po mineralizacji DNA
Odczynniki
1. 5% roztwór molibdenianu amonu.
2. 0,2% roztwór eikonogenu (kwas 1-amino-2-naftolo-4-sulfonowy w 12% pirosiarczynie sodu i 1,2% siarczynie sodu).
3. Stężony H2SO4.
Wykonanie doświadczenia
Do oziębionej próbki zmineralizowanego DNA dodać 5 cm3 wody, wymieszać i dodać kolejno 0,5 cm3 5% roztworu molibdenianu amonu i 0,5 cm3 roztworu eikonogenu. Całość uzupełnić wodą do 10 cm3, mieszając starannie po dodaniu każdego odczynnika.
Równolegle wykonać próbę ślepą: do probówki zawierającej 5 cm3 wody dodać 0,5 cm3 stężonego H2SO4, 0,5 cm3 5% roztworu molibdenianu amonu, 0,5 cm3 0,2% roztworu eikonogenu i uzupełnić wodą do 10 cm3, dokładnie mieszając po dodaniu każdego odczynnika.
Wstawić obie probówki do wrzącej łaźni wodnej na 20 minut. Po upływie tego czasu probówki wyjąć i oziębić. Zawartość probówek ponownie uzupełnić wodą do 10 cm3, wymieszać i dokonać pomiaru absorbancji próby właściwej przy długości fali 680 nm, wobec próby ślepej. Odczytać ilość fosforu zawartego w fosforanach otrzymanych po mineralizacji DNA z krzywej wzorcowej (doświadczenie 6).
Obliczyć procentową zawartość DNA w grasicy, uwzględniając rozcieńczenia stosowane w toku preparatyki.
6. Wyznaczanie krzywej wzorcowej służącej do oznaczania fosforu
Odczynniki
1. Wzorzec fosforu (roztwór KH2PO4 zawierający 4 μg P/ cm3).
2. Stężony H2SO4 ,
3. 5% roztwór molibdenianu amonu.
4. 0,2% roztwór eikonogenu.
Wykonanie doświadczenia
Do 11 probówek skalowanych na objętość 10 cm3 dodać kolejno odczynniki według tabeli 1.
Tabela 1
| 1, 2 | 3, 4 | 5, 6 | 7, 8 | 9, 10 | 11 | |
| Ilości dodawanych odczynników w cm3 | ||||||
Wzorzec fosforu o stężeniu 4 μg/cm3 |
0,5 | 1,5 | 2,5 | 3,5 | 4,5 | - |
| Woda | 4,5 | 3,5 | 2,5 | 1,5 | 0,5 | 5 |
| Stężony H2SO4 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| 5% molibdenian amonu | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| 0,2% eikonogen | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
Po dodaniu każdego odczynnika zawartość probówki należy starannie wymieszać i uzupełnić wodą do objętości 10 cm3, starannie wymieszać i umieścić probówki we wrzącej łaźni wodnej na 20 minut, następnie wyjąć, oziębić i ponownie uzupełnić wodą do objętości 10 cm3. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 680 nm wobec próby ślepej (probówka nr 11).
Odczytane wartości absorbancji (średnie z dwóch równoległych oznaczeń) nanieść na układ współrzędnych, gdzie wartości absorbancji są wyznaczone na osi rzędnych, a ilość fosforu w próbie na osi odciętych (μg P/próbę).
7. Zadanie ilościowe (indywidualne dla każdego studenta)
Do dwóch probówek pobrać po 1 cm3 roztworu zadania, następnie dodać 4 cm3 wody, 0,5 cm3 stężonego H2SO4, 0,5 cm3 5% molibdenianu amonu i 0,5 cm3 0,2% eikonogenu, uzupełnić wodą do 10 cm3, starannie mieszając po dodaniu każdego odczynnika. Równolegle sporządzić ślepą próbę (probówka nr 11 w doświadczeniu 6). Wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 20 minut, wyjąć, ochłodzić i ponownie uzupełnić wodą do 10 cm3. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 680 nm wobec ślepej próby. Z krzywej wzorcowej odczytać ilość μg fosforu i obliczyć średnią zawartość fosforu w 1 cm3 roztworu zadania na podstawie wyników uzyskanych z dwóch równoległych prób.
