Sprawozdanie

Jakub Knurek

środa, 8:00 (gr. I)

Temat: Kwasy karboksylowe. Chromatografia cienkowarstwowa aminokwasów

1. Kwasy karboksylowe

Kwasy karboksylowe to związki organiczne zawierające w cząsteczce co najmniej jedną grupę karboksylową. Nie jest to jednakże jedyna grupa, mogąca występować w cząsteczce (możemy zaobserwować np. grupy aminowe lub hydroksylowe). Kwasom karboksylowym nasyconym można także przypisać wzór ogólny, który wygląda następująco: CnH2n+1-COOH. Dzięki tej właściwości możliwe jest uporządkowanie kwasów karboksylowych w szereg homologiczny.

Nazwy systematyczne kwasów karboksylowych tworzone są analogicznie do nazw alkanów o tej samej liczbie atomów węgla w cząsteczce (dla przykładu najprostrzy kwas mrówkowy o wzorze HCOOH, zgodnie z nazewnictwem YUPAC posiada nazwę kwasu metanowego). Końcówka „-owy” jest więc jedyną zmianą względem alkanów. To jednak nie wszystko. Sprawa nazewnictwa komplikuje się wraz ze wzrostem komplikacji wiązań w cząsteczce kwasu. Gdy mamy do czynienia z podstawnikiem pierścieniowym, dodajemy do nazwy przyrostek -karboksylowy. Najczęściej jednak stosowane są nazwy zwyczajowe (jak wspomniany już przeze mnie kwas mrówkowy), które wywodzą się zwykle od miejsca wyestrahowania danego kwasu. Mamy więc kwasy octowy, masłowy, szczawiowy walerianowy, palmitynowy itd., itp. Co jednak, gdy w cząsteczce kwasu znajdują się nie jedna, a dwie grupy karboksylowe? W takim układzie mamy do czynienia z kwasem dikarboksylowym (adekwatnie, przy trzech grupach karboksylowych, będzie kwas tri-, a przy czterech, tetrakarboksylowy), co oznacza, że za końcówkę nazwy tego typu kwasu przyjmuje się końcówkę „-diowy”, a nie „-owy”. Sztandarowym przykładem kwasu dikarboksylowego jest wyżej wspomniany z nazwy kwas szczawiowy, który właściwie określa się jako kwas etanodiowy.

Kwasy karboksylowe są mało lotne. Wraz ze wzrostem wielkości cząsteczki wzrastają temperatury topnienia i wrzenia kwasów karboksylowych. Wszystkie kwasy łatwo krystalizują. Kwasy zawierające od 1 do 4 atomów węgla w czasteczce mieszają się z wodą w każdym stosunku,a zawierające do 12 atomów węgla w czasteczce, rozpuszczają się dobrze w alkoholu. Niższe kwasy karboksylowe są cieczami o ostrym zapachu, kwasy o średniej wielkości są oleistymi cieczami o przykrej woni, a kwasy długołańcuchowe ciałami stałymi lub cieczami w zależności od stopnia nienasycenia.

Ze względu na obecność grupy karboksylowej reakcje chemiczne kwasów karboksylowych można podzielić na: reakcje związane z odłączeniem wodoru od grupy hydroksylowej (wskutek czego powstają sole), substytucją nukleofilową grupy hydroksylowej (powstaje acyl, którego formą przejściową jest karbokation, a końcową jedna z ważniejszych pochodnych kwasów karboksylowych: ester, amid, bezwonik kwasowy lub halogenek kwasowy), redukcją grupy karboksylowej (pod wpływem silnych reduktorów jak np. glinowodorek litu, do grupy >CH2), dekarboksylacją (w której wydziela się dwutlenek węgla) oraz reakcjami poza grupą karboksylową.

a. Otrzymywanie kwasów karboksylowych

Istnieją przeróżne sposoby, które pozwalają na uzyskanie kwasów karboksylowych. Można do nich zaliczyć m.in. utlenianie alkenów, alkoholi pierwszorzędowych, aldehydów, reakcję związków metaloorganicznych z dwutlenkiem węgla, czy też hydrolizę nitryli. W warunkach labolatoryjnych wykorzystuje się możliwość utlenienia aldehydów, mających odpowiednią ilość wędlin w cząsteczce. Najczęściej jednak kwasy alifatyczne o prostych i krótkich łańcuchach otrzymuje się z tłuszczy roślinnych i zwierzęcych.

Wykonanie: Do 2 ml formaliny dodałem 3 ml NaOH. Po zamieszaniu roztworu zmierzyłem pH papierkiem wskaźnikowym (pH = 10,5). Następnie dodawałem kroplami nasycony roztwór KMnO4.

Obserwacje: W roztworze pojawiło się zmętnienie koloru brązowo-fioletowego. Po odstawieniu probówki i odczekaniu kilkunastu minut powstały osad opadł na dno, a powyżej zauważalny był klarowny, przeźroczysty roztwór.

Wniosek: Wytrącenie osadu, świadczy o powstaniu kwasu mrówkowego w roztworze.

