Metody uzyskiwania

chromosomów

człowieka

i analiza

MATERIAŁ BIOLOGICZNY

DO HODOWLI

CHROMOSOMÓW



pełna krew obwodowa



komórki płynu owodniowego – amniocyty



komórki kosmówki (trofoblastu)



krew pępowinowa



tkanki poronionego zarodka



fibroblasty skóry



komórki nowotworowe z wysiękowych
płynów nowotworowych (np. z jamy
otrzewnej, opłucnej)



fragmenty tkanek guzów nowotworowych
pobrane po operacji



komórki nowotworowe pobrane metodą
biopsji cienkoigłowej



szpik kostny (komórki nowotworowe
pochodzące z biopsji szpiku)

POBIERANIE MATERIAŁU

DO BADAŃ

CYTOGENETYCZNYCH

Materiał do badań musi być pobrany jałowo.
Musi być umieszczony w sterylnym,

zamykanym pojemniku.



Krew pobiera się na heparynę z żyły

łokciowej, nie może zawierać skrzepów.



Komórki płynu owodniowego są

uzyskiwane przez amniopunkcję:



wczesną – 12-14 tydzień ciąży



późną – 15-17 tydzień ciąży



Komórki trofoblastu uzyskuje się z kosmówki za

pomocą biopsji przez powłoki brzuszne, rzadziej

przez szyjkę macicy, między 8 a 11 tygodniem ciąży.



Komórki szpiku kostnego pobiera się przez nakłucie

mostka lub talerza kości biodrowej (u dzieci).
Bioptat szpiku wprowadza się natychmiast do

jałowej próbówki zawierającej ogrzany do 37

o

C płyn

hodowlany.

Pojemniki zawierające próbki tkanek do badań muszą być

oznaczone co najmniej dwoma danymi

identyfikacyjnymi pacjenta (np. imię i nazwisko oraz

data urodzenia).

OPTYMALNE ILOŚCI MATERIAŁU DO
BADAŃ:



KREW ŻYLNA

2-10 ML



KREW PĘPOWINOWA 2-10 ML



PŁYN OWODNIOWY

15-20 ML



KOSMÓWKA

10-20 MG



SZPIK KOSTNY

1-2 ML

PRZECHOWYWANIE I TRANSPORT

Czas przechowywania należy ograniczyć do minimum.

Krew

– 24 godziny w temperaturze pokojowej, lub 3

doby w temp. poniżej 4

o

C.

Płyn owodniowy

– nie dłużej niż 24 godziny w temp.

+4

o

C.

Świeże tkanki umieszczone w pożywce

– do 3 dni w

temp. +4

o

C.

Tkanki najlepiej jest zaraz po pobraniu umieszczać

w pojemnikach z podłożem hodowlanym.

Transport tkanek powinien odbywać się w pojemnikach

z podłożem lub bez podłoża w temp. 0

o

C

HODOWLA CHROMOSOMÓW

(IN VITRO)

Z LIMFOCYTÓW

KRWI OBWODOWEJ

SKŁADNIKI:

a)

podłoże Eagle’a

b)

fitohemaglutynina M (PHA)

c)

sól sodowa heparyny

d)

płodowa surowica cielęca

e)

penicylina krystaliczna

f)

streptomycyna

g)

Colcemid (kolchicyna)

h)

KCl – 0,075 M

i)

płyn Carnoy’a

j)

barwnik Giemsy

PRZYGOTOWANIE PŁYNU

HODOWLANEGO

Do sterylnej butelki odmierzamy 100 ml
płynu Eagle’a, dodajemy:



fitohemaglutyninę M

– stężenie 1%



penicylinę krystaliczną – stężenie 100 IU /

ml



streptomycynę

– stężenie 100

g/ml

ZAKŁADANIE I PROWADZENIE

MAKROHODOWLI

Hodowlę komórkową zakładamy w
sterylnych jednorazowych naczyniach
hodowlanych NUNC o pojemności 25
ml w warunkach jałowych (komora
laminarna).

a)

do sterylnej próbówki z 1 ml heparyny
(stężenie – 50IU / 1 ml krwi) pobieramy
od pacjenta 10 ml krwi żylnej
odstawiamy na ok. 2 godz. do
sedymentacji w temperaturze
pokojowej.

b)

pobieramy osad krwinek białych wraz
z 1 ml osocza, przenosimy do naczynia
hodowlanego z 8 ml wyżej opisanego
płynu hodowlanego, dodajemy 1 ml
surowicy płodowej cielęcej.
Naczynie szczelnie zamykamy.
Końcowa objętość hodowli wynosi 10
ml.

c)

przenosimy naczynko hodowlane do
cieplarki i prowadzimy hodowlę w temp.
37

o

C przez 48-72 godz.

