IDENTYFIKOWANIE

IDENTYFIKOWANIE

POLIMORFIZMÓW

POLIMORFIZMÓW

GENETYCZNYCH

GENETYCZNYCH

MAGDALENA SĘDEK

PODSTAWOWE METODY

PODSTAWOWE METODY

UŻYWANE W BIOLOGII

UŻYWANE W BIOLOGII

MOLEKULARNEJ:

MOLEKULARNEJ:

• ELEKTROFOREZA
• PCR
• SEKWENCJONOWANIE

ENZYMY RESTRYKCYJNE

ENZYMY RESTRYKCYJNE

(ENDONUKLEAZY)

(ENDONUKLEAZY)

• W biologii molekularnej wykorzystuje

się enzymy restrykcyjne typu II

• Tną one DNA w ściśle określonych

miejscach

• Rozpoznają miejsca kilku nukleotydowe
• Mogą dawać lepkie albo tępe końce
• Izolowane są z różnych gatunków

drobnoustrojów od których biorą swoje

nazwy np. EcoRI z Escherichia coli

LEPKIE I TĘPE KOŃCE

LEPKIE I TĘPE KOŃCE

LEPKIE KOŃCE -

LEPKIE KOŃCE -

PRZYKŁAD

PRZYKŁAD

LEPKIE KOŃCE -

LEPKIE KOŃCE -

PRZYKŁAD

PRZYKŁAD

PRZYKŁADY ENZYMÓW

PRZYKŁADY ENZYMÓW

RESTRYKCYJNYCH

RESTRYKCYJNYCH

ELEKTROFOREZA W

ELEKTROFOREZA W

ŻELU

ŻELU

• Metoda polegająca na rozdzieleniu

kwasów nukleinowych (DNA, RNA) lub

białek w żelu w zależności od ich

wielkości, ładunku, konformacji itp.

• Żel zawiera pory przez które cząsteczki

migrują pod wpływem pola

elektrycznego

ELEKTROFOREZA

ELEKTROFOREZA

• Rozdział zachodzi w żelu:
• Agarozowym – zawiera duże pory,

używany do rozdziału dużych

cząsteczek, głównie DNA ale też RNA,

metoda szybka

• Poliakrylamidowym – w zależności od

stężenia możemy uzyskać bardzo duże

lub bardzo małe pory, głównie używany

do rozdziału białek ale też DNA, metoda

wolniejsza ale bardziej dokładna

ELEKTROFOREZA DNA

ELEKTROFOREZA DNA

• DNA posiada ładunek ujemny i migruje od

anody (-) do katody (+)

• Duże cząsteczki (dłuższe) migrują wolniej

a mniejsze (krótsze) szybciej

• DNA jest bezbarwny, aby go zobaczyć

musimy dodać do żelu bromku etydyny,
który interkaluje do DNA

• Bromek etydyny fluoryzuje pod wpływem

promieniowania UV

AGAROZA – POLIMER

AGAROZA – POLIMER

WĘGLOWODANOWY IZOLOWANY ZE

WĘGLOWODANOWY IZOLOWANY ZE

ŚCIANY KOMÓRKOWEJ KRASNOROSTÓW

ŚCIANY KOMÓRKOWEJ KRASNOROSTÓW

1.

1.

Odważamy odpowiednią

Odważamy odpowiednią

ilość agarozy

ilość agarozy

2. Dodajemy odpowiednią

2. Dodajemy odpowiednią

ilość buforu

ilość buforu

3. Całość podgrzewamy aby

3. Całość podgrzewamy aby

rozpuścić agarozę

rozpuścić agarozę

4. Przygotowujemy aparat

4. Przygotowujemy aparat

do wylania żelu

do wylania żelu

5. Wylewamy żel

5. Wylewamy żel

6. Czekamy około pół

6. Czekamy około pół

godziny aż żel stężeje

godziny aż żel stężeje

6. Żel umieszczamy w

6. Żel umieszczamy w

aparacie i zalewamy

aparacie i zalewamy

buforem

buforem

7. Przygotowujemy próbkę

7. Przygotowujemy próbkę

do nałożenia na żel

do nałożenia na żel

8. Nakładamy próbkę na

8. Nakładamy próbkę na

żel

żel

9. Podłączamy aparat do

9. Podłączamy aparat do

źródła prądu

źródła prądu

10. Czekamy około godziny

10. Czekamy około godziny

aż żel się rozwinie

aż żel się rozwinie

11. Umieszczamy żel pod

11. Umieszczamy żel pod

źródłem UV

źródłem UV

12. Robimy zdjęcie i

12. Robimy zdjęcie i

analizujemy żel

analizujemy żel

PCR

PCR

(Polymerase Chain

(Polymerase Chain

Reaction) Reakcja

Reaction) Reakcja

Łańcuchowa Polimerazy

Łańcuchowa Polimerazy

•Reakcja polegająca na

amplifikacji (powieleniu)
danego fragmentu DNA

CO POTRZEBUJEMY ABY

CO POTRZEBUJEMY ABY

ZASZŁA REAKCJA PCR?

