Enzymy modyfikujące końce

•Fosfataza alkaliczna

Źródłem jest jelito cielęce (fosfataza CIP, ang. Calf Intestine Phosphatase)

lub E. coli (fosfataza BAP, ang. Bacterial Alkaline Phosphatase). Jest to
dimeryczny glikoproteid, złożony z dwóch identycznych podjednostek o
masie cząsteczkowej 69 kDa. Zawiera cztery atomy cynku na cząsteczkę.
CIP może być inaktywowany termicznie przez inkubację w 68°C,
natomiast BAP jest w tych warunkach stabilny. BAP jest również oporny
na ekstrakcję fenolową.

Właściwości:

5' fosfataza, usuwająca 5' grupę fosforanową z ssDNA i

dsDNA, ssRNA i dsRNA, z deoksyrybonukleotydotrifosforanów i
rybonukleotydotrifosforanów

Zastosowanie:

(1) Defosforylacja dsDNA w celu uniemożliwienia autoligacji
(2) Defosforylacja DNA i RNA do znakowania końców 5‘ za pomocą kinazy

polinukleotydowej T4

(3) Jako składnik w systemie immunodetekcji

•Kinaza Polinukleotydowa T4

Źródłem są bakterie E. coli zakażone fagiem T4 lub rekombinant E. coli.

Kinaza polinukleotydowa jest tetramerem, złożonym z identycznych
podjednostek o masie cząsteczkowej 33 kDa. Aktywność fosfatazy jest
wyrażana w stosunku do ssDNA i dsDNA, ssRNA i dsRNA i również 3'-
deoksyrybonukleotydomonofosforanów i 3'-
rybonukleotydomonofosforanów.

Właściwości:

(1) 5' kinaza, przenosząca g-fosforan z ATP na koniec 5'-OH cząsteczek

ssDNA, dsDNA, ssRNA lub dsRNA

(2) 3' fosfataza, usuwająca grupy fosforanowe z końców 3' cząsteczek

ssDNA, dsDNA, ssRNA lub dsRNA

Zastosowanie:

(1) Znakowanie końców 5' DNA lub RNA, szczególnie przed reakcjami

sekwencjonowania metodą Maxama-Gilberta, enzymatycznym
sekwencjonowaniem RNA, mapowaniem restrykcyjnym i "
footprintingem"

(2) Fosforylowanie syntetycznych oligonukleotydów
(3) Usuwanie grup fosforanowych z końców 3'.

•Terminalna Deoksynukleotydylo

Transferaza (TdT)

Źródłem enzymu jest trzustka cielęca. Terminalna

deoksynukleotydylo transferaza jest białkiem dimerycznym,
złożonym z dwóch niejednakowych podjednostek o masach
cząsteczkowych 80 i 26 kDa. TdT może również
polimeryzować rybonukleotydy, ale z małą wydajnością.

Właściwości:

Matryco-zależna polimeraza DNA, dosyntetyzująca

deoksynukleotydy do końców 3'-OH na ssDNA lub dsDNA.

(1) W przypadku ssDNA lub dsDNA z lepkimi końcami 3' o

długości co najmniej 2nt:

(2) W przypadku dsDNA z tępymi końcami

Zastosowanie:

(1) Tworzenie homopolimerowych ogonów na końcach

fragmentów

•Nukleaza Mung Bean

Źródłem jest fasola Vigna radiata. Funkcjonalnie

nukleaza Mung Bean podobna jest do nukleazy SI, lecz
cechuje się o wiele mniejszą aktywnością do tworzenia
nacięć w dsDNA i cięcia nienaruszonej nici naprzeciw
nacięcia.

Właściwości:

Endonukleaza specyficzna dla ssDNA,

bardziej aktywna dla ssDNA niż ssRNA

Zastosowanie:

(1) Stosowana alternatywnie w stosunku do nukleazy SI,

gdy cięcie dwuniciowych cząsteczek stanowi problem

(2) Stosowana do usuwania lepkich końców

dwuniciowego DNA

•DNA Polimeraza I (fragment Klenowa)

Źródłem tego enzymu jest produkt proteolizy

polimerazy Kornberga subtilizyną. Enzym ten jest
także otrzymywany z rekombinanta E. coli
syntetyzującego to białko z zmienionego genu polA.
Ma masę cząsteczkową 75 kDa i brak mu aktywności
5’-3' egzonukleazy.

Właściwości:

(1) 5‘-3‘ DNA-zależna polimeraza DNA, wymagająca do

aktywności matrycy jednoniciowego DNA (ssDNA)
oraz startera DNA lub RNA z końcem 3'- OH.

(2) 3‘-5' egzonukleaza, degradująca dwuniciowy DNA

(dsDNA) lub jednoniciowy DNA (ssDNA) od końca 3‘-
OH.

Wyjaśnij rolę IPTG

• Gospodarz bakteryjny posiada wprowadzony do

chromosomu gen kodujący polimerazę RNA faga T7 pod
kontrolą promotora lacUV5, rozpoznawanego przez
bakteryjną polimerazę RNA.

• Transkrypcja z promotora lacUV5 jest indukowana przez

IPTG.

• Pomiędzy promotorem, a genem kodującym polimerazę

RNA T7 znajduje się sekwencja operatorowa, wiążąca
białko represorowe blokujące inicjację transkrypcji.

• Dopiero po związaniu represora z IPTG, co prowadzi do

utraty powinowactwa białka do miejsca operatorowego,
może rozpocząć się transkrypcja genu polimerazy
fagowej.

Enzymy restrykcyjne klasy II

s

• Rozpoznają określone sekwencje w DNA, przecinają cząsteczki w stałych

miejscach, ale nie znajdujących się w obrębie rozpoznawanej sekwencji, lecz
odległych od niej o kilka lub kilkanaście nukleotydów. 

Klasa II- ogólnie
• - najważniejsze dla inżynierii genetycznej,
• - posiadają wysoką specyficzność rozpoznawanej sekwencji
• - dają powtarzalne produkty cięcia
• - nie wymagają ATP i S-adenozylo-L-metioniny, a jedynie jonów Mg
• - aktywność metylazy i endonukleazy rozdzielone są między dwa białka
• - rozpoznają krótkie najczęściej palindromiczne sekwencje 4-8pz i trawią

DNA w obrębie niej lub w określonej odległości.

