Monika Wrońska

Daria Świerczyńska

Dawid Piątkowski

LABORATORIUM Z BIOCHEMII.

ĆWICZENIE 1

KWASY NUKLEINOWE

Data wykonania ćwiczenia: 30 .03.2011 r.

Data oddania sprawozdania: 06.03.2011 r.

Semestr IV

Grupa V

Środa 14¹⁵- 18⁰⁰

1. Wstęp teoretyczny:

Kwasy nukleinowe to związki wielkocząsteczkowe które występują we wszystkich żywych komórkach głównie w postaci nukleoprotein (białka złożonego). Odgrywają one zasadniczą rolę w przekazywaniu cech dziedzicznych i kierowaniu syntezą białek, czyli reakcji podczas której następuje łączenie się prostych substratów z których powstaje jeden bardziej złożony produkt główny. W organizmach żywych występują dwa rodzaje kwasów nukleinowych:
· kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA) - którego składnikami są: cukier – dezoksyryboza, zasady azotowe: adenina, cytozyna, guanina i tymina, reszta kwasu fosforowego
· kwasy rybonukleinowe – (RNA) których składnikami są: cukier – ryboza, zasady azotowe: adenina, cytozyna, guanina i uracyl, reszta kwasu fosforowego.

a) b)

Rys.1 Pentozy występujące w kwasach nukleinowych: a) β- D-rybofuranoza (ryboza);

b) 2- deoksy-β- D-rybofuranoza.

Nukleotydy zbudowane są z reszty cukrowej - pentozy (w DNA jest to deoksyryboza, zaś w RNA - ryboza), co najmniej jednej reszty fosforanowej i zasady azotowej: purynowej, pirymidynowej lub flawinowej (niewystępującej w kwasach nukleinowych).

W kwasach nukleinowych występują zwykle (prawie zawsze) tylko cztery z pięciu zasad azotowych. W RNA są to: adenina, guanina, cytozyna i uracyl, a w DNA: adenina, guanina, cytozyna i tymina.

Rys. 2 Zasady purynowe: a) adenina; b)guanina.

Rys.3 Zasady pirymidynowe: a) cytozyna; b) uracyl; c) tymina.

Nukleozydy - grupa organicznych związków chemicznych, podgrupa glikozoamin powstałych w wyniku połączenia zasady azotowej z rybozą, deoksyrybozą lub rybitolem poprzez wiązanie N-β-glikozydowe. W zależności od rodzaju zasady azotowej wyróżnia się (pogrubieniem oznaczono podstawowe nukleozydy kwasów nukleinowych):

• nukleozydy purynowe: adenozyna, guanozyna;

• nukleozydy pirymidynowe:cytydyna, urydyna (RNA), tymidyna (DNA)

Zasada heterocykliczna	Nukleozyd	deoksynukleozyd
adenina	adenozyna	deoksyadenozyna
guanina	guanozyna	deoksyguanozyna
tymina	5-metylourydyna	tymidyna
uracyl	urydyna	2'-deoksyurydyna
cytozyna	cytydyna	deoksycytydyna

1. Cześć doświadczalna:

1. Rozpuszczalność kwasów nukleinowych.

Cel ćwiczenia: Pokazanie w jakim środowisku i jakich roztworach kwasy nukleinowe rozpuszczają się najlepiej.

Materiały: 1% roztwór DNA i RNA, 1N HCl, roztwór NaOH, 98% roztwór etanolu.

Przebieg doświadczenia: Do 0,5 ml roztworów DNA i RNA dodaliśmy 1N HCl. Następnie dodaliśmy do tych probówek roztworu NaOH. Do kolejnych dwóch probówek zawierających po 1 ml 1% roztworów DNA i RNA dodaliśmy podwójna objętość 96 % etanolu.

Obserwacje: Po dodaniu do RNA i DNA roztworu HCl wytrącił się biały osad, po dodaniu NaOH osad uległ rozpuszczeniu. Natomiast w probówkach z DNA i RNA do których dodawaliśmy 96% etanolu wytrącił się biały osad.

Wnioski: Kwasy nukleinowe mają odczyn kwaśny ze względu na występującą w nich resztę kwasu ortofosforowego, a więc słabo rozpuszczają się w kwasach (wytrącenie się białego osadu po dodaniu HCl ), ale dobrze rozpuszczają się w zasadach ( po dodaniu NaOH osad się rozpuścił). Kwasy nukleinowe słabo rozpuszczają się w alkoholach o czym świadczy biały osad po dodaniu 96% etanolu.

1. Kwaśna hydroliza kwasów nukleinowych.

Cel ćwiczenia: Uzyskanie hydrolizatów kwasów nukleinowych których użyjemy w następnych doświadczeniach.

Materiały: 1% roztwór DNA i RNA, 10% H₂SO₄.

