Elektroforeza

Ruch substancji rozpuszczonej zachodzący 
pod wpływem przyłożonej zewnętrznie różnicy 
potencjałów.

Prędkość ruchu danej cząsteczki jest stała, 
jeżeli podczas procesu stałe pozostają:

-różnica potencjałów
-natężenie prądu
-pH środowiska
-temperatura
-przewodnictwo i lepkość roztworu

Ruch zależny jest od:

-ładunku cząsteczki
-rozmiaru i geometrii 

cząsteczki

Rodzaje 

elektroforezy

1. Ze względu na rodzaj nośnika np. 
bibułowa

2. Ze względu na rodzaj stosowanego 
prądu np. elektroforeza pulsacyjna

3. Ze względu na rozdzielany 
materiał białka, aminokwasy, DNA, 
RNA 

Elektroforeza polega na rozdziale 

mieszaniny makrocząsteczek pod 

wpływem przyłożonego pola 

elektrycznego. Cząsteczki wędrują 

w żelu w zależności od ich 

ładunku, rozmiaru, kształtu oraz 

oporów ruchu środowiska 

(gęstości żelu). Elektroforezę 

najczęściej prowadzi się na żelach 

poliakrylamidowych. 

Elektroforetyczny 

rozdział białek

Żele działają dodatkowo 
jako sita molekularne:

- żele skrobiowe
- żele celulozowe
- PAGE
(żele 
poliakryloamidowe)

Żele poliakrylamidowe 

Żele poliakrylamidowe używane w metodzie western-blot do rozdziału białek są polimerami akrylamidu i bis-akrylamidu. 

Od proporcji tych dwóch składników zależy gęstość i wymiary porów żelu. Wybór gęstości żelu uzależniony jest od 

wielkości i masy cząsteczkowej analizowanych cząsteczek. Wysoko-cząsteczkowe białka rozdziela się na żelach o niższej 

gęstości natomiast nisko-cząsteczkowe na żelach bardziej gęstych. 

Bardzo często żele poliakrylamidowe 

wzbogacane są w siarczan dodecylu –SDS 

(SDS-PAGE). Dzięki któremu rozdział 

elektroforetyczny zachodzi ze względu na 

ciężar cząsteczkowy rozdzielanych białek 

a nie ich ładunek (SDS opłaszcza białka 

nadając im wypadkową ujemną wartość 

-przez co maskuje ich pierwotny 

ładunek). W polu elektrycznym ujemnie 

naładowane białka migrują w kierunku 

dodatniej elektrody. 

Istotnym czynnikiem wpływającym na dobry 
rozdział białek w żelu poliakrylamidowym jest: 
-odpowiednia szybkość reakcji. (Zbyt szybka 
migracja białek w żelu może powodować ich 
niecałkowity rozdział).
-temperatura buforów. (zbyt wysokie napięcie 
może skutkować podwyższeniem temperatury i 
denaturacją badanych białek). 

Elektroforeza białek w żelu 

poliakrylamidowym w 

obecności SDS 

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym jest techniką 

powszechnie stosowaną w analizie białek. W zależności 

od zastosowanego układu można uzyskać rozdział 

polipeptydów stosownie do różnych właściwości 

fizykochemicznych. Przyjmuje się, że elektroforeza w 

obecności SDS frakcjonuje białka zależnie od ich masy.

Ten typ elektroforezy jest obecnie najczęściej 

stosowany i może być użyty jako jedna metoda 

analityczna lub stanowić element szeregu dalszych, 

bardziej skomplikowanych badań (np. elektroforeza 

dwuwymiarowa, preparatywna, Western blotting

). 

Złożem, w którym następuje rozdział białek jest 

żel poliakrylamidowy, w czasie polimeryzacji oraz 

w trakcie elektroforezy ustawiony w pozycji 

pionowej. Standardowo SDS PAGE jest używana w 

wersji tzw. disc electrophoresis, umożliwiającej 

maksymalne wykorzystanie zdolności 

rozdzielczych tej metody. W praktyce ta 

nieciągłość dotyczy zarówno żelu, który składa się 

jakby z dwóch warstw, jak również buforu do 

elektroforezy: innego w górnym, innego w dolnym 

zbiorniku aparatu do elektroforezy. Próbki 

nakładane na żel w tym układzie mogą mieć 

stosunkowo dużą objętość, ponieważ w czasie 

przechodzenia przez górną warstwę żelu zostają 

zagęszczone do wąskiego pasma, które w dolnym 

żelu rozdziela się na pojedyncze, ostre prążki. 

