L A B O R A T O R I U M 9 - 1 0 / 2 0 1 0 LABORATORI UM PRZEMYSA
OWE
|
Oznaczanie aminokwasów
w żywności i suplementach diety
Przygotowanie próbek
STRESZCZENIE Wśród substancji o najważniejszych składników po- do zaspokojenia potrzeb pokarmowych
niezbędnych do prawidłowego karmowych niezbędnych do utrzy- organizmu. Znajomość składu amino-
funkcjonowania organizmu człowieka Dmania życia człowieka należą białka. kwasowego danego białka lub surowca
istotną rolę pełnią aminokwasy. Stanowią one zasadniczy element budowy ma istotne znaczenie w wypadku wzbo-
Ze względu na szczególne właściwości wszystkich tkanek i wielu czynnych bio- gacania żywności w deficytowe amino-
biologiczne znajdują zastosowanie logicznie związków, takich jak enzymy, kwasy, jak również w produkcji środków
w produkcji żywności jako składniki hormony czy elementy układu odporno- spożywczych specjalnego przeznaczenia
funkcjonalne lub substancje dodatkowe ściowego organizmu. Białka biorą również żywieniowego (np. dla niemowląt i małych
o działaniu bioaktywnym, w tym udział w utrzymaniu bilansu wodnego dzieci, sportowców, dla osób stosujących
przeciwutleniającym. W artykule oraz współuczestniczą w utrzymywaniu diety o ograniczonej zawartości energii)
omówiono cele oznaczania równowagi kwasowo-zasadowej ustroju. oraz suplementów diety.
aminokwasów w żywności, a także Synteza białek w organizmie człowieka Do ważnych zadań analizy surowców
przedstawiono przegląd metod odbywa się tylko przy dostępności od- i produktów spożywczych należy rów-
przygotowania próbek do analizy oraz powiednich aminokwasów. Głównym ich nież ocena ich jakości  rozpatrywanej
metod oznaczania aminokwasów z
ródłem są procesy trawienia i wchłania- w aspekcie atrakcyjności sensorycznej
w żywności i w suplementach diety. nia białek pokarmowych, a pobocznym  oraz zdrowotności. Jest ona determino-
SA
OWA KLUCZOWE pula białek ustrojowych oraz biosynteza wana obecnością w żywności specyficz-
przygotowanie próbek, oznaczanie niektórych aminokwasów z kwasów orga- nych aminokwasów lub ich pochodnych.
aminokwasów, żywność nicznych na drodze transaminacji. Udział aminokwasów w kształtowaniu
Organizm człowieka i innych ssaków smakowitości żywności wynika przede
SUMMARY Amino acids are the nie potrafi syntetyzować następujących wszystkim z ich zdolności do potęgo-
major substances that are essential for aminokwasów biogennych (białkowych): wania smaku innych substancji przez
the effi cient functioning of the human walina, leucyna, izoleucyna, treonina, me- wzmocnienie lub przedłużenie wrażenia
body. Due to their special biological tionina, lizyna, fenyloalanina i tryptofan smakowego. Do zidentyfikowanych po-
properties amino acids are used in food  są to aminokwasy egzogenne (niezbęd- tencjatorów smaku należą kwas glutami-
processing as functional compounds ne), które muszą być dostarczane syste- nowy i jego sole. Aminokwasy są również
or bioactive and antioxidative food matycznie z pożywieniem. Pozostałymi prekursorami związków aromatycznych
additives. In this paper, the aims aminokwasami określanymi mianem en- powstających podczas przemian chemicz-
of analysis of amino acids in food have dogennych lub względnie egzogennych nych towarzyszących procesom technolo-
been presented. The review of methods są odpowiednio: glicyna, alanina, cysteina, gicznym, którym poddawany jest surowiec
of sample preparation and determination prolina, tyrozyna, kwas asparaginowy, lub produkt spożywczy.