ZASZŁA REAKCJA PCR?

• Matryca – cząsteczka DNA której

fragment chcemy amplifikować

• dNTPy - Deoksyrybonukleotydy

trójfosforanów (Literki A,C,T,G)

• Startery – krótkie (do 20 bp)

oligonukleotydy

• Termostabilna Polimeraza – zdolna do

pracy w wysokej temperaturze (>70°C)

• Bufor, jony magnezu

POKAZ PCR

POKAZ PCR

ZALETY

ZALETY

• Szybkość
• Czułość
• Specyficzność
• Łatwość w zastosowaniu
• Bardzo szerokie zastosowanie
• Umożliwia pracę na bardzo małych

ilościach DNA - wystarczy jedna
komórka

OGRANICZENIA

OGRANICZENIA

• Musimy mieć informacje o sekwencji

którą klonujemy aby zaprojektować
startery

• ALE: możliwość użycia losowych

starterów

• Możliwość klonowania niewielkich

fragmentów DNA (do kilku tysięcy par
zasad)

• ALE: użycie kombinacji kilku polimeraz

umożliwia klonowanie fragmentów nawet
do 42 kb

OGRANICZENIA METODY

OGRANICZENIA METODY

PCR

PCR

• Niedokładność - polimeraza nie

posiada aktywności egzonukleazy, im
dłuższy fragment tym większe
prawdopodobieństwo błędu

• ALE: nowsze polimerazy posiadają

aktywność egzonukleazy i dużo
rzadziej się mylą

INNE PCR

INNE PCR

•Reverse Transcriptase PCR

– PCR z użyciem odwrotnej
transkryptazy

•Real Time PCR – PCR w

czasie rzeczywistym

SEKWENCJONOWANIE

SEKWENCJONOWANIE

• Technika ustalania kolejności

nukleotydów w sekwencji DNA

• Dzięki elektroforezie w żelu

poliakryloamidowym następuje

rozdział cząsteczek DNA różniących

się jednym nukleotydem

• Dwie metody wprowadzone w

latach 70tych

METODY SEKWENCJONOWANIA

METODY SEKWENCJONOWANIA

METODA CHEMICZNEJ DEGRADACJI DNA

(Maxama i Gilberta)

• Sekwencję DNA określa się działając na

wyznakowany radioaktywnie dwuniciowy DNA

związkami chemicznymi, które rozszczepiają

cząsteczki w specyficznych miejscach

poszczególnych nukleotydów

METODA TERMINACJI ŁAŃCUCHA

(Sangera,dideoksy)

• Sekwencję cząsteczki jednoniciowego DNA określa

się dzięki syntezie komplementarnych łańcuchów a

reakcje są zatrzymywane losowo w pozycjach

określonych nukleotydów

• Automatyczne sekwencjonowanie z

wykorzystaniem dideoksyrybonukleotydów

wyznakowanych fluorescencyjnie

CO POTRZEBUJEMY DO REAKCJI

CO POTRZEBUJEMY DO REAKCJI

SEKWENCJONOWANIA METODĄ

SEKWENCJONOWANIA METODĄ

TERMINACJI ŁAŃCUCHA?

TERMINACJI ŁAŃCUCHA?

• Jednoniciowa matryca – przed reakcją nić

DNA denaturujemy

• Starter

• Polimeraza DNA

• Trifosforany deoksyrybonukleotydów

dNTPy (Literki A, T, C, G)

• Trifosforany dideoksyrybonukleotydów

ddNTPy – pozbawione grupy 3’-

hydroksylowej, niezbędnej do utworzenia

reakcji z następnym nukleotydem

POKAZ

POKAZ

SEKWENCJONOWANIA

SEKWENCJONOWANIA

CO OTRZYMUJEMY NA

CO OTRZYMUJEMY NA

KOŃCU?

KOŃCU?