10. Wykazanie struktury nukleosomowej chromatyny
Preparat chromatyny należy uzyskać z wątroby cielęcej, poddanej wstępnej homogenizacji w izotonicznym roztworze sacharozy. Otrzymany po odwirowaniu osad jąder jest zanieczyszczony fragmentami błon komórkowych i erytrocytami, które usuwane są przez homogenizację osadu w izotonicznym roztworze sacharozy z dodatkiem detergentu (Triton X-100). Detergent powoduje rozpuszczenie struktur lipidowych.
Już w trakcie izolowania jąder, a następnie podczas inkubacji, zachodzi stopniowa degradacja DNA za pomocą endogennych nukleaz aktywowanych jonami Ca2+ i Mg2+. Deoksyrybonukleazy, mając utrudniony dostęp do DNA nawiniętego na oktamer histonowy, hydrolizują głównie wiązania fosfodiestrowe w obrębie DNA łącznikowego. Po działaniu enzymów powstają odcinki DNA odpowiadające długości 200 pz oraz fragmenty będące wynikiem niepełnej degradacji chromatyny, które są wielokrotnością 200 pz (Rys. 2).
a) Izolowanie jąder komórkowych z wątroby cielęcej
(etap wspólny dla całej grupy)
Materiał i odczynniki
1. Medium A (0,25 mol/dm3 roztwór sacharozy, 10 mmol/dm3 Tris-HCl pH 7,2,
10mmol/dm3 MgCl2, 1 mmol/dm3 CaCl2).
2. Medium B ( 25 mol/dm3 roztwór sacharozy, 10 mmol/dm3 Tris-HCl pH 7,2,
10 mmol/dm3 MgCl2, 1 mmol/dm3 CaCl2 , 0,2% Triton X-100 ).
3. Wątroba cielęca.
Wykonanie doświadczenia
1. 5 g świeżej wątroby cielęcej pokroić na drobne skrawki i zalać zimnym medium A.
2. Homogenizować tkankę w homogenizatorze szklanym (około 10-12 ruchów tłoka "góra-dół"). Uzupełnić do 200 cm3 tym samym roztworem. Przesączyć przez gazę.
3. Wirować (10 min, 2000 obr./min). Płyn znad osadu wylać, osad zalać 100 cm3 medium B, lekko homogenizować (4-5 ruchów tłoka "góra-dół"). .
4. Wirować (5 min, 2000 obr./min). Płyn znad osadu wylać. Osad jąder zawiesić w 20 cm3 medium A, lekko homogenizować. Otrzymany roztwór stanowi zawiesinę jąder komórkowych.
b) Hydroliza DNA chromatyny w zależności od czasu inkubacji z endogennymi nukleazami
Zasada metody
Aby wykazać nukleosomową strukturę chromatyny, zawiesinę jąder komórkowych należy inkubować w temperaturze 370 C w buforze zawierającym jony wapnia i magnezu, a następnie oddzielić DNA od białek za pomocą detergentu (SDS) i roztworu KCl. Następnie przeprowadzić denaturację białek wytrząsając preparat z mieszaniną chloroformu i alkoholu izoamylowego, a cząsteczki DNA z fazy wodnej wytrąca się za pomocą etanolu.
Odczynniki
1. 10% roztwór siarczanu dodecylu sodu (SDS).
2. 3 mol/dm3 roztwór KCl.
3. Mieszanina chloroform: alkohol izoamylowy (24 : 1).
4. 96% etanol.
Wykonanie doświadczenia
Każdy wyznaczony zespół izoluje tylko jeden preparat DNA z jąder inkubowanych w ustalonym przez asystenta czasie (0, 10, 20 lub 30 minut).
Uwaga: studenci, którzy izolują preparat DNA dla czasu "0", pobierają próbkę przed wstawieniem zlewki z zawiesiną jąder do łaźni wodnej.
1. Wstawić zlewkę z zawiesiną jąder komórek wątroby do łaźni wodnej o
temperaturze 370 C.
2. Po określonym czasie inkubacji zawartość zlewki zamieszać i pobrać 1 cm3
zawiesiny do probówki wirówkowej, w której znajduje się 0,1 cm3 10%
roztworu SDS, dobrze wytrząsać - około 2 minut.