of amino acids in food products and kwas glutaminowy, asparagina, glutamina Z przedstawionym powyżej celem
supplements have been also described. oraz histydyna, seryna i arginina. Istnie- oznaczania aminokwasów wiąże się rów-
KEY WORDS sample preparation, je również osobna grupa aminokwasów, nież możliwość przewidywania zmian
determination of amino acids, food w większości niebiałkowych, które pełnią właściwości aminokwasów i białek oraz
specyficzne funkcje w organizmie czło- możliwych interakcji z innymi składni-
wieka lub w żywności. Należą do nich kami żywności podczas jej wytwarzania
m.in.: ornityna, cytrulina, homoseryna, i przechowywania. Skutkiem zastosowa-
homocysteina, tauryna, hydroksyprolina nia zbyt wysokiej temperatury obrób-
i hydroksylizyna. ki cieplnej bądz
alkalizacji produktu
może być rozpad aminokwasów lub ich
CELE OZNACZANIA niepożądana przemiana do izomerów
AMINOKWASÓW optycznych o konfiguracji D. Ważną
dr inż. Dorota Gałkowska1
Zasadniczym celem analizy ilościowej konsekwencją wysokotemperaturowego
dr Monika Gałkowska-Pachota2
i jakościowej danego białka, surowca lub przetwarzania żywności jest także siecio-
1
KATEDRA ANALIZY I OCENY JAKOŚCI ŻYWNOŚCI, WYDZIAA
TECHNOLOGII
produktu spożywczego jest ocena jego wanie aminokwasów  z utworzeniem
ŻYWNOŚCI, UNIWERSYTET ROLNICZY IM. H. KOA
A

TAJA W KRAKOWIE
2
OŚRODEK BADAC
I KONTROLI ŚRODOWISKA SP. Z O.O. W KATOWICACH wartości odżywczej, a więc przydatności lizynoalaniny lub histydynoalaniny 
44
LABORATORI UM PRZEMYSA
OWE L A B O R A T O R I U M 9 - 1 0 / 2 0 1 0
|
prowadzące do obniżenia strawności wykorzystania oznaczania o-tyrozyny
białka oraz zmniejszenia biodostępności w celu identyfikacji żywności poddawa-
żelaza, miedzi i cynku. Oznaczanie tych nej działaniu promieniowania gamma.
ostatnich związków jest wykorzystywane Napromieniowywanie fenyloalaniny
m.in. w ocenie prawidłowości procesów (aminokwasu będącego podstawowym
przetwórstwa mleka. Z powyższym za- budulcem większości białek w żywno-
gadnieniem wiąże się również badanie ści) powoduje jej utlenienie do o- i m-
zawartości furozyny (e�-N-2-furoilometylo- tyrozyny, przy czym stopień konwersji
L-lizyny) w produkcie, będącej  obok fenyloalaniny do powyższych izomerów
lizynoalaniny  jednym z głównych jest proporcjonalny do zaabsorbowanej
produktów reakcji Maillarda zachodzą- dawki promieniowania oraz temperatury
cych podczas obróbki cieplnej żywno- panującej podczas tego procesu. Anali-
ści. Pierwszy etap tych reakcji polega za ta znajduje zastosowanie szczególnie
na addycji grupy aminowej aminokwasu w odniesieniu do takich surowców jak
(lizyny) do grupy karbonylowej cukru re- drób, ryby oraz krewetki.
dukującego (np. laktozy), a kolejne etapy Istotnym zagadnieniem w aspekcie
obejmują szereg przemian chemicznych bezpieczeństwa żywności jest określanie
produktów pośrednich, prowadzących zawartości asparaginy. Uważa się, że ami-
do otrzymania związków melanoido- nokwas ten jest prekursorem akrylamidu,
wych. Analiza furozyny w produkcie związku prawdopodobnie neurotoksycz-
umożliwia zatem śledzenie reakcji Ma- nego i kancerogennego, powstającego
illarda przebiegających podczas pastery- w produktach skrobiowych poddawanych
zacji lub obróbki mleka metodą UHT wysokotemperaturowej obróbce (powyżej
czy podczas dojrzewania serów. Istnieją 121��C)  np. w chipsach ziemniaczanych
również doniesienia, iż obecność furo- oraz we frytkach.
zyny w jajach może stanowić wskaz
nik Niezwykle ważnymi obszarami zasto-
ich świeżości, a także może świadczyć sowań analizy aminokwasów jest anality-
o niekorzystnych przemianach składni- ka medyczna oraz farmacja. Oznaczanie
ków danego produktu wywołanych wpły- aminokwasów w płynach ustrojowych
wem wysokiej temperatury, np. podczas stanowi narzędzie wczesnej diagnostyki
suszenia owoców, produkcji przetworów wrodzonych chorób metabolicznych,
pomidorowych oraz makaronu i innych takich jak fenyloketonuria, alkaptonuria
produktów zbożowych. czy bielactwo. W tym aspekcie konieczne
Inny obszar zastosowań analizy ami- jest wyeliminowanie specyficznego amino-
nokwasów w technologii żywności do- kwasu z żywności przeznaczonej dla osób
tyczy wykrywania zafałszowań żywno- cierpiących na powyższe choroby.