Przebieg doświadczenia: Dwie probówki zawierające po 2,5 ml 1% roztworu kwasów nukleinowych z 2,5 ml 10% H₂SO₄ ogrzewaliśmy przez godzinę we wrzącej łaźni wodnej.

Wnioski: Kwasy nukleinowe w obecności kwasów mineralnych i pod wpływam wysokiej temperatury ulegają hydrolizie do wolnych zasad purynowych i nukleotydów pirymidynowych.

1. Reakcja orcynolowa.

Cel ćwiczenia: Wykrycie obecności pentoz.

Materiały: Hydrolizat RNA, hydrolizat DNA, 0,1% roztwór RNA, 0,1% roztwór DNA, 1% roztwór rybozy, 1% roztwór deoksyrybozy.

Przebieg doświadczenia: Do probówek zawierających po 1 ml wymienionych wyżej substancji dodaliśmy po 1 ml odczynnika orcynolowego, a następnie umieściliśmy wszystkie probówki we wrzącej łaźni wodnej na 15 minut. Po wyjęciu z łaźni wodnej określiliśmy barwę powstałego kompleksu, w razie wątpliwości (niedokładnie widać barwę, nie możemy jej określić) dodawaliśmy po ok. 5 ml wody destylowanej.

Obserwacje: We wszystkich probówkach powstał kompleks o zielonym zabarwieniu.

Wnioski: Pentozy (ryboza i deoksyryboza) zarówno te w stanie wolnym (występujące w hydrolizacie) jak i te zawiązane w nukleozydach pod wpływem ogrzewania ze stężonym HCl przechodzą w furfural, który z orcyną oraz jonami Fe³⁺ tworzy trwały kompleks o zielonej barwie. Wnioskuje, że we wszystkich badanych przeze mnie probówkach występuje cukier pentoza.

1. Reakcja Dischego.

Cel ćwiczenia: Wykrycie deoksyrybozy w badanych próbach.

Materiały: Hydrolizat RNA, hydrolizat DNA, 0,1% roztwór RNA, 0,1% roztwór DNA, 1% roztwór rybozy, 1% roztwór deoksyrybozy.

Przebieg doświadczenia: Do probówek zawierających po 1 ml wymienionych wyżej substancji dodaliśmy po 2ml odczynnika difenyloaminowego, a następnie umieściłyśmy we wrzącej łaźni wodnej na 10 minut.

Obserwacje:

1. hydrolizat RNA- kolor bardzo jasno zielony,

2. hydrolizat DNA- kolor fioletowo- niebieski,

3. 0,1% roztwór RNA- roztwór bezbarwny,

4. 0,1% roztwór DNA- kolor niebieski,

5. 1% roztwór rybozy- roztwór bezbarwny,

6. 1% roztwór deoksyrybozy- kolor niebiesko- granatowy.

Wnioski: Niebieskie zabarwienie pojawiło się tam gdzie w próbie znajdowała się deoksyryboza (w próbach: 2,4,6). DNA, deoksyryboza wolna oraz związana z zasadą purynową ulegają barwnej reakcji z difenyloaminą. Doświadczenie to służy do odróżniania DNA od RNA.

1. Wykrywanie kwasu fosforanowego.

Cel ćwiczenia: Wykrycie obecności kwasu fosforowego w próbach.

Materiały: Hydrolizat kwasu nukleinowego ( DNA lub RNA ).

Przebieg doświadczenia: Do 0,5ml hydrolizatu kwasu nukleinowego (DNA, RNA) dodaliśmy 3 krople roztworu amoniaku, żeby zobojętnić hydrolizat kwasu nukleinowego. Następnie dodaliśmy 0,5ml stężonego roztworu HNO₃ i 2ml roztworu molibdenianu amonowego. Później ogrzewaliśmy próby do wrzenia.

Obserwacje: Po ogrzaniu probówek zaobserwowaliśmy wytrącenie się żółtego osad.

Wnioski: Wytrącenie się żółtego osadu świadczy o obecności fosforanów badanej próbie, gdyż powstaje związek: fosfomolibdenian amonowy o zabarwieniu żółtym. Wynika więc z tego doświadczenia, że zarówno w DNA jak i w RNA obecny jest kwas fosforanowy.

1. Wykrywanie zasad purynowych.

Cel ćwiczenia: Wykrycie obecności zasad purynowych w badanych próbach.

Materiały: Hydrolizat kwasu nukleinowego ( DNA lub RNA ).

Przebieg doświadczenia: Do 1ml hydrolizatu kwasu nukleinowego (DNA, RNA) dodaliśmy 6 kropli stężonego amoniaku i 3ml amoniakalnego roztworu wodorotlenku srebra.

Obserwacje: W badanej probówce wytrąca się biały osad.