Enzymy klasy IIS (sziftery)
• - monomery w roztworze, rozpoznają asymetryczną sekwencję, ale tną w

zdefiniowanej odległości od niej,

• - 1-20 pz
• - np. Fokl – GGATGN

9/13

System restrykcji i modyfikacji.

Cele:
• - ochrona przed degradacją przez restryktazy DNA gospodarza,
• - niszczenie obcego DNA (np. DNA bakteriofaga)
Mechanizm:
• W komórce istnieją dwa enzymy rozpoznające sekwencję

palindromiczną DNA:

a) restryktaza (np. EcoRI),
b) metylaza EcoRI,
• oba enzymy rozpoznają tę samą sekwencję: restryktaza tnie

DNA w jej obrębie (tworzą się lepkie końce); metylaza
natomiast metyluje adeninę występującą w tej sekwencji. Jeśli
sekwencje zawiera zmetylowaną adeninę (A

Me

), miejsce to nie

jest już podatne na działanie restryktazy.

Tworzenie delecji z wykorzystaniem enzymów II

s

Enzymy restrykcyjne klasy IIs przecinają DNA w określonej
odległości od ich miejsca rozpoznania, pozostawiając to
miejsce nienaruszone. Skonstruowano wektor w którym
miejsca rozpoznawania dla enzymów MboII i FokI, ułożone
są kasetowo, tak że kolejne cięcia dwoma enzymami
dawały w konsekwencji dwunasto nukleotydowe delecje w
jednym cyklu.
Trawienie kolejno FokI i MboII
Trawienie MB, usuwanie wiszących końców
Ligacja
Powtarzanie etapów w celu usunięcia odpowiedniej ilości
nukleotydów.

 

dam/dcm metylacja

Większość szczepów E. coli posiada dwie miejscowo
specyficzne metylazy DNA. Metylaza kodowana przez gen
dam (metylaza Dam) przenosi grupę metylową z S-
adenozynometioniny na pozycję N

6

reszty adeniny w

sekwencji GATC. Druga metylaza jest kodowana przez gen
dcm (metylaza Dcm), która metyluje wewnętrzną cytozynę
w sekwencji CCAGG i CCTGG. Metyzacja metylazami
powoduje hamowanie ciecia DNA przez pewne
endonukleazy restrykcyjne, których sekwencja
rozpoznawania jest identyczna z rozpoznawaną przez
metylazę Dam lub Dcm. Ponadto, cięcie DNA przez niektóre
endonukleazy restrykcyjne jest hamowane, gdy ich miejsca
rozpoznawania DNA pokrywają się tylko częściowo z
sekwencjami rozpoznawanymi przez metylazę Dam lub
Dcm.

Jeżeli sekwencje GATC lub CC A/T GG są częścią
sekwencji rozpoznawanej, bądź enzym rozpoznaje i
przecina taką sekwencję bezpośrednio, to fakt ten
ma swoje konsekwencje, jeśli DNA jest otrzymywane
w komórkach E. coli dam+ dcm+. W związku z
metylacją adeniny w sekwencji GATC (dam) i
wewnętrznej cytozyny w sekwencji CC A/T GG (dcm)
w dzikich szczepach E. coli, należy brać pod uwagę
wrażliwość danego enzymu restrykcyjnego na tego
typu metylację substratu. Jeżeli zatem sekwencje
GATC lub CC A/T GG nakładają się na sekwencje
rozpoznawane, należy wiedzieć, że nie każde
istniejące na danym DNA miejsce restrykcyjne dla
odpowiedniego enzymu będzie cięte.

Białka fuzyjne

Białka wiążące się z jednoniciowym DNA (SSB)
• Źródłem są bakterie E. coli, a także ich rekombinant. SSB

jest białkiem tetramerycznym, złożonym z identycznych
podjednostek o masie cząsteczkowej 18,9 kD. Wiąże się
kooperatywnie z ssDNA, lecz nie z dsDNA.

Zastosowanie
• Techniki mutagenezy
• Uwidacznianie ssDNA w mikroskopii elektronowej
• Badanie aktywności DNA helikazy, w połączeniu z

działaniem egzonukleazą I

• Stymulacja przejścia genomów fagowych z ssDNA do dsDNA
• Stymulacja aktywności DNA polimerazy
 

Białko genu 32 faga T4
• Źródło są bakterie E. coli zakażone potrójnym

mutantem faga T4, nadprodukującu rekombinant
E.coli. produkt genu 32 jest białkiem wiążącym się z
ssDNA, stymulującym aktywność DNA polimerazy T4
(5-10 razy). Białko to wiąże się również do ssRNA, lecz
z 10-1000 razy niższą efektywnością.

Zastosowanie
• Stymulacja aktywności DNA polimerazy T4 w

replikacji matrycy ssDNA

• Uwidacznianie ssDNA w mikroskopii elektronowej
• Techniki miejscowo-specyficznej mutagenezy
• Rozpoznawanie uszkodzonego DNA
 

Białko RecA
• Źródłem są bakterie E. coli lub jej rekombinant. Jest

wymagane w homologicznej rekombinacji
genetycznej i w systemach naprawy DNA

Właściwości
• Wiąże się z ssDNA
• DNA-zależna ATPaza
Zastosowanie
• Techniki mutagenezy
• Uwidacznianie ssDNA w mikroskopii elektronowej
• Do rzadkiego i precyzyjnego cięcia dużych

cząsteczek DNA metodą trawienia w „Pięcie
Achillesa”

pUC19

Identyfikacja kolonii bakteryjnych zawierających
plazmidy rekombinowane w przypadku klonowania
fragmentów DNA do wektorów z serii pUC opiera się
ona na porównaniu barwy otrzymanych kolonii.
Kolonie rekombinowane są koloru białego. Kolonie
nierekombinowane są niebieskie. Plazmidy z serii
pUC posiadają N-końcową resztę genu B-
galaktozydazy (LacZ). Miejsce rozpoznania dla
enzymów restrykcyjnych znajduje się w obrębie tego
genu. Wklonowanie inseratu powoduje przerwanie
ciągłości genu, przez co zawarty w podłożu substrat
(X-gal) nie jest hydrolizowany – zmiana ramki
odczytu.

