ANALIZA WIDM

Podstawowe definicje

Atomowa jednostka masy
(ang. atomic mass unit) [amu] lub

[u]

jednostka masy zdefiniowana jako

1/12 masy izotopu węgla

12

C. Nie

należy do układu jednostek SI.

1 u ≈ 1,6605402·10

-27

kg

Dalton [Da]

liczbowo jednostka równa
atomowej jednostce masy [amu].
Ze względów praktycznych
powszechnie używana w biochemii
białek i peptydów (pochodne: kDa,
MDa)

Podstawowe definicje

Podstawowe definicje

Thomson [Th]

Jednostka równa stosunkowi masy
do ładunku piku obserwowanego
na widmie masowym.

1 Th = 1 m/z (=1 u/e, =1 Da/e)

(e,z = ładunek jonu)

Podstawowe definicje

Wielokrotność ładunku

(tripeptyd Ser-Asn-Gln)

ładunek +1 [+1
H

+

]

ładunek +2 [+2
H

+

]

ładunek +3 [+3
H

+

]

Podstawowe definicje

1123,4 m/z
1123,4 Th
2244,8 amu
2244,8 Da
~2,25 kDa

1123,4

2+

(jonizacja

dodatnia)

Widmo
ESI

m/z

Podstawowe definicje

Jony i piki:
- jon molekularny i

pseudomolekularny

- (jon macierzysty i potomny)

- pik izotopowy
- pik podstawowy

Rozdzielczo

ść

Wartość bezwymiarowa obliczana jako

stosunek wartości m/z piku do jego

szerokości w połowie wysokości

(FWHM, full width at half maximum)

R = m/FWHM

Rozdzielczo

ść

Widmo masowe
wykonane w
niskiej
rozdzielczości,
szerokość
połówkowa
(FWHM) piku ~10
Da

R = m/FWHM ≈
85

Rozdzielczo

ść

Widmo masowe
wykonane w
„wysokiej”
rozdzielczości,

R = m/FWHM =

= 1619,8/0,1 ≈

16200

Rozdzielczo

ść

Wysokorozdzielcze widmo MS,

R = m/FWHM = 183.085/0,001 ≈

183000

Widma masowe

różne techniki jonizacji

różne widma masowe

różne INFORMACJE

Widma masowe typu EI

Podstawowe cechy:
- zakres analizy do około 1000 Da
- łatwość połączenia z GC
- spontaniczna fragmentacja analitu
- znane mechanizmy fragmentacji
- bardzo wysoka powtarzalność pomiaru
- biblioteki widm

Widma masowe typu EI

1. jon molekularny m/z=86 (nie
pseudomolekularny!!!)
2. spontaniczna fragmentacja analitu

Widma masowe typu EI

1. jon molekularny m/z=86 (nie
pseudomolekularny!!!)
2. spontaniczna fragmentacja analitu

heksan,
C

6

H

14

MW = 86,2

Widma masowe typu EI

1. jon molekularny m/z=86 (nie
pseudomolekularny!!!)
2. spontaniczna fragmentacja analitu

Widma masowe typu EI

pierwiastki charakterystyczne

Widma masowe typu EI

pierwiastki charakterystyczne

Widma masowe typu EI

pierwiastki charakterystyczne

Widma masowe typu EI

pierwiastki charakterystyczne

- W widmie cząsteczek zawierających jod

charakterystyczna obecność jonu I+ przy m/z
127

- Jeżeli w cząsteczce znajduje się atom N, lub

nieparzysta ich ilość to wartość m/z jonu
molekularnego jest nieparzysta (dla związków
zbudowanych tylko z C, O i H m/z jonów
molekularnych są parzyste)

Widma masowe typu CI

Podstawowe cechy:

- zakres analizy do około 1000 (max. 2000-3000) Da

- na widmie jony pseudomolekularne

- nikła fragmentacja analitu
- łatwość połączenia z GC
- to samo źródło jonów dla EI i CI

