UNIWERSYTET GDAC
SKI
WYDZIAA
CHEMII
Katedra Analizy Åšrodowiska
METODY ANALIZY ILOÅšCIOWEJ
Gdańsk, 2007
Metody analizy ilościowej 2
1. Analiza ilościowa
Ilościową zawartość składników w próbce oblicza się, wykorzystując to, \
e ilość tych
składników jest proporcjonalna do powierzchni lub wysokości pików im odpowiadających. Do
obliczeń zaleca się wykorzystywanie wysokości pików pod warunkiem, \
e sÄ… one symetryczne.
W analizie ilościowej pewne znaczenie ma rodzaj zastosowanego detektora. Najlepsze
wyniki uzyskuje się stosując detektor absorpcji w nadfiolecie. Przy szerokim zakresie liniowości
charakteryzuje się on wysoką czułością. Nale\
y tak dobrać warunki detekcji, np. długość fali
odpowiadającą maksimum absorpcji, aby nie trzeba było wykorzystywać maksymalnej czułości
detektora.
Na wyniki analizy chromatograficznej wpływ ma jakość zastosowanego przyrządu oraz
stałość warunków prowadzenia analizy. W czasie analizy temperatura kolumny, skład fazy
ruchomej i wielkość próbek dozowanych do kolumny nie powinny ulegać zmianie.
W chromatografii cieczowej analizÄ™ mo\
na wykonać przez porównywanie powierzchni lub
wysokości piku składnika analizowanej próbki i powierzchni lub wysokości piku wzorca. Postępuje
się tak przy analizie sposobem wzorca wewnętrznego, normalizacji czy kalibracji bezwzględnej.
InnÄ… metodÄ… jest metoda dodawania (dodatku) wzorca.
1.1. Metoda wzorca wewnętrznego
Spośród ró\
nych metod oceny ilościowej, w analizie chromatograficznej śladowych próbek
zanieczyszczeń środowiska, największe znaczenie ma metoda wzorca wewnętrznego. Powodem jest
przede wszystkim mnogość operacji wykonywanych na próbce (min. ekstrakcji i przeprowadzania
jej w pochodne odpowiednie do analizowania metodą GC), w czasie których mo\
e nastąpić pewna
utrata próbki. Inne przyczyny to: problemy z określeniem małych objętości rozpuszczalnika, w
którym rozpuszczamy badaną próbkę, niemo\
ność uzyskania powtarzalnego dozowania przy
zastosowaniu dozownika z dzieleniem oraz to, \
e eliminujemy konieczność wykonania krzywej
kalibracyjnej.
W metodzie tej do badanej próbki dodaje się określoną ilość wzorca (substancji
standardowej), dobrze oddzielajÄ…cego siÄ™ w danych warunkach analizy od wszystkich badanych
składników. Wzorzec powinien mieć własności maksymalnie zbli\
one do własności substancji
badanej, nie mo\
e znajdować się w analizowanej próbce, poza tym powinien być nielotny, trwały i
dostępny w postaci czystej. Ilość dodanego wzorca powinna być porównywalna z ilością badanej
substancji.
Metody analizy ilościowej 3
Sygnał większości detektorów zale\
y od rodzaju analizowanych związków i dlatego
stosunek powierzchni sygnałów dwu składników nie jest równy stosunkowi ich zawartości w
mieszaninie. Odpowiedz
detektora płomieniowo-jonizacyjnego (FID) jest wprost proporcjonalna do
liczby atomów węgla niezwiązanych z tlenem a nie do masy związku. Trudności tej mo\
na uniknąć
stosując metodę standardu wewnętrznego i wyznaczając tzw. współczynniki detekcji (odpowiedzi).
W tym celu nale\
y wyznaczyć zale\
ność między stosunkiem stę\
eń badanej substancji i wzorca a
stosunkiem odpowiedzi detektora dla badanej substancji i wzorca zgodnie ze wzorem:
mS h
S
= f (1)
mW h
W
gdzie: ms, mw- masa oznaczanej substancji i wzorca,
hs, hw - wysokości pików (lub powierzchnie) odpowiadające sygnałom badanej
substancji i wzorca,
f- współczynnik detekcji (odpowiedzi).
1.2. Metoda dodawania wzorca
Procedura oznaczeń w metodzie dodawania wzorca jest następująca:
a) przygotowujemy próbkę analizowaną i przeprowadzamy dla niej pomiar, mierząc wartość
Y0 (w naszym przypadku wielkość absorpcji promieniowania UV, która jest proporcjonalna do
wysokości lub powierzchni sygnału chromatograficznego),
b) do tej samej próbki dodajemy znaną ilość substancji oznaczanej (wzorca), roztwór
mieszamy i mierzymy wartość Yi. Wartość parametru mierzonego wzrasta, a wzrost jest
proporcjonalny do ilości dodanego wzorca.
StÄ™\
enie analitu mo\
na wyliczyć na podstawie równań:
Y0 = ac (2)
Yi = a(c+cs) (3)
gdzie: Y0 oznacza pole powierzchni lub wysokość sygnału chromatograficznego analitu
zmierzony dla próbki bez dodatku wzorca, Yi  pole powierzchni lub wysokość
sygnału chromatograficznego analitu zmierzony dla próbki po dodaniu wzorca,
c  stÄ™\
enie analitu w próbce, cs  stę\
enie wzorca w próbce.