Dodatkowo plazmidy z serii pUC posiadają
gen oporności na ampicylinę (amp), który
jest dodatkowym markerem selekcyjnym.
Wyrosną tylko te kolonie, które posiadają
plazmid, ponieważ wyjściowe szczepy,
przed transformacją, nie posiadały
oporności na ten antybiotyk. Wyrosną tylko
kolonie zawierające plazmid pUC. W
przeciwieństwie do identyfikacji kolonii
bakteryjnych zawierających wektory z serii
pBR 322, ta identyfikacja jest
jednoetapowa.

pBR322

Plazmid pBR322 posiada dwa markery selekcyjne.

Są to dwa geny oporności na antybiotyki. Pierwszy
to gen oporności na ampicylinę, drugi na
tetracyklinę.

Komórki E. coli transformowane plazmidem

rekombinatowym pBR322X (X pożądany gen) na
początku wysiewa się na podłoże LA z tetracykliną
lub ampicyliną (zależy to w obrębie jakiego genu
markerowego klonujemy).

Te kolonie, które wyrosły na takim podłożu (np. z

tetracykliną) na pewno mają gen oporności na
tetracyklinę, ale nie wiemy czy posiadają
wklonowany gen w obrębie genu kodującego
oporność na ampicylinę.

Można to sprawdzić przesiewając
każdą z kolonii, które wyrosły na
podłożu LA z tetracykliną na podłoża
LA z tetracykliną i LA z ampicyliną na
tak zwaną kreskę. Te kolonie, które
wyrosną na podłożu LA z
tetracykliną, ale nie wyrosną na
podłożu LA z ampicyliną są koloniami
komórek E. coli , o które nam chodzi
(doszło do wklonowania genu w
obrębie genu oporności na
ampicylinę).

Cechy wektora

plazmidowego

- Zawiera geny , tzw. Markery selekcyjne, nadające

komórkom gospodarza łatwy do testowania
fenotyp, np. oporność na antybiotyk

- Posiada unikalne miejsca rozpoznawane przez

enzymy restrykcyjne w obrębie rejonów , w które
można wprowadzić obcy DNA, bez naruszania
zdolności wektora do replikacji i możliwości selekcji
zrekombinowanych cząsteczek

- Niezdolny do przeżycia poza komórką gospodarza,

namnażać się w niewielu szczepach, tzn. mieć tzw.
mały zakres gospodarza oraz nie posiada zdolności
koniugacyjnych

Wymagania genetyczne gospodarza

 
- powinien umożliwiać ekspresję klonowanego DNA
- umożliwić zwiększenie ilości kopii

zrekombinowanego wektora

- należy też uwzględnić wpływ klonowanego DNA

na wzrost komórek gospodarza

-

gospodarz powinien też utrzymać stabilność
klonowanego DNA (sekwencyjne rearanżacje,
orientacje insertów DNA itd.)

- komórki muszą być kompetentne

Klonowanie shot-gun

• Polega ona na pocięciu całego DNA

na fragmentu, sekwencjonowaniu
każdego z nich osobno i dopiero
łączeniu w jedną całość. Metoda jest
bardzo oszczędna, aby opracować
wyniki wystarczało 0.2-5.2g włosów.
Pozwoliło to na odczytanie DNA
mitochondrialnego badanych okazów.

Od czego zależy wydajność

polimerazy Taq

- Temperatury, czasu półtrwania enzymu w danej

temperaturze

- Efektywnego stężenia jonów Mg

2+

wpływają na

aktywność enzymu, zwiększają T

m

dsDNA i

tworzą rozpuszczalne kompleksy z dNTP

- Struktury drugorzędowej matrycy
- Stężenia dNTP
- Zwiększenie stężenia enzymu prowadzi do

zmniejszenia specyficzności

- Istnienia czynników blokujących np. w HOT

START

Inhibitory reakcji PCR

- Heparyna całkowicie hamuje amplifikację

matrycowego DNA, cytnynian

- Związki porfirynowe pochodzące z hemu
- Detergenty jonowe hamują aktywność

polimerazy Taq już przy bardzo niskich
stężeniach

- SDS, fenol, EDTA, octan i chlorek sodu
- Proteinaza K może bardzo szybko zdegradować

proteolitycznie polimerazę Taq ślady fenolu
hamują aktywność polimerazy DNA

- sole

Wzmacniacze reakcji PCR

- DMSO lepsza denaturacja matrycowego DNA,

eliminuje tworzenie struktur drugorzędowych przez
primery, obniża T

m

o 5-6°C

- Glicerol – lepsza denaturacja DNA matrycy, eliminacja

tworzenia się struktur drugorzędowych primerów i
matrycy, stabilizuje polimerazę Taq

- Formamid – poprawia wierność, powtarzalność

wyników, czułość, specyficzność amplifikacji,
szczególnie gdy targetem jest sekwencja DNA bogata
w pary G+C

- Glikol polietylenowy (PEG) – Tween 20 – znosi

hamujący efekt pewnych jonowych detergentów
(SDS)

Multipleksowy PCR

- Metoda ta pozwala na równoczesną

amplifikację kilku regionów genomu w jednej
probówce przy zastosowaniu różnych par
primerów.

- obniża koszty eksperymentów,
- oszczędza pracę i czas,
- zmniejsza ryzyko kontaminacji.
- Znalazła szerokie zastosowanie np. do

wykrywania czynników zakaźnych, diagnostyki
chorób genetycznie uwarunkowanych,
wykrywania różnego typu mutacji.

Różnicowy PCR

• Podstawową różnica jest możliwość

amplifikacji genu targetowego i
fragmentu odnośnikowego w tej samej
probówce reakcyjnej.

• Taka równoczesna amplifikacja

ilościowo określonego fragmentu
odnośnikowego i fragmentu o nieznanej
liczbie kopii w jednej probówce może
posłużyć do ilościowego określenia
sekwencji targetowej.

Amplifikacja DNA o nieznanej sekwencji.