Widma masowe typu CI

Widma EI i CI
alkoholu-3-
nitrobenzyloweg
o

Widma masowe typu CI

Widma EI i CI
alkoholu-3-
nitrobenzyloweg
o

- jon molekularny
- intensywna
fragmentacja

Widma masowe typu CI

Widma EI i CI
alkoholu-3-
nitrobenzyloweg
o

- jon
pseudomolekularny
- nikła fragmentacja

- jon molekularny
- intensywna
fragmentacja

Widma masowe typu ICP

Podstawowe cechy:

- całkowity rozpad wiązań kowalencyjnych
- dokładna informacja o składzie pierwiastkowym

próbki

- ograniczony zakres m/z

Widma masowe typu ICP

Technika używana powszechnie w ochronie
środowiska, badaniu składu stopów metali oraz
ceramiki, badaniach archeologicznych itp.

Widma masowe typu ESI

Podstawowe cechy:

- praktyczny zakres analizy do (~) 100 kDa
- łagodna technika jonizacji
- jonizacja pod ciśnieniem atmosferycznym
- technika do analizy roztworów (!!!)
- łatwość połączenia z HPLC
- wielokrotna jonizacja cząsteczek o wyższych

masach

Widma masowe typu ESI

Widma masowe typu ESI

wielokrotność jonizacji (piki izotopowe)

Widma masowe typu ESI

wielokrotność jonizacji (piki izotopowe)

Widma masowe typu ESI

wielokrotność jonizacji (piki izotopowe)

Widma masowe typu ESI

wielokrotność jonizacji (piki izotopowe)

?

Widma masowe typu ESI

wielokrotność jonizacji (piki izotopowe)

(537,9*4) – 4
=
= 2147,6
(717,0*3) – 3
=
= 2148,0
(1074,8*2) – 2
=
= 2147,6

MW =
2147,7

Widma masowe typu ESI

wielokrotność jonizacji

brak
widocznego
rozkładu
izotopowego
dla
obserwowany
ch pików…

?

Widma masowe typu ESI

wielokrotność jonizacji (dekonwolucja)

Możliwe jest określenie ładunku pików z
wykorzystaniem prostego równania, zakładającego
występowanie korelacji pomiędzy „sąsiadującymi”
pikami.

n

- ilość protonów przypadających na pik m

n

m

n

- m/z piku o ładunku n

m

n+1

- m/z piku o ładunku n+1

1,008- masa protonu

1

1

008

,

1











n

n

n

m

m

m

n

Widma masowe typu ESI

wielokrotność jonizacji (dekonwolucja)

8

2

,

1374

8

,

1545

008

,

1

2

,

1374

8

,

1545

2

,

1374

008

,

1

1

1

1

























n

m

m

m

m

m

n

n

n

n

n

n

Widma masowe typu ESI

wielokrotność jonizacji (dekonwolucja)

jon o m/z=1545,8 posiada ładunek
równy 8

8

2

,

1374

8

,

1545

008

,

1

2

,

1374

8

,

1545

2

,

1374

008

,

1

1

1

1

























n

m

m

m

m

m

n

n

n

n

n

n

1545.8

8+

Widma masowe typu ESI

wielokrotność jonizacji (dekonwolucja)

1545,8

8+

Widma masowe typu ESI

wielokrotność jonizacji (dekonwolucja)

1545,8

8+

1766,4

7+

Widma masowe typu ESI

wielokrotność jonizacji (dekonwolucja)

1545,8

8+

1766,4

7+

1374,2

9+

Widma masowe typu ESI

wielokrotność jonizacji (dekonwolucja)

1374,2

9+

1545,8

8+

1766,4

7+

1236,9

10+

1124,6

11+

1131

12

+

951,9

1

3+

883,9

1

4+

Widma masowe typu ESI

Po otrzymaniu informacji o ładunku jonów

możliwe jest obliczenie masy rzeczywistej

analitu.