3. Dodać 0,2 cm3 3 mol/dm3 roztworu KCl, dobrze wymieszać i wlać 1 cm3 mieszaniny chloroform : alkohol izoamylowy.
4. Wytrząsać przez 20 minut (można robić przerwy).
5. Zawartość probówek wirować (10 min, 3000 obr./min).
6. Pipetką plastikową ściągnąć górną warstwę wodną, zawierającą DNA uważając,
aby nie poruszyć osadu zdenaturowanych białek znajdującego się na granicy faz.
Roztwór wlać do probówki wirówkowej i wytrącić DNA przez dodanie 3,5 cm3
96% etanolu.
7. Jeżeli analiza DNA ma się odbyć na następnych zajęciach, należy zakleić wylot probówki parafilmem i pozostawić w chłodni.
c) Analiza DNA metodą elektroforezy w żelu agarozowym
DNA w połączeniu z bromkiem etydyny fluoryzuje w świetle ultrafioletowym i w żelu obserwuje się charakterystyczny układ prążków, odpowiadający pozycjom zajmowanym przez poszczególne fragmenty DNA. Celem ustalenia długości fragmentów DNA poddaje się elektroforezie wzorcowy DNA.
Odczynniki
1. Bufor TE (10 mmol/dm3 Tris-HCl pH 8,0, 1 mmol/dm3 EDTA).
2. Wzorzec mas cząsteczkowych DNA.
3. Bufor do obciążenia próbki (10 mmol/dm3 Tris-HCl pH 7,8, 1 mmol/dm3 EDTA,
0,05% błękit bromofenolowy, 50% mocznik, 10% sacharoza).
4. 0,8% żel agarozowy w buforze do elektroforezy z dodatkiem bromku
etydyny.
5. Bufor do elektroforezy (0,02 mol/dm3 roztwór Tris doprowadzony do pH 7,8 za
pomocą stężonego CH3COOH, 1 mmol/dm3 EDTA).
Wykonanie doświadczenia
1. Odwirować preparat DNA (10 min, 3000 obr./min). Osad DNA rozpuścić w 1 cm3 buforu TE. Pipetą automatyczną pobrać 20 µl analizowanego roztworu DNA i dodać 5 µl roztworu barwnika.
Całość nanieść w odpowiedni otworek w żelu agarozowym. Równolegle nanieść DNA wzorcowy.
2. Włączyć prąd stały (stabilizator - napięcie 120 V, natężenie 0,1 A, czas około 1 godziny 30 minut, lub napięcie 160-170 V, natężenie 0,16 A, czas 1 godzina 10 minut).
Cząsteczki DNA wędrują od katody do anody. Obserwować poruszanie się barwnika i przerwać elektroforezę, gdy znajdzie się on około 5 cm przed końcem żelu. Żel oglądać w świetle ultrafioletowym, zinterpretować wyniki.
11. Analiza plazmidowego DNA metodą elektroforezy w żelu agarozowym
Elektroforetogram DNA plazmidu niepoddanego hydrolizie wykazuje obecność charakterystycznych prążków. Uwidocznione dzięki połączeniu z bromkiem etydyny prążki odpowiadają różnym formom plazmidowego DNA: CCC - cząsteczki koliste, wtórnie zwinięte, OC - formy koliste, powstające po przecięciu jednej nici DNA, wchodzącej w skład cząsteczki, L – cząsteczki liniowe powstające w wyniku przecięcia obu nici DNA.
Na rysunku 3 przedstawiono obraz rozdziału elektroforetycznego DNA plazmidowego, który pochodzi z dwóch odrębnych ścieżek na żelu. Najwolniej wędruje forma OC (nicked circles), następnie forma L (linear) i najszybciej forma CCC (supercoiled). Elektroforetogram plazmidu poddanego działaniu endonukleazy restrykcyjnej wykazuje obecność szeregu pasm o ściśle określonej ilości par zasad.
Materiał i odczynniki
1. Odczynniki do elektroforezy jak w ćwiczeniu 10c.
2. Roztwór DNA plazmidowego.
3. Roztwór DNA plazmidowego po hydrolizie wybraną endonukleazą restrykcyjną.
Wykonanie doświadczenia
Rozdziałowi poddać DNA plazmidowy oraz DNA plazmidowy zhydrolizowany wybraną nukleazą restrykcyjną. Wykonać rozdział elektroforetyczny tak jak w doświadczeniu nr 10 c.