- Zastosowanie zdegenerowanych

primerów oligonukleotydowych
(Primery uniwersalne) Zastosowanie
wysoce zdegenerowanych primerów
do reakcji PCR nie wymaga żadnych
specyficznych warunków reakcji,
chociaż obniżenie temperatury
dołączania primerów może być
konieczne w niektórych przypadkach

- Zaprojektowanie primerów na podstawie

znajomości sekwencji aminokwasowej
peptydów lub białek. To podejście napotyka
trudności ze względu na zdegenerowanie
kodu genetycznego (większość aminokwasów
jest kodowana przez więcej niż jeden kodon).
Stąd, primery projektowane na podstawie
sekwencji aminokwasowej powinny być w
pełni redundentne. Z tego też względu na
ogół stosuje się krótkie primery, np.
stosunkowo krótki primer złożony z 15
nukleotydów ma już 512 różnych permutacji.

- Zastosowanie uniwersalnej zasady jaką

jest inozyna, którą można podstawić w
miejscach okupowanych przez 3 lub 4
różne zasady. Inozyna jest zasadą
purynową, naturalnie występującą w
rzadko występującym nukleotydzie
pewnych rodzajów tRNA i ma zdolność
parowania z wszystkimi czteroma
podstawowymi zasadami (A, C, G, T).
Nie zaleca się stosowania inozynowych
nukleotydów przy końcu 3' primera.

PCR – fingerprinting

• powielenie polimorficznego regionu DNA w

reakcji PCR z zastosowaniem odpowiednio
dobranych starterów.

• Jedna z metod PCR fingerprinting

wykorzystuje istnienie repetytywnych
sekwencji w genomach mikroorganizmów
(bakterii, grzybów i pasożytów). Sekwencje te
charakteryzują się określoną długością i są
szeroko rozpowszechnione w genomie. U
bakterii zostały one najwcześniej wykryte i
dobrze scharakteryzowane dla Escherichia coli
i Salmonella typhimurium.

• Przykładem tego typu sekwencji są

REP (ang. Repetitive Chromosomal
Elemets) o długości 38 pz i ERIC
(ang. Enterobacterial Repetitive
Intergenic Consensus) o długości
124-127 pz, występujące u bakterii
Gram ujemnych.

Technika AFLP

AFLP, łączy w sobie dwie metody: RFLP i selektywną

amplifikację PCR

Strategia metody złożona jest z czterech podstawowych

etapów:

·       trawienie totalnego DNA komórkowego z

zastosowaniem dwóch racjonalnie dobranych enzymów
restrykcyjnych;

·       reakcja ligacji otrzymanych fragmentów z odpowiednio

zaprojektowanymi adaptorami;

·       selektywna amplifikacja produktów ligacji z

zastosowaniem dwóch starterów homologicznych do
sekwencji adaptor-miejsce restrykcyjne;

· elektroforeza produktów amplifikacji i autoradiografia

otrzymanych rozdziałów elektroforetycznych.

W odróżnieniu od metod rybotypowania i analizy RFLP

produktów PCR, AFLP opiera się na analizie całego
genomu bakteryjnego.

 
Zaletami metody AFLP są powtarzalność i wysoki stopień

dyskryminacji badanych organizmów.

AFLP okazała się niezmiernie przydatnym narzędziem

taksonomicznym ze względu na możliwość komputerowej
analizy otrzymanych wyników oraz stworzenia na ich
podstawie komputerowej bazy danych.

Jednakże, AFLP nie jest użyteczna w szybkiej identyfikacji

szczepów, ale jest niezmiernie przydatna w studiach
dotyczących fundamentalnych pytań odnośnie
pokrewieństwa klonalnego szczepów.

technika PCR-RFLP

• Produkt amplifikacji poddaje się analizie restrykcyjnej i w

wyniku tego otrzymuje się specyficzny polimorfizm
długości fragmentów restrykcyjnych. Jako cel molekularny
w łańcuchowej reakcji polimerazy stosuje się fragment
DNA specyficzny dla danego gatunku lub kilku gatunków
spokrewnionych o podobnym znaczeniu klinicznym.
Uzyskane produkty amplifikacji można następnie poddać
trawieniu enzymami restrykcyjnymi. W wyniku
restrykcyjnego cięcia produktów PCR otrzymuje się
specyficzny polimorfizm długości fragmentów
restrykcyjnych dla danego DNA (RFLP). Połączenie obu
technik (PCR i RFLP) pozwala na różnicowanie blisko
spokrewnionych organizmów lub szczepów . Wybór
odpowiedniej restryktazy jest podyktowany przez charakter
produktu amplifikacji.

Technika ta stosowana jest do identyfikacji, badania

zróżnicowania genetycznego bakterii, do tworzenia
drzew filogenetycznych oraz do badań
epidemiologicznych. Ponieważ odległości ewolucyjne
mogą być mierzone na podstawie różnic w sekwencji
nukleotydowej bądź aminokwasowej homologicznych
cząsteczek.

Musi ona/on spełniać następujące warunki:
-Być funkcjonalna homologicznie;
-Uniwersalna i rozpowszechniona w grupach, które są

obiektem naszych badań;

-Złożona z elementów silnie zakonserwowanych, a także

z elementów zmiennych;

-Umiejętnie zaszeregowana w celu identyfikacji regionu

sekwencji homologicznej jak i heterologicznej.

Odwrotny PCR

• RT-PCR modyfikacja polegająca na użyciu mRNA jako

matrycy. Synteza DNA na matrycy mRNA odbywa się przy
użyciu odwrotnej transkryptazy (RT). Następnie DNA
namnaża się za pomocą zwykłej reakcji PCR. Metoda ta
pozwala na amplifikację wyłącznie sekwencji zawartej w
dojrzałym mRNA, a więc tylko egzonów. Powstały DNA
określany jest jako cDNA – komplementarny DNA.

• Podstawowe cechy i zalety odwrotnego PCR:

- umożliwia utworzenie cDNA na matrycy RNA
- cDNA jest znacznie stabilniejszy niż RNA
- cDNA może być amplifikowany za pomocą PCR

RNA nie może być podstawą dla reakcji PCR i
wymagane jest użycie odwrotnej transkryptazy w celu
przeprowadzenia reakcji odwrotnej transkrypcji, w
wyniku której powstaje cDNA. cDNA może być
bezproblemowo amplifikowane. RNA zostaje niejako z
powrotem przepisane w gen, z którego uległo
transkrypcji. Za pomocą RT-PCR możemy powielać
transkrypty dowolnych genów.
RT-PCR dzieli się na dwa zasadnicze etapy: reakcja
odwrotnej transkrypcji z udziałem odwrotnej
transkryptazy oraz amplifikacja – czyli wykładnicze
zwielokrotnienie ilości cDNA.