ści. Przykładami mogą być: oznaczanie
4-hydroksyproliny i 5-hydroksylizyny PRZYGOTOWANIE
jako wskaz
ników obecności niskowar- PRÓBEK DO ANALIZY
tościowego białka (kolagenu, żelatyny) Wybór procedury oznaczania aminokwa-
wprowadzonego do produktów mięsnych. sów w żywności i suplementach diety
Podobnie, obniżona zawartość 3-metylo- uzależniony jest wieloma czynnikami,
histydyny, związku charakterystycznego m.in. rodzajem matrycy, przewidywa-
dla białek miofibrylarnych mięsa (miozy- nym stężeniem aminokwasów w próbce
ny i aktyny), może świadczyć o dodatku oraz wymaganą selektywnością i czuło-
kolagenu (białka tkanki łącznej) lub białek ścią oznaczenia. Celem analizy może
pochodzenia roślinnego do przetworów być oznaczanie profilu wolnych amino-
mięsnych. kwasów bądz
tzw. profilu całkowitego,
Ze względu na fakt, iż niektóre bakterie obejmującego zarówno aminokwasy
wykazują zdolność racemizacji aminokwa- wolne, jak i związane w białkach. Nie-
sów, identyfikacja izomerów D może być jednokrotnie do zadań analityka należy
narzędziem oceny jakości mikrobiologicz- określenie zawartości w próbce specy-
nej żywności. Z drugiej strony naturalna ficznych aminokwasów (np. tryptofanu,
zawartość tych izomerów w wybranej o-tyrozyny, tauryny) lub wybranej grupy
żywności (np. w occie, winogronach, wi- aminokwasów (np. egzogennych lub siar-
nie, piwie, miodzie lub w mleku) stanowi kowych). We wszystkich wypadkach ana-
podstawę do stwierdzenia jej autentycz- liza obejmuje dwa następujące po sobie
ności, odmiany czy też pochodzenia geo- etapy: przygotowanie próbki i właściwe
graficznego. Interesująca jest możliwość oznaczenie aminokwasów.
45
reklama
L A B O R A T O R I U M 9 - 1 0 / 2 0 1 0 LABORATORI UM PRZEMYSA
OWE
|
Przygotowanie próbki do oznaczania
wolnych aminokwasów polega na eks-
odstawowym celem
trakcji analitów z próbki, oczyszczeniu
Poznaczania aminokwasów
ekstraktu, a następnie, w większości wy-
padków, przekształceniu aminokwasów w żywności jest ocena jej
w odpowiednie pochodne  przed ich
wartości odżywczej.
rozdzieleniem wybraną metodą anali-
tyczną lub po nim. Przy oznaczaniu
całkowitej zawartości aminokwasów jest
wymagane przeprowadzenie uprzedniej metodach dotyczą takich
hydrolizy białek. Po tym etapie nastę- czynników, jak: masy
puje rozdzielenie mieszaniny aminokwa- cząsteczkowe oddzie-
sów i analiza ilościowa poszczególnych lanych aminokwasów,
związków. odzysk analitów, jak
Typowymi ekstrahentami wolnych również kompatybilność
aminokwasów z nierozpuszczalnych z techniką derywatyzacji lub
w wodzie stałych matryc (np. zbóż, rozdzielania.
mięsa, ryb) są woda oraz rozcieńczony Określenie wartości
(1 M) roztwór kwasu solnego, którymi odżywczej żywności
zadaje się rozdrobnioną lub zmieloną wymaga znajomości
próbkę. Stosowane są również stężone całkowitego profilu
roztwory mocnych kwasów (5-procentowy aminokwasów. W ta-
kwas trichlorooctowy, 4-procentowy kwas kim wypadku analiza
5-sulfosalicylowy), jak również roztwory musi być poprzedzona
alkoholowe zawierające 75% lub więcej hydrolizą białek. Wy-
etanolu lub metanolu. Roztwór wyeks- różnia się następujące typy
trahowanych aminokwasów oddzielany hydrolizy: kwasową, zasadową
jest od pozostałych składników próbki oraz enzymatyczną, przy czym
przez jej wirowanie w warunkach obni- ta pierwsza jest najczęściej wybie-
żonej temperatury (4��C) i filtrację przez rana w analityce żywności. Polega ona
włókno szklane. W odniesieniu do próbek na długotrwałym trawieniu białek roz-
ciekłych (np. soków, napojów) ekstrakcja tworem kwasu mineralnego, którym naj- w 4 M roztworze wodorotlenku sodu,
nie jest wymagana. częściej jest 6 M roztwór kwasu solnego, potasu, litu lub baru, w temperaturze
Etap oczyszczania próbki jest nie- w temperaturze ok. 110��C (20-96 h) lub 110��C i przez 18 godzin. Hydroliza en-
zbędny do uniknięcia ewentualnych 145��C (4 h). Próbka może być ogrzewana zymatyczna zachodząca pod wpływem
interferencji analitycznych wywołanych elektrycznie lub mikrofalowo. Ze wzglę- enzymów proteolitycznych (trypsyny,
obecnością w ekstrakcie substancji innych du na możliwość degradacji niektórych chymotrypsyny, karboksypeptydazy, pa-
niż aminokwasy (białek, polipeptydów, aminokwasów w opisanych warunkach painy, termolizyny lub pronazy) umoż-
węglowodanów, tłuszczów). Deproteini- wymagane jest, aby proces był prowa- liwia analizę sekwencji specyficznych
zację próbki (usunięcie z niej białek i po- dzony bez dostępu tlenu (w atmosfe- aminokwasów w białku.