Z równania (2) obliczymy a:
a = Y0 / c (4)
Po podstawieniu do równania (3) otrzymamy :
Yi = Y0 / c · (c + cs) (5)
Metody analizy ilościowej 4
Po rozwiązaniu równania (5) względem c otrzymamy:
c = Y0 ·cs / (Yi  Y0) (6)
Wynikiem dodania wzorca jest zmiana objętości roztworu próbki badanej, stąd nale\
y
skorygować stę\
enia. W przypadku stosowania mikrostrzykawek i dozowania mikrolitrowych ilości
wzorca do analizowanej próbki, które nie wpływają w zasadniczy sposób na zmianę objętości
próbki, taka korekta objętości nie jest konieczna.
1.3. Metoda krzywej kalibracyjnej
W przewa\
ającej części metod detekcji mierzony parametr jest funkcją liniową stę\
enia
agalitu:
Y = ac + b (7),
gdzie: Y - wielkość mierzona, c  stę\
enie analitu, a  współczynnik proporcjonalności,
a = BC/AB = tg ą, b  wartość stała, jest często wartością eksperymentalną ślepej
próby.
którą mo\
na przedstawić graficznie (Rys. 1a)
Rys. 1a. Krzywa kalibracyjna Y = ac + b
Współczynnik proporcjonalności a określa czułość metody; im większe zmiany wartości mierzonej
Y na jednostkÄ™ stÄ™\
enia c, tym większa jego wartość i tym wy\
sza czułość metody. Metody o małym
kącie nachylenia krzywych kalibracyjnych nie są przydatne do celów analitycznych. Parametr b
mo\
e przyjmować wartości dodatnie, ujemne lub zero.
W metodzie krzywej kalibracyjnej przygotowuje się szereg roztworów o znanych stę\
eniach
substancji analizowanych oraz tzw. ślepą próbę  roztwór, w którym są wszystkie składniki
roztworów wzorcowych z wyjątkiem analitu i dla ka\
dego roztworu mierzy się wartość Y.
Zale\
ność Y od c wzorców wykreśla się (Rys. 1b) lub wylicza równanie prostej. Wartość Y mierzy
Metody analizy ilościowej 5
się równie\
dla próbki badanej, nanosi na krzywą kalibracyjną i odczytuje stę\
enie lub oblicza z
równania prostej.
Rys. 10. Krzywa kalibracyjna Y = a c
Przed przystąpieniem do oznaczeń metodą krzywej kalibracyjnej nale\
y zbadać zakres
prostoliniowej zale\
ności wartości mierzonej od stę\
enia analitu (Rys. 1c).
D
Rys. 1c. Krzywa kalibracyjna o ograniczonym zakresie stosowania
Na przedstawionej na Rys. 1c krzywej kalibracyjnej do celów analitycznych nadaje się zakres
stÄ™\
eń od 0 do 5 (odcinek krzywej 0D). Krzywą kalibracyjną nale\
y wykonywać w dniu pomiarów,
zmiana warunków pomiarów (np. temperatury) czy u\
ycie innej partii odczynników mo\
e
powodować przesunięcie krzywej kalibracyjnej na osi Y lub zmianę nachylenia prostej Y = f(c).
Na wartość wielkości mierzonej mo\
e mieć du\
y wpływ matryca, czyli to wszystko, co
wprowadzamy do układu pomiarowego poza substancją oznaczaną. Udział matrycy nale\
y
uwzględnić przy sporządzaniu roztworów wzorcowych, dbając by roztwory wzorcowe miały skład i
właściwości fizyko-chemiczne jak najbardziej zbli\
one do właściwości roztworu analitu.
Zmniejszenie wpływu matrycy na wartość wielkości mierzonej mo\
na niekiedy uzyskać przez
wprowadzanie do próbki substancji maskujących. Ograniczenie wpływu matrycy mo\
e być trudne
Metody analizy ilościowej 6
lub niemo\
liwe, jak często bywa w przypadku próbek środowiskowych, nale\
y wtedy zastosować
metodę dodawania wzorca lub zmienić sposób przygotowania próbki do pomiarów.
2. Wybrane wielkości w statystycznej analizie wyników
Analiza statystyczna pozwala na ocenę uzyskanych wyników w kategoriach
matematycznych. Poni\
ej przedstawione zostanÄ… tylko wybrane, podstawowe wzory.
" Średnia arytmetyczna z n wyników wyra\
ana jest wzorem:
xi
"
x = (8)
n
gdzie xi oznacza pojedynczy wynik.
" Odchylenie standardowe pojedynczego wyniku (SD, standard deviation), które jest
miarą rozrzutu wartości indywidualnych wokół średniej, obliczamy ze wzoru:
2
- x)
"(xi
SD = (9)
n -1
" Błąd standardowy, zwany odchyleniem standardowym średniej arytmetycznej (SE,
standard error), wyra\
a siÄ™ wzorem:
2
- x)
SD
"(xi
SE = = (10)
n(n -1)
n
" Względne odchylenie standardowe średniej arytmetycznej (RSE, relative standard
error) określa wielkość błędu standardowego wobec wartości średniej i wyra\
ane jest w
%:
SE
RSE = 100 (11)
x