Składniki mieszaniny wymagane do

przeprowadzenia reakcji RT-PCR:

- RNA
- primery (startery)
- dNTPs
- bufor
- odwrotna transkryptaza
- polimeraza Taq

Zanim przeprowadzimy syntezę cDNA musimy posiadać odpowiednie
matryce mRNA. Wyizolowany RNA powinien charakteryzować się wysoką
jakością i powinien być wolny od zanieczyszczeń. Trzy, najczęściej używane
metody pozbywania się zanieczyszczeń: trawienie DNazami, ekstrakcja
mieszana z użyciem fenolu i chloroformu oraz strącanie za pomocą chlorku
litu. Jednakże, ponieważ RT-PCR amplifikuje nawet bardzo małą ilość
materiału – niewielkie uszkodzenie RNA jest tolerowane przez procedurę.

Metoda pół-ilościowa może być

używana do określenia obecności lub
nieobecności danego transkryptu,
określenia jego ilości, klonowania,
tworzenia bibliotek cDNA, konstrukcji
sond i wiele innych.

Rola CaCl

2

oraz bromku etydyny.

• CaCl

2

– zwiększa przepuszczalność

ściany komórkowej dla egzogennego
DNA

• Bromek etydyny – jest czynnikiem

interkalującym, który może wklinować
się pomiędzy zasady DNA i
wykazywać fluorescencję w świetle
UV. ssDNA i RNA mogą także wiązać
EtBr, ale w mniejszych ilościach.

Rola NaOH i chlorowodorku guanidyny

• NaOH – jest czynnikiem

odpowiedzialnym za lizę komórek

• chlorowodorek guanidyny – sól

chaotropowa, zwiększa
powinowactwo DNA do żelu
krzemionkowego

dlaczego się oczyszcza produkt PCR?

• Produkt reakcji PCR należy oczyścić, przed

wykorzystaniem go na przykład jako insertu do
klonowania. Dzięki temu pozbywamy się z próbki
enzymu – polimerazy, a także innych pozostałości
mieszaniny reakcyjnej, jak trójfosforany nukleotydów
czy jony magnezu. Ponadto po oczyszczeniu produktu
zawieszamy go w odpowiednim buforze jakim jest TE.
Nieoczyszczone DNA mogłoby spowodować obniżenie
wydajności kolejnych reakcji przeprowadzanych z
udziałem produktu reakcji PCR, także obecność
enzymu jakim jest polimeraza mogłaby zakłócać
kolejne etapy przeprowadzanej procedury.

Oczyszczania DNA dokonuje się przy

pomocy gotowych zestawów
laboratoryjnych specjalnie do tego
celu opracowanych.

Ponadto, jeżeli produkt PCR jest

rozdzielany na żelu agarozowym to
należy również go oczyścić z żelu.
Najczęściej dokonuje się tego przy
użyciu gotowego zestawu Gel-Out.

marker selekcyjny

Znajdujący się na wektorze gen pozwalający

odróżnić bakterie posiadające plazmid od
takich, które go nie zawierają.

Jako markery najczęściej stosuje się geny

oporności na antybiotyki (np. ampicylinę lub
tetracyklinę).

Podczas transformacji tylko nieliczne bakterie

przyjmują plazmid, ale tylko one będą w stanie
wyrosnąć na pożywce z dodatkiem
antybiotyku. Oczywiście szczep użyty do
transformacji musi być wrażliwy na ten
antybiotyk.

WARUNKI, ABY KOMÓRKI ULEGŁY

TRANSFORMACJI?

• Komórki bakterii muszą znajdować się w stanie kompetencji. Może

być to stan naturalny, bardzo rzadko spotykany (np. Nesseria
gonorrhoeae), bądź indukowany przez szereg czynników, takich jak:

– wzrost stężenia cAMP, które hamuje wzrost komórki i indukuje

kompetencję;

– warunki żywieniowe (przy niedoborze określonych składników w

otoczeniu komórka może zechcieć poszukać w okolicy genu, który
pomoże jej zmienić dietę i dostosować się do panujących
warunków);

– gęstość populacji bakteryjnej (bakterie najwidoczniej urządzają

coś w rodzaju konwentów – przy dużej ich ilości w danym miejscu
chętnie wymieniają się informacjami);

– wzrost stężenia kationów wapnia (u Escherichia coli dodatek soli

wapnia do otoczenia zwiększa przepuszczalność ściany
komórkowej dla egzogennego DNA, co w konsekwencji umożliwia
wnikanie tych cząstek do komórki);

• elektroporacja w polu elektrycznym - ok. 16kV/cm przez ułamek sekundy; taki

proceder czyni niewielkie dziury w ścianie komórkowej bakterii, w sam raz dla
obcego DNA.

• W otoczeniu musi znajdować się obce DNA, o odpowiednim rozmiarze i w

odpowiednim stężeniu oraz postaci.

– Badania pokazują, iż DNA używane do transformacji ma długość ok. 1/200

długości chromosomu, czyli 3x10

5

-10

7

daltonów. Transformujące fragmenty

są niewielkie, wobec czego większość znaczników jest niesprzężona.

– Ilość powstających transformantów zależy od stężenia DNA w podłożu w

sposób liniowy, jednakże do pewnego momentu. Ponieważ wejście DNA do
komórki zachodzi najprawdopodobniej jedynie w odpowiednich miejscach
(pod warunkiem, iż nie podziurawiliśmy sztucznie ściany komórkowej – w tej
chwili pierwsze skrzypce grają receptory i białkowe czynniki kompetencji),
dana komórka pobiera określoną ilość cząstek DNA i ani jednej więcej. Jeżeli
zatem wysycimy ilość miejsc wchłaniania DNA, dalszy wzrost stężenia DNA w
podłożu nie zwiększy ilości powstających transformantów.

– DNA, które ma zostać pobrane w celach transformacji, powinno być

dwuniciowe i przyjmować formę natywną. DNA jednoniciowe bądź
denaturowane wykazuje niezwykle niską aktywność transformującą, co ma
związek z mechanizmem transformacji (crossing-over).