Każdego dnia hodowlę dokładnie
mieszamy.

d)

na 2 godziny przed zakończeniem
hodowlę wyjmujemy z cieplarki, dodajemy
Colcemid (kolchicyna) w stężeniu 0,15
g / ml i ponownie wstawiamy do cieplarki

na ostatnie 2 godz.

WYKAŃCZANIE HODOWLI

a)

wyjętą z cieplarki zawartość naczynka
hodowlanego przelewamy do sterylnych
próbówek wirowniczych, wstawiamy do
wirówki, wirujemy 7 min, 800 obr. / min.

b)

zlewamy płyn znad osadu, próbówkę
wstrząsamy i dodajemy do osadu kroplami
10 ml 0,075 M KCl (0,55% KCl).
Pozostawiamy na 17 min. w temp.
pokojowej, wirujemy 7 min, 800 obr. / min.

c)

zlewamy płyn znad osadu, a do osadu

dodajemy ok. 10 ml płynu Carnoy’a

(mieszanina metanolu i kwasu octowego

lodowatego w proporcji 3:1).
Próbówki umieszczamy w lodówce na 10 min.
Wirujemy 7 min, 800 obr. / min – czynność

powtarzamy 3-krotnie.

d)

po ostatnim wirowaniu zlewamy płyn znad

osadu, a osad nakraplamy na oziębione

szkiełka podstawowe.

e)

po wysuszeniu preparaty barwimy barwnikiem

Giemsy.

ZAKŁADANIE I PROWADZENIE

MIKROHODOWLI

Mikrohodowla stosowana jest powszechnie
w rutynowej diagnostyce noworodków i
małych dzieci.



odczynniki - jak w makrohodowli.



przygotowanie płynu hodowlanego –
jak w makrohodowli.

Mikrohodowlę zakładamy w wysterylizowanych
buteleczkach po penicylinie o pojemności 5 ml
lub w naczynkach plastikowych.

Do 2 ml płynu hodowlanego dodajemy 4 krople
(0,3 – 0,5 ml) pełnej krwi (pobranej z pięty lub
żyły ciemieniowej).

Hodowlę prowadzi się przez 72 godziny wg
tych samych procedur jak w przypadku
makrohodowli.

HODOWLA CHROMOSOMÓW

(IN VITRO)

Z KOMÓREK

SZPIKU KOSTNEGO

Bioptat szpiku (1-2 ml) należy wprowadzić
natychmiast do uprzednio przygotowanej
jałowej próbówki, zawierającej ogrzany do
37

o

C płyn hodowlany, np. RPMI 1640 z

dodatkiem 15% płodowej surowicy cielęcej
oraz antybiotyki (penicylinę,
streptomycynę) w standardowych
stężeniach. Dodatkowo próbówka powinna
zawierać heparynę w stężeniu 250 IU/ml

ZAKŁADANIE I PROWADZENIE

HODOWLI

Są dwie drogi postępowania

A.

Metoda uzyskiwania chromosomów
bezpośrednio po pobraniu komórek
ze szpiku kostnego.

B.

Metoda krótkotrwałej hodowli.

METODA BEZPOŚREDNIA

Polega na inkubacji komórek szpiku przez
1-2 godziny w pożywce zawierającej
kolcemid (25 g/ml)

Postępowanie jest zalecane w ostrych
białaczkach szpikowych i limfatycznych

METODA KRÓTKOTRWAŁEJ

HODOWLI

Hodowlę komórkową zakładamy w wyżej
opisanym płynie hodowlanym stosując
rozcieńczenie zawiesiny komórek szpiku
kostnego – 1 milion na ml hodowli.



Komórki hoduje się najczęściej przez okres 24 lub 48

godzin w cieplarce w temp. 37

o

C i 5% stężeniu CO

2

.



Mitozy blokuje się Colcemidem o stężeniu 5-10 g/ml

na okres 45-60 min. przed zakończeniem hodowli.



Szok hipotoniczny w celu odpowiedniego rozproszenia

chromosomów w jądrze przeprowadza się 0,4%

roztworem KCl lub mieszaniną o składzie:



3,0 g KCl



4,8 g HEPES



0,2 g EGTA

w 1000 ml wody o pH 7,4.



Dalsze etapy utrwalania i wykańczania hodowli
w obu metodach są podobne jak w
standardowych technikach cytogenetycznych.



W przypadku białaczek, gdy komórki
nowotworowe znajdują się we krwi
obwodowej, stosuje się 24-48 godzinne
niestymulowane mitogenami hodowle komórek
pobranych drogą nakłucia żylnego.



Zasady barwienia chromosomów komórek
szpiku są takie same, jak chromosomów
uzyskanych z innych tkanek człowieka.