Masę rzeczywistą analizowanej substancji

obliczamy na podstawie równania:

MW [Da] = m

n

· n – n

Widma masowe typu ESI

wielokrotność jonizacji (dekonwolucja)

m/z

z

masa obliczona

odchylenie

825,2

15

12 363,0

+ 3,1

883,9

14

12 360,6

+ 0,7

951,9

13

12 361,7

+ 1,8

1031,0 12

12 360,0

+ 0,1

1124,6 11

12 359,6

- 0,3

1236,9 10

12 359,0

- 0,9

1374,2 9

12 358,8

- 1,1

1545,8 8

12 358,4

- 1,5

1766,4 7

12 357,8

- 2,1

wartość średnia:

12 359,9 Da, SD =

1,66 Da

Widma masowe typu ESI

dekonwolucja automatyczna

Widma masowe typu ESI

analiza mieszanin

widmo białka strawionego trypsyną

Widma masowe typu ESI

polimery

Widma masowe typu ESI

inne zjawiska - ADDUKTY

Widma masowe typu ESI

inne zjawiska - ADDUKTY

Widma masowe typu ESI

Czy ADDUKTY (Na, K) mogą być przydatne?

Widma masowe typu ESI

inne zjawiska – SUPRESJA JONÓW

peptyd w roztworze PBS

Widma masowe typu ESI

inne zjawiska – SUPRESJA JONÓW

peptyd po odsoleniu

Podstawowe cechy:

- zakres analizy > 700 Da
- łagodna technika jonizacji
- analiza cząsteczek głównie o wysokich masach
- najczęściej jednokrotna jonizacja
- łatwa analiza mieszanin
- konieczność stosowania matrycy

Widma masowe typu MALDI

Widma masowe typu MALDI

widmo matrycy

Ze względu na widmo matrycy, przeważnie nie

wykonuje się analiz substancji o masach poniżej 1000

Da techniką MALDI.

>1000
Da

Widma masowe typu MALDI

typowe widmo MALDI

MW = 1618,2
R ≈ 15000

Widma masowe typu MALDI

typowe widmo MALDI

Mieszanin

a czy

czysta

substancj

a?

dekonwoluc
ja

Widma masowe typu MALDI

typowe widmo MALDI

MW=14293

Da

lizozym

(masa

rzeczywista

14303 Da)

Widma masowe typu MALDI

typowe widmo MALDI, problem

rozdzielczości

R =

m/FWHM

Widma masowe typu MALDI

typowe widmo MALDI, problem

rozdzielczości

m/z=66948

FWHM=200

0

R=33,5

(!!!)

Widma masowe typu MALDI

analiza mieszanin

Widma masowe typu MALDI

polimery

ESI/MALDI, porównanie

substancje wysokocząsteczkowe

- utrudniona interpretacja
- „wysoka” rozdzielczość
- niski zakres m/z
(analizator)

- łatwa interpretacja
- niższa rozdzielczość
- wysoki zakres m/z
(analizator)

ESI/MALDI, porównanie

mieszaniny

- utrudniona interpretacja
- komplikacje związane z
wielokrotną jonizacją

- bardzo łatwa
interpretacja
- jednokrotna jonizacja

Widma masowe typu DIOS

DIOS – brak
konwencjonalnej matrycy
możliwość analizy niskich
m/z

MALDI – widoczne piki
matrycy

porównanie MALDI / DIOS

Widma masowe typu MS/MS

Tandemowa spektrometria mas:

Technika fragmentacji określonych

jonów pozwalająca na uzyskanie

informacji

o strukturze badanych cząsteczek

Widma masowe typu MS/MS

Tandemowa spektrometria mas:

Technika fragmentacji określonych
jonów pozwalająca na uzyskanie
informacji
o strukturze badanych cząsteczek

Pozwala (w przypadku białek), na jednoznaczną

identyfikację w bazach danych, określenie

modyfikacji potranslacyjnych,

lokalizację

miejsca i rodzaju mutacji.

Widma masowe typu MS/MS

Widma masowe typu MS/MS

Widma masowe typu MS/MS

Żródło
jonów

Soczewki

Detektor 2

Detektor 1

Analizator 1

Analizator 2

Komora
kolizyjna

Widma masowe typu MS/MS

Widma masowe typu MS/MS

434.3

1+

Widmo
MS

Widma masowe typu MS/MS

434.3

1+

Izolacja

Widma masowe typu MS/MS

434.3

1

+

Fragmenta
cja
(MS/MS)

Widma masowe typu MS/MS

sekwencjonowanie
peptydów