Transformacja zajdzie z dużą

wydajnością, jeżeli wchłaniana
informacja genetyczna pochodzi z
tego samego gatunku, co szczep
transformowany, bądź od jakiegoś
bliskiego kuzyna (w końcu to
rodzina). Transformacja DNA
pochodzącym z innego gatunku
zachodzi z dużo niższą wydajnością.

Rola pLysS w systemie T-S.

• Plazmid pLysS jest elementem uszczelniającym

represję genu T7. (Represja - wyłączanie ekspresji
genu lub grupy genów w odpowiedzi na bodziec
chemiczny lub o innym pochodzeniu.). Na tym
plazmidzie kodowany jest lizozym faga T7, który
wiąże się do polimerazy RNA faga T7 i inaktywuje
ją (uszczelnia układ – nie dochodzi do produkcji
docelowego białka na plazmidzie pET).

• Jest to potrzebne, ponieważ pojedyncze cząsteczki

polimerazy RNA faga T7 mogą powstawać przed
indukcją komórek E.coli IPTG, ale dzięki lizozymowi
te cząsteczki polimerazy są inaktywowane.

Do IPTG

Ekspresja genu lizozymu zachodzi w

komórce na stałym, niskim poziomie,
więc nie ma wpływu na poziom
ekspresji genu docelowego po
indukcji systemu przez IPTG, bo
wtedy powstaje bardzo dużo
polimerazy fagowej.

Etapy PCR

1.Denaturacji wstępnej matrycy DNA
2.Denaturacji matrycy DNA
3.Przyłączania starterów do miejsca komplementarnego na

matrycy

4.Wydłużanie primera od końca 3’OH
5.Wydłużanie końcowe.

- Jeden cykl reakcji PCR obejmuje etapy: denaturacji, przyłączania

starterów oraz ich wydłużania przez polimerazę DNA.

- Pierwszy etap obejmuje denaturację termiczną dwuniciowej

matrycy DNA do jednoniciowych łańcuchów. Zarówno czas i
długość trwania tego etapu zależne są od zawartości par GC w
matrycy wyjściowej. Im większy %GC tym wyższa temperatura i
dłuższy czas jednakże średnio stosuje się 92-96

O

C 3-5minut.

- Przyłączanie starterów (anneling) to kluczowy etap reakcji

PCR, gdyż tylko prawidłowe podłączenie starterów dobrze
zaprojektowanych gwarantuje nam uzyskanie prawidłowego
produktu. Wśród wielu czynników wpływających na ten
proces najważniejszymi są temperatura, czas oraz stężenie
matrycy i primera. W optymalnych warunkach, w
początkowych cyklach stężenia matrycy podwaja się z
każdym cyklem i w ten względne stężenie primerów
zmniejsza się znacząco. Tak więc prawdopodobieństwo
efektywnego przyłączania primerów w pierwszych cyklach
jest determinowane głównie ilością kopii matrycy oraz
czasem potrzebnym na efektywne przeszukiwanie genomu
przez primer w celu odnalezienia sekwencji
komplementarnej. W zbyt wysokiej temperaturze
niemożliwe jest przyłączenie starterów, zaś w zbyt niskiej
przyłączać się one mogą niekomplementarnie. Anneling
zachodzić może w temperaturach 37-72

O

C 20-40s.

- Wydłużanie primerów poprzez efektywne

dosyntetyzowywanie do końca 3’OH dNTP w
temperaturze 72

O

C (dla polimerazy Taq) przez 20s dla

fragmentów krótszych niż 500bp i 40s dla fragmentów o
długości 1,2kb. Reakcję tę przeprowadza termostabilna
polimeraza DNA. Gdy spodziewane jest występowanie
drugorzędowej struktury amplifikowanych produktów ,
wymagany jest dłuższy czas elongacji.

- W analitycznej reakcji PCR liczba cykli nie większa niż 40

(optymalnie 25-30).

- Zwykle po ostatnim cyklu przeprowadza się przez 5-15

min inkubacje w 72OC w celu dokończenia
niekompletnych syntez i pełnej hybrydyzacji
jednoniciowych komplementarnych produktów.

• Wektory z serii pET (ang. plasmid for

Expression by T7 RNA polymerase). Mają
wklonowany promotor faga T7. Gen docelowy
wklonowany pod kontrolą tego promotora jest
eksprymowany w momencie pojawienia się w
komórce polimerazy fagaT7 , której gen
znajduje się na chromosomie gospodarza i jest
pod kontrolą promotora lac ( ekspresja pod
kontrolą tego promotora zachodzi po dodaniu
IPTG); oznacza to, że ekspresja wklonowanego
do tego wektora genu w ściśle określonym
czasie

Właściwości wektorów w systemieT-S

• Wektor pLysS lub pLysE wprowadza się w

celu usunięcia pojedynczych cząsteczek
polimerazy RNA T7, pojawiających się przed
indukcją ekspresji. Wektory te posiadają
wklonowany gen, kodujący lizozym fagaT7,
którego produkt bierze udział w degradacji
cząsteczek polimerazy. Ekspresja lizozymu,
która odbywa się na stałym poziomie, nie
wpływa jednak na ekspresję genu
docelowego, po indukcji systemu IPTG,
ponieważ jego ekspresja ( lizozymu) zachodzi
na niskim poziomie, a polimeraza fagowa jest
po indukcji produkowana w dużych ilościach.

Lizozym T7 posiada ponadto zdolność hydrolizowania

wiązań β-1,4-glikozydowych w peptydoglikanie
ściany komórkowej bakterii, co ułatwia późniejszą
lizę komórek i uwolnienie z nich żądanego produktu
białkowego. Ponieważ cząsteczki lizozymu znajdują
się wewnątrz komórek gospodarza i nie mogą
przedostać się przez błonę komórkową do warstwy
peptydoglikanu, liza komórek bakteryjnych
zachodzi dopiero po naruszeniu struktury błony w
początkowych etapach zabiegów prowadzących do
izolacji białek

Transformacja

• Transformacja proces, w którym informacja genetyczna jest

przekazywana do biorcy bez kontaktu komórek lub
pośrednictwa faga. DNA wyizolowany z komórek dawcy jest
aktywnie pobierany przez komórki biorcy. Wysoką
aktywność transformującą wykazuje DNA natywny,
dwuniciowy. Jednoniciowy lub denaturowany DNA jest mało
aktywny w transformacji. Wymiana odcinków DNA i
replikacja prowadzi do powstania komórek transformantów
o nowych właściwościach. Wydajność transformacji zależy
od stężenia DNA i od kompetencji komórek biorcy. Stan
kompetencji polega najprawdopodobniej na wytwarzaniu
białkowego czynnika kompetencji. Ilość tego białka zmienia
się w czasie wzrostu hodowli bakteryjnej.