HODOWLA CHROMOSOMÓW

(IN VITRO)

Z TKANEK POCHODZĄCYCH

Z GUZÓW NOWOTWOROWYCH

Transport guza



jałowe naczynie



płyn Hanksa lub Eagle’a lub
0,9% NaCl + antybiotyki: penicylina

krystaliczna (100 IU / ml), streptomycyna (100

g / ml)

Przygotowanie tkanek guza



1-3 cm

3

tkanki guza przenosimy na szalkę

Petriego



rozdrabniamy tkankę guza nożyczkami



dodajemy 2 ml płynu Hanksa z antybiotykami i

dalej rozdrabniamy.

Skład płynu hodowlanego:



płyn RPMI z penicyliną (100 IU/ml) i
streptomycyną (100 g / ml)



10-15 % v/v surowica płodowa cielęca



1 ml L-glutaminy

Przeniesienie tkanki guza do naczynka

hodowlanego NUNC,

w którym znajduje się:



5 ml płynu hodowlanego



1 ml kolagenazy o stężeniu 150-200 IU/ml

Całość pozostawiamy w cieplarce (37

o

C, 5%

CO

2

, 24 h)



po 24 godzinach rozpipetowujemy



przenosimy materiał do dużej próbówki
wirowniczej



dodajemy 10 ml płynu RPMI z antybiotykami



zamykamy i wirujemy 10 min, 1000 obr./min



po odwirowaniu dodajemy 1,5 ml płynu RPMI

ZAKŁADANIE I PROWADZENIE

HODOWLI

Zakładanie hodowli



Naczynie szklane:

•

8,5 ml płynu hodowlanego

•

1,5 ml zawiesiny komórek guza



Naczynie plastikowe:

•

4,5 ml płynu hodowlanego

•

0,5 ml zawiesiny komórek guza

Hodowlę prowadzimy w cieplarce w temp 37

o

C, z

przepływem 5% CO

2

.

Codziennie oglądamy w mikroskopie odwróconym

wzrost hodowli.

Uwaga: co 2-3 dni zmieniamy płyn hodowlany.

Zakończenie hodowli



Przy widocznych mitozach (po kilku,

kilkunastu dniach i więcej), na okres od 30

min do 2 godz. przed zakończeniem hodowli

dodajemy Colcemid w stężeniu 5-10 g/ml.



Następnie zdrapujemy „drapaczką” komórki

hodowli.



Całość zlewamy do próbówek wirowniczych



Wirujemy 10 min. 1100 obr./min

Przeprowadzenie szoku hipotonicznego

Skład płynu hipotonicznego



KCl

- 1,5 g



HEPES -

2,4 g



EGTA - 0,1 g



500 ml dejonizowanej H

2

O

pH = 7,4 doprowadzić NaOH  HCl
Szok hipotoniczny prowadzimy w temp. 37

o

C,

45 min.

Wirujemy 10 min 1100 obr. / min

Utrwalanie materiału komórkowego



metanol (cz.d.a.) : lodowaty kwas octowy
(cz.d.a.) w proporcji 3:1



czynność powtarzamy 3-krotnie przez 20
minut



wirowanie – 10 min, 1100 obr./min



nakrapianie na zimne (wyjęte z wody z
lodem) szkiełka podstawowe.



Szybki wzrost komórek:



możliwość zahamowania kontaktowego
wzrostu



wykonujemy wtedy pasażowanie w
użyciem roztworu trypsyny i zakładamy
2 hodowle z 1



Brak przyczepu komórek do ścianki
naczynia hodowlanego:



zakładamy ponownie hodowlę w
buteleczkach z Vitrogenem
(Kollagen)

Dodatkowe czynności, które mogą
być wykonane w czasie
prowadzenia hodowli:



Nadmiar erytrocytów:



Płuczemy komórki hodowlane w płynie

niszczącym erytrocyty



Bufor do rozpuszczania erytrocytów:

•

NH

4

Cl -

8,29 g

•

KHCO

3

-

1,0 g

•

EDTA - 0,0371 g

Rozpuścić w 1000 ml H2O destylowanej
Bufor wstawić do autoklawu na 15 min.

Budowa nukleosomu

DNA

histon H1

8 cząsteczek histonów
rdzeniowych

Nukleosom

11nm

30nm

300nm

700nm

1400nm

2nm

Skondensowany fragment
chromosomu metafazowego -
minipasmo

Fragment podwójnej helisy
DNA

Nukleosomy

Włókno chromatynowe
(solenoid) z upakowanych
nukleosomów

Fragment „rozwiniętego”
chromosomu - pętle

Chromosom
metafazowy

Alberts, et al. Molecular Biology of the Cell, 3rd edn

2

nm

10

nm

30

nm

300

nm

700

nm

1400

nm