W rzeczywistości białka rozdzielane są w SDS 

PAGE na zasadzie filtracji, analogicznie do 

metody chromatograficznej sączenia 

molekularnego. 

Ponieważ frakcjonowanie zachodzi w 

zależności od długości łańcucha 

polipeptydowego, można ustalić masę danego 

białka przez porównanie z odpowiednimi 

standardami. Jest to metoda pozwalająca na 

oznaczenie masy białka z dokładnością do 5-

10%, ale niestety nie każdy polipeptyd można 

w ten sposób scharakteryzować (jednym z 

wyjątków są białka histonowe). 

Przyjmuje się, że 
statystycznie jeden anion 
dodecylosiarczanowy 
przypada na dwie reszty 
aminokwasowe. Ponadto do 
rozdzielanych próbek 
dodaje się silne środki 
redukujące, które redukują 
mostki disiarczkowe 
obecne w białkach. Można 
przyjąć, że tempo migracji 
białek jest zależne tylko od 
ich masy i jest wprost 
proporcjonalne do jej 
logarytmu, dlatego też 
możliwe jest stosowanie 
tzw. standardów wielkości 
białek. 

Należy pamiętać o tym, że 
jakość rozdziału w SDS PAGE 
zależy od poprawnego i 
solidnego wykonania szeregu 
prostych czynności. Dlatego 
też mimo, iż technika nie jest 
skomplikowana, może 
zajmować sporo czasu, 
kilkakrotnie więcej niż 
elektroforeza agarozowa 
służąca do rozdziału 
preparatów DNA. 

Wady elektroforezy 

SDS-PAGE

Technika elektroforetyczna SDS-PAGE, mimo iż 
jest bardzo powszechnie stosowana, nie jest 
wolna od wad. Pierwsza z nich wynika z faktu, 
iż pH żelu rozdzielającego jest zasadowe 
(pH=8,8). Zasadowy odczyn powoduke 
powolną hydrolizę żelu, prowadzącą do 
słabszego usieciowania żelu i w konsekwencji 
spadku zdolności rozdzielczej, co sprawia, że 
żele SDS-PAGE nie mogą być przechowane 
dłużej niż 1-2 miesiące. Zasadowe środowisko 
elektroforezy powoduje również tworzenie się 
mostków disiarczkowych, zaś odczynniki 
redukujące nie migrują wraz z białkami, co 
również może mieć negatywny wpływ na 
rozdział białek. 

Ponadto, wraz z przebiegiem elektroforezy, 

pH żelu rozdzielającego rośnie do wartości 

powyżej 9,5, co sprzyja zachodzeniu reakcji 

ubocznych, takich jak deaminacja białek 

oraz addycja niespolimeryzowanego 

akrylamidu do grup aminowych i tiolowych 

w łańcuchach bocznych aminokwasów. 

Zachodzące modyfikacje białek mogą 

utrudniać dalszą ich analizę technikami 

spektrometrii mas. Kolejną wadą jest 

wysoka temperatura podczas denaturacji 

próbek białek, mogąca prowadzić do 

hydrolizy wiązania peptydowego.

Obecność SDS przynosi szereg korzyści: 
-niska cena stosowanych odczynników.
- zdecydowana większość
białek jest rozpuszczalna w elektrolitach 
zawierających SDS 
- separacja białek odbywa się zgodnie z ich 
masami cząsteczkowymi

-barwienia kompleksów białko-SDS jest 
znacznie wydajniejsze niż samego białka

-Obecność SDS skutecznie eliminuje 
enzymatyczną degradację białek w trakcie 
separacji. 

Zalety elektroforezy 

SDS-PAGE