Dla uzyskania komórek kompetentnych

E. coli stosuje się CaCl

2

, zwiększający

przepuszczalność ściany komórkowej
dla egzogennego DNA.
Wykorzystując tę metodę
uzyskiwania komórek kompetentnych
opracowano warunki dla
transformacji komórek E. coli.

Zmniejszenie amplifikacji

PCR

Sztuczny chromosom bakteryjny

(BAC)

•  jest zrekombinowanym DNA bazującym na

DNA plazmidowym bakterii pałeczki
okrężnicy (Escherichia coli), używanym
w inżynierii genetycznej,
jako wektor do klonowania DNA. Wykazuje
zdolność do przyjęcia fragmentów DNA do
klonowania (np. cDNA), (określanego także
mianem insertu) długości 100-350 kpz, czyli
znacznie mniej niż sztuczny chromosom
drożdżowy (YAC). Niemniej jednak BAC wykazuje
większą stabilność insertu oraz łatwość operacji
namnażania i izolacji klonu.

Sztuczny chromosom drożdżowy (YAC)

•  jest zrekombinowanym chromosomem drożdży Saccharomyces

cerevisiae używanym w inżynierii genetycznej,
jako wektor do klonowania DNA. W skład wektora wchodzi sekwencja
inicjacji replikacji (drożdżową- ars, bakteryją - ori),
sekwencje telomerowe, centromer oraz na ogół markery. Replikuje w
komórkach drożdży.

• Zaletą wektora YAC jest zdolność do przyjęcia (insertu) bardzo

dużych fragmentów DNA do klonowania (np. cDNA), nawet rzędu
3000 kpz, co, w przeciwieństwie do użytkowania jako wektorów
np. plazmidów, czy wektorów fagowych, umożliwia klonowanie całych
ludzkich genów.

Zastosowania YACs
- Badanie zachowania się chromosomów, głównie podczas mejozy
-Dobre (ale mniej stabilne od BAC) wektory dla dużych sekwencji DNA
- Badanie ekspresji genów (tego typu wektory mogą funkcjonować

w komórkach ssaków)

Metody klonowania do wektorów

plazmidowych

• Klonowanie może być:
• - kierunkowe,
• - niekierunkowe
•  
• kierunek wklonowania insertu zależy od użytych do klonowania lepkich lub tępych końców
• kierunkowe - przez uzycie koncow lepkich, ale 2 roznych
• niekierunkowe - przez uzycie koncow tepych lub tych samych lepkich
•  
• Końce fragmentów obcego DNA
• Wymagania w klonowaniu
Tępe:
Wymagania w klonowaniu: duże stężenie DNA i ligazy
Uwagi:
-Tło klonów nierekombinantowych może być wysokie
-Miejsca restrykcyjne przy połączeniach plazmidu i obcego DNA mogą być eliminowane
-Plazmidy rekombinantów mogą zawierać tandemowe kopie obcego DNA
-Niska wydajność
-Gen może się wklonować w dwóch orientacjach
-Może dojść do odwrotnego wklonowania insertu
-Może dojść do sytuacji gdzie połączą się ze sobą plazmidy jak i inserty

Lepkie”( kohezyjne ) różne, uzyskiwane przy

pomocy różnych enzymów restrykcyjnych

Wymagania w klonowaniu:
-Otrzymywanie maksymalnej wydajności ligacji

wymaga oczyszczenia wektora plazmidowego
po cieciu dwoma enzymami restrykcyjnymi

Uwagi:
-Miejsca restrykcyjne przy połączeniach midędzy

plazmidem a obcym DNA są zwykle zachowane

-Tło klonów nierekombinantowych jest niskie
-Obce DNA jest klonowane tylko w jednej

orientacji w plazmidzie rekombinanta

Lepkie ( kohezyjne ) identyczne, uzyskiwane

przy pomocy tych samych enzymów
restrykcyjnych

Wymagania w klonowaniu:
-Liniowe DNA plazmidu wektora należy traktować

fosfatazą

Uwagi:
-Miejsca restrykcyjne przy połączeniach miedzy

plazmidem a obcym DNA są zwykle zachowane

-Obcy DNA może być wklonowany w każdej

orientacji

-Plazmidy rekombinantów mogą zawierać

tandemowe kopie obcego DNA

Zalety i wady klonowania „na lepko” jednym

enzymem

Zalety:
• Umożliwia to klonowanie niekierunkowe (nieokreślona

orientacja insertu). Znajduje to zastosowanie w
wektorach służących do namnażania insertu (pUC,
pBR 322). Zwiększa się pula wklonowanych insertów.

• Obniżenie kosztów – stosowany jest tylko jeden

enzym restrykcyjny.

Wady:
• Nie kierunkowe klonowanie w wektorach

ekspresyjnych. Nie nastąpi ekspresja z insertu
wklejonego w odwrotnej orientacji.

 

Zalety i wady klonowania „na lepko” dwoma różnymi enzymami.