Reakcja:

2 HCOH -O2→ 2 HCOOH

[aldehyd mrówkowy -O2→ kwas mrówkowy]

b. Badanie właściwości kwasowych

Wykonanie: Na oczka płytki porcelanowej nalałem po 0,5 ml kwasów: octowego, trichlorooctowego, winowego i olejowego. Następnie zbadałem podane roztwory papierkiem wskaźnikowym Kongo.

Obserwacje: Papierek wskaźnikowy Kongo zmienił kolor na niebieski w oczkach z kwasem trichlorooctowym i kwasem winowym. W dwóch pozostałych oczkach papierek nadal był czerwony.

Wniosek: Kwasy trichlorooctowy i winowy mają większą moc, niż kwasy olejowy i octowy.

Wzory: (uszeregowane wdg malejącej mocy):

Kwas trichlorooctowy (kwas 2,2,2-trichlorooctowy ) >

kwas winowy (kwas 2,3-dihydroksybutanodiowy) >

kwas octowy (kwas etanowy) >

kwas olejowy (kwas Z-oktadek-9-enowy)

> > >

c. Reakcja kwasów karboksylowych i ich pochodnych z chlorkiem żelaza (III)

Wykonanie: Przygotowałem trzy probówki. Do każdej z nich odmierzyłem po 10 mg substancji; do pierwszej – kwasu gallusowego, do drugiej – kwasu cytrynowego, zaś do trzeciej – kwasu octowego. Dodałem do każdej probówki po 5 ml wody amoniakalnej. Następnie roztwory ogrzewałem nad płomieniem palnika do wrzenia. Po stwierdzeniu braku nadmiaru amoniaku (sprawdzenie papierkiem lakmusowym) i ostudzeniu dodawałem po kropli roztworu FeCl3.

Obserwacje: W probówce z kwasem gallusowym roztwór zmienił kolor na fioletowoniebieski. W probówce z kwasem cytrynowym po dodaniu FeCl3 roztwór stał się żółty, zaś w probówce z kwasem octowym – pomarańczowo-czerwony.

Wniosek: Kolory wskazują na powstanie odpowiednich związków kompleksowych, zaś na ich podstawie możemy określić z jakiego typem kwasu mamy do czynienia. I tak, kwas gallusowy jest fenolokwasem. Kwas cytrynowy jest hydroksykwasem. A kwas octowy należy do grupy kwasów alifatycznych.

Wzory:

kwas gallusowy kwas cytrynowy kwas octowy

d. Wykrywanie kwasów dikarboksylowych (reakcja z rezorcyną)

Wykonanie: W probówce zmieszałem 2 mg bezwodnika bursztynowego z 2 mg rezorcyny. Równolegle, do drugiej probówki wsypałem 5 mg rezosrcyny (próba kontrolna). Do probówek dodałem kilka kropli stężonego kwasu siarkowego i ogrzewałem je w łaźni olejowej w temperaturze 130 stopni Celsjusza (wahania temperatury nie wynosiły więcej niż 10 stopni). Uzyskane po reakcji stopy rozpuściłem w 5 l wody, a następnie dodałem 20% roztworu wodorotlenku sodu.

Obserwacje: W świetle ultrafioletowym zauważalna była jasnozielonkawa fluorescencja w probówce z bezwodnikiem bursztynowym i rezorcyną. Tymczasem w probówce z samą rezorcyną zaobserwowaliśmy jasnoniebiską fluorescencję, powstałą w wyniku przegrzania próbki i rozpadu rezorcyny na mniejsze fragmenty, wykazujące właściwości fluorescencyjne.

Wniosek: Wystąpienie zjawiska luminescencji w probówce z bezwodnikiem kwasu bursztynowego wskazuje, że jest to kwas dikarboksylowy.

Wzory:

bezwodnik kwasu bursztynowego rezorcyna (1,3-dihydroksybenzen)

e. Wykrywanie układów nienasyconych w kwasach karboksylowych

Wykonanie: Do 2 ml zalkalizowanego roztworu kwasu fumarowego dodawałem wolno, kroplami roztwór KMnO4.

Obserwacje: Roztwór natychmiast się odbarwił. Powstała początkowo zielonkawa, a następnie brunatna zawiesina.

Wniosek: Brunatna zawiesina powstała w roztworze wskazuje na obecność wiązania podwójnego w cząsteczce kwasu fumarowego.

Reakcja:

HOOC-CH=CH-COOH + KMnO4 → HOOC-CH-CH-COOH + MnO2

[kwas fumarowy (butenodiowy) + manganian potasu (VII) → kwas 2,3-dihydriksybutanodiowy + tlenek manganu (IV)]

2. Aminokwasy

Aminokwasy stanowią organiczne związkami chemiczne zbudowane z zasadowej grupy aminowej i kwasowej grupy karboksylowej, co sprawia, że posiadają właściwości amfoteryczne. Są to bardzo ważne związki z biologicznego punktu widzenia, gdyż to właśnie z nich budowane są białka. W przyrodzie najczęściej występuja 2-aminokwasy (w skład tej grupy wchodzą m.in. wszystkie 20 aminokwasów białkowych, które tworzą całą znaną nam biosferę).

Zastanowić się możemy nad licznymi podziałami aminokwasów. Kryteria oceny są naprawdę różne, o czym