lipeptydów) można osiągnąć metodami rze azotu), w zamkniętych naczyniach. Kolejnym etapem w przygotowaniu
chemicznymi lub fizycznymi. Metody W celu zminimalizowania strat najbar- próbki, służącym poprawie efektywno-
chemiczne polegają na zastosowaniu dziej labilnych aminokwasów (tyrozyny, ści rozdzielenia lub umożliwieniu bądz

stężonych roztworów mocnych kwasów seryny, treoniny) zaleca się inkubowanie zwiększeniu czułości detekcji amino-
 5-sulfosalicylowego, chlorowego(VII), próbki w roztworze kwasu z dodatkiem kwasów, jest przekształcanie analitów
trifluorooctowego, trichlorooctowego, substancji przeciwutleniającej: fenolu lub w odpowiednie pochodne. Proces ten
pikrynowego  stężonych roztworów siarczanu(IV) sodu. Istnieją również bar- może być przeprowadzony albo przed
soli, np. siarczanu(VI) amonu, lub roz- dziej skomplikowane procedury hydroli- wprowadzeniem analizowanych związków
puszczalników organicznych  metanolu, zy znajdujące zastosowanie w oznaczaniu na kolumnę chromatograficzną (ang. pre-
etanolu, acetonitrylu  w których obec- specyficznych aminokwasów, takich jak: column derivatization), albo po wyjściu
ności białka ulegają wytrąceniu przez de- tryptofan, metionina, cystyna i cysteina badanych substancji z kolumny, przed
naturację, a wolne aminokwasy pozostają oraz glutamina i asparagina. Próbki prze- ich detekcją (ang. postcolumn derivatiza-
w roztworze. Do metod fizycznych nale- znaczone do oznaczania aminokwasów tion). Dobór sposobu derywatyzacji za-
ży m.in. wirowanie ekstraktu na filtrach siarkowych przed hydrolizą kwasem chlo- leży od wybranej metody rozdzielania
membranowych o odpowiednio dobranej rowodorowym traktuje się mieszaniną i/lub techniki detekcji. Głównymi odczyn-
średnicy porów, adsorpcja na żywicach 30-procentowego H2O2 i 88-procento- nikami derywatyzującymi stosowanymi
kationowo-wymiennych, a także filtracja wego kwasu mrówkowego (1:9, obj.). w metodach z detekcją spektroskopową
przez minikolumny C18. Należy zazna- W analizie tryptofanu wielu autorów są: ninhydryna i chlorek dabsylu (detek-
czyć, iż różnice w wymienionych powyżej zaleca prowadzenie hydrolizy alkalicznej cja w świetle widzialnym), fenyloizotio-
46
fot. Shutterstock
LABORATORI UM PRZEMYSA
OWE L A B O R A T O R I U M 9 - 1 0 / 2 0 1 0
|
cyjanian (detekcja w zakresie ultrafiole- matograficzne: chromatografia kationo- poszczególnych analitów. W procedurach
towym), chlorek dansylu i o-ftalaldehyd wo-wymienna (CEC, ang. cation-exchange oznaczania aminokwasów prowadzonych
(detekcja fluorescencyjna lub w zakresie chromatography) oraz wysoko sprawna technikami chromatografii cieczowej lub
ultrafioletowym), fluorescamina (detek- chromatografia cieczowa z odwróconym elektroforezy powszechnie stosowane są de-
cja fluorescencyjna). Elektrochemiczna układem faz (RP-HPLC). Istnieją również tektory spektroskopowe  UV-Vis, fluore-
detekcja aminokwasów jest możliwa doniesienia o praktycznych zastosowa- scencyjne, z indukowaną laserem fluore-
po otrzymaniu ich pochodnych ob- niach metod chromatografii gazowej scencją (LIF, ang. laser induced fluorescence)
darzonych ładunkiem. Derywatyzacja podziałowej (GLC), zwłaszcza do ozna- oraz elektrochemiczne. Uniwersalnymi de-
umożliwiająca rozdzielenie mieszaniny czania metioniny i cysteiny w żywności. tektorami są spektrometry mas z różnymi
racemicznej izomerów L i D aminokwa- Alternatywą dla klasycznego rozdziela- sposobami jonizacji aminokwasów.