 

Zalety:
-miejsca restrykcji przy połączeniu zostają zwykle zachowane
-tło klonów-nierekombinantów jest niskie,
-obce DNA jest klonowane tylko w jednej orientacji w plazmidzie
rekombinanta.
-wydajność klonowania na lepko jest większa niż na tępo
 
Wady:
-otrzymanie maksymalnej wydajności ligacji wymaga oczyszczenia
wektora plazmidowego po cięciu dwoma enzymami restrykcyjnymi.
- konieczność prowadzenia trawienia sekwencyjnego
(dwuetapowego) w przypadku stosowania enzymów wymagających
różnych buforów reakcyjnych, trzeba przeprowadzić oczyszczanie
po pierwszym etapie trawienia
- nie można klonować w ten sposób (na lepko) produktów PCR

ZALETY I WADY KLONOWANIA „NA TĘPO”

Zalety
- W reakcji stosuje się tylko jeden enzym restrykcyjny
- Możliwość wstawienia obcego DNA w dowolnej orientacji
- Występuje mniejsze ryzyko degradowania końców przez nukleazy
- Używa się ich przy powielaniu wektorów

Wady
- duże stężenie DNA i ligazy
- Wysokie tło klonów nierekombinantowych
- Występuje eliminowanie miejsc restrykcyjnych przy połączeniach plazmidu i obcego DNA
- Reakcje ligacji przebiegają ze znacznie niższą wydajnością
- plazmidy rekombinantów mogą – rzadko, ale mogą – zawierać tandemowe kopie obcego

DNA.

 

Wynika z tego szereg zalet:
- możemy uzyskać duże ilości identycznego DNA o tępych końcach bez

konieczności zabawy z enzymami restrykcyjnymi, oczyszczania tego DNA i
całego procesu związanego z hodowlą bakterii, z której będziemy izolować
gen w celach wklonowania do plazmidu – duża oszczędność czasu;

- przy zastosowaniu metody „sztucznych lepkich końców” znacznie

podnosimy wydajność reakcji ligacji, eliminujemy ryzyko powstania klonów-
nierekombinantów oraz wielokrotnego wklejenia genu do plazmidu
praktycznie do zera – amplifikowane fragmenty nie mogą się ze sobą
łączyć, a przecięte na tępo plazmidy (po dosyntetyzowaniu lepkiego
fragmentu od strony 3’) nie potrafią się zamknąć bez włączenia obcego
DNA o kompatybilnych końcach;

- w takiej sytuacji, z uwagi na obecność lepkich końców, nie musimy już

koniecznie korzystać z ligazy faga T4, a przynajmniej możemy obniżyć jej
stężenie.

 
Wadą tego typu postępowania jest konieczność dosyntetyzowania owych

sztucznych lepkich końców (przy użyciu terminalnej transferazy
nukleotydowej), a następnie ich odpowiednie wymodelowanie
odpowiednimi enzymami, przed i po ligacji (egzonukleazą III i polimerazą I).

Wymień parametry od których zależy szybkość

migracji DNA w żelu agarozowym.

Masy cząsteczkowej DNA – cząsteczki linowe migrują w żelu z szybkością odwrotnie

proporcjonalną do log

10

z ich masy cząsteczkowej.

Stężenia agarozy – dany fragment DNA o określonej wielkości migruje z różną szybkością w

żelu zawierającym różne stężenia agarozy. Im większe stężenie agarozy tym mniejsze
powstają pory w żelu; taki żel nadaje się do rozdziału małych fragmentów DNA.

Im gęstszy żel tym wolniejsza migracja,ale należy pamiętać, że większe 

cząsteczki lepiej jest rozdzielać w rzadszym żelu, mniejsze w gęstszym; standardowo stosuje
 się żele 1%.

Konformacji DNA – plazmidowe DNA może występować w kilku formach: superzwiniętej

(CCC); naciętej kolistej (OC); i liniowej (L). Kolejność migracji tych form w żelu:

Natężenie pola elektrycznego – przy niskim natężeniu pola migracja fragmentów liniowych

jest proporcjonalna do przyłożonego napięcia. (Maksymalny rozdział fragmentów DNA
uzyskuje się przy natężeniu pola 5V/cm.)

Składu i siły jonowej buforu do elektroforezy – w roztworach o niskiej sile jonowej DNA

migruje wolno. W roztworach o wysokiej sile jonowej może dojść do wydzielenia ciepła,
upłynniania żelu i denaturacji DNA.

Ponad to szybkość migracji zależy od wielkości, kształtu i ładunku rozdzielanych cząsteczek.

Opisać i zdefiniować rolę ligacji w

uzyskiwaniu rekombinantów

• Ligacja to proces łączenia fragmentów Dan in vitro. We

wszystkich technikach łączenia bierze udział enzym – ligaza
DNA. Katalizuje ona tworzenie wiązań fosfodwuestrowych
pomiędzy nukleotydami w łańcuchu DNA. W technice
rekombinowanie i klonowania DNA stosuje się ligazę uzyskiwaną
z komórek E.coli zakażonych fagiem T4. Jest ona zależna od ATP
i nie jest w stanie połączyć fragmentów DNA nie mających
wolnych, jednoniciowych zakończeń.

• Wyróżniamy następujące typy ligacji, gdzie:
-końce fragmentów obcego DNA są tępe
-końce fragmentów obcego DNA są lepkie różne, uzyskiwane przy

pomocy różnych enzymów restrykcyjnych

-końce fragmentów obcego DNA są lepkie identyczne, uzyskiwane

przy pomocy tych samych enzymów restrykcyjnych

Najpowszechniej stosowaną techniką łączenia obcego

DNA z DNA wektora polega na przecięciu wektora
tym samym enzymem restrykcyjnym, jaki użyty był
pofragmentowania obcego DNA, a następnie
potraktowaniu ligazą mieszaniny fragmentów DNA i
liniowych cząsteczek wektora. Zachodzi wówczas
nie tylko łączenie fragmentów obcego DNA z DNA
wektora, ale również łączenie się ze sobą
fragmentów DNA i łączenie lepkich końców wektora,
co prowadzi do zamknięcia wektora bez integracji
fragmentu obcego DNA. Można jednak temu
zapobiec stosując alkaliczną fosfatazę. Fosfataza
usuwa grupę fosforanową z końca 5’ łańcucha DNA,
uniemożliwiając zamknięcie się wektora.

Kryteria doboru enzymów

- enzymy należące do grupy "regularnych 6-

tek", np.: EcoRI, BamHI, BgIII...
- enzymy należące do
grupy rozpoznających kilka specyficzności,
np.: HincII-GT[PyPu]AC, AccI, AvaII, AfIII
- enzymy należące do
grupy rozpoznających nieciągłe sekwencje
palindromowe, np.: BgII, BstXI
- enzymy rozpoznające specyficzną
sekwencję, lecz przecinające DNA poza
nią ("shiftery", klasa IIs), np.: FokI, MboII