Wnioski: Wytrącił się biały osad soli srebrowych puryn, który jest nierozpuszczalny w amoniaku. Puryny tworzą sole z jonami metali ciężkich, a wiec wnioskuję że w zarówno w DNA jaki i w RNA obecne są puryny.

1. Oznaczanie zawartości zasad purynowych metodą spektrofotometryczną.

Przygotowanie surowca do pomiaru spektrofotometrycznego:

Do 5g kostki bulionowej dodaliśmy ok. 75ml wody destylowanej, gotowaliśmy we wrzącej łaźni wodnej przez 10 minut, a następnie po przestudzeniu przesączyliśmy do kolby miarowej o pojemności 100ml przez gazę młyńską i uzupełniliśmy do kreski wodą destylowaną. Po wymieszaniu roztwór jeszcze raz przesączyliśmy, przez sączek bibułowy. Do pomiaru spektrofotometrycznego badany roztwór rozcieńczyłyśmy 20-krotnie 0,1N HCl. Pomiar absorbancji wykonany został przy dwóch długościach fali: maksymalnego pochłaniania i przy 290nm (dla adeniny przy 262nm i 290nm; dla guaniny przy 249nm i 290nm).

Tabela wyników:

Produkt	adenina	guanina
	ΔE262-292	Zawartość [mg/g]
1) Bulion grzybowy Knorr	0,491	2,184
2) Bulion grzybowy Winiary	0,258	1,15
3) Rosół z kury Knorr	0,193	0,86
4) Rosół z kury Kucharek	0,482	2,14
5) Rosół drobiowy Winiary	0,180	0,8
6) Bulion wołowy Knorr	0,133	0,59
7) Bulion cielęcy Knorr	0,27	1,2
8) Bulion z warzyw Knorr	0,161	0,716

OBLICZENIA:

Bulion grzybowy „Knorr”:

Dla adeniny:

ΔE_262-292 = 0,571

10µg/ml – 0,900

x - 0,491

Dla guaniny:

ΔE_249-292 = 0,553

10µg/ml – 0,457

x - 0,4

Wnioski: Rosół drobiowy firmy Winiary jest najlepszy, ponieważ zawiera najmniej adeniny i guaniny. Rosół z kury firmy Kucharek jest najgorszy, gdyż zawiera najwięcej tych związków. Buliony firmy Winiary są lepsze od kostek bulionowych innych firm.

1. Oznaczanie zawartości DNA metodą difenyloaminową.

1. Ekstrakcja kwasów nukleinowych.

1. 5g tkanki zwierzęcej (wątroba),

2. 2g mleczu z ryb,

homogenizowaliśmy z 50ml zimnego 10% kwasu trójchlorooctowego. Homogenat odwirowaliśmy. Kwas trójchlorooctowy ekstrahuje niskocząsteczkowe związki kwasorozpuszczalne (nukleotydy, aminokwasy, estry fosforanowe). W osadzie pozostają białka, polisacharydy i kwasy nukleinowe. Supernatant (ciecz nadosadowa) usunęliśmy, a do osadu dodaliśmy 30ml 0,6M roztworu kwasu nadchlorowego i ogrzewaliśmy mieszaninę w ciągu 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 90^oC stale mieszając. W wyniku ogrzewania z roztworem HClO₄ kwasy nukleinowe zostają uwolnione od białka, ulegają hydrolizie do związków kwasorozpuszczalnych i przechodzą do roztworu. Po ostudzeniu odwirowaliśmy osad zawierający białko, a supernatant przenosiliśmy ilościowo do kolby miarowej o pojemności 50ml. Zawartość kolby uzupełniliśmy kwasem nadchlorowym do kreski i dokładnie wymieszaliśmy.

1. Oznaczanie zawartości DNA metodą difenyloaminową.

1. 1ml ekstraktu kwasów nukleinowych i 1ml wody destylowanej (próba badana)

2. 1ml wzorcowego DNA (o stężeniu 200µg/ml) i 1ml wody destylowanej (próba wzorcowa)

3. 2ml wody destylowanej (próba odczynnikowa)

do każdej dodaliśmy po 4ml odczynnika difenyloaminowego. Wszystkie próby jednocześnie wstawiliśmy do wrzącej łaźni wodnej i inkubowaliśmy w ciągu 10 minut. Ochłodziliśmy próby i zmierzyliśmy absorbancję prób badanych i wzorcowej wobec próby odczynnikowej na spektrokolorymetze przy długości fali 600nm.

OBLICZENIA:

Wzorcowa próba kwasu DNA

Wątroba:

odczytana absorbancja - 0,227 (I)

- 0,162 (II)

Śledź:

Odczytana absorbancja- 0,4545 (I)

- 0,438 (II)

Wnioski: W śledziu jest dużo więcej kwasu DNA niż w wątrobie.