sów polega na przeprowadzeniu reakcji nia chromatograficznego aminokwasów
tych związków z chiralnymi reagentami są kapilarne techniki elektromigracyjne, PODSUMOWANIE
fluorescencyjnymi. Powstałe pochodne z których szczególnie efektywnymi są: elek- Podstawowym celem oznaczania ilościo-
mogą być rozdzielane metodą chroma- troforeza kapilarna strefowa (CZE; ang. wego i jakościowego aminokwasów w żyw-
tograficzną (RP-HPLC, ang. reverse-phase capillary zone electrophoresis) oraz jej zmo- ności jest ocena jej wartości odżywczej.
high performance liquid chromatography) lub dyfikowana wersja z użyciem niejonowej Analiza aminokwasów umożliwia również
elektroforetyczną (CE, ang. capillary elec- substancji powierzchniowo czynnej, jak ocenę surowca lub produktu spożywczego
trophoresis). Zastosowanie chromatografii również elektroforeza kapilarna sprzężona w aspekcie jego atrakcyjności sensorycz-
gazowej (GLC, ang. gas-liquid chromatogra- ze spektrometrią mas z jonizacją poprzez nej i bezpieczeństwa zdrowotnego. Postę-
phy) jako techniki rozdzielania aminokwa- elektrorozpraszanie (CE-ESI-MS; ang. ca- powanie analityczne obejmuje złożone
sów wymaga otrzymania lotnych i termo- pillary electrophoresis coupled with electrospray etapy: przygotowanie próbki i właściwe
stabilnych pochodnych  np. w reakcji ionization mass spectrometry). Należy dodać, oznaczenie aminokwasów. Zarówno cel
estryfikacji aminokwasów, a następnie iż w wypadku bardzo selektywnych me- analizy, jak i rodzaj oznaczanych amino-
N-acetylacji bezwodnikiem kwasowym tod detekcji etap rozdzielania mieszaniny kwasów determinują wybór odpowiedniej
w środowisku bezwodnym. aminokwasów nie jest konieczny. procedury analitycznej. q�
Najczęściej stosowanymi w analizie Rodzaj zastosowanej techniki rozdzie-
żywności metodami rozdzielania mie- lania mieszaniny aminokwasów w głów- Piśmiennictwo dostępne na
szaniny aminokwasów są metody chro- nej mierze determinuje sposób detekcji www.laboratorium.elamed.pl
reklama
47
1. Cieślik E., Niedośpiał A., Mickowska B.: Wykorzystanie elektroforezy kapilarnej w analizie
żywności.  Żywność, Nauka, Technologia, Jakość , 2008, 2 (57), 5-14.
2. Gawęcki J., Hryniewiecki L. (red.).: Żywienie człowieka. Podstawy nauki o żywieniu. Wyd.
Naukowe PWN, Warszawa 2005.
3. Nollet L.M.L. (red.).: Handbook of Food Analysis. Physical Characterization and Nutrient
Analysis. Marcel Dekker, Inc., New York 2004.
4. Stój A., Targoński Z.: Zastosowanie analizy aminokwasów do oceny autentyczności soków z
owoców jagodowych.  Acta Sci.Pol., Technol. Aliment. , 2006, 5 (1), 61-72.
5. Synowiecki J.: Metody oznaczania i badania białek w żywności. [W:] Sikorski Z. (red.):
Chemia żywności. WNT, Warszawa 2007.
6. Szpendowski J., Szymańska E., Białobrzewska M., Kwiatkowska A.: Wpływ dodatku chlorku
wapnia i ogrzewania mleka na skład chemiczny i wartość odżywczą sera salami.  Żywność, Nauka,
Technologia, Jakość , 2008, 1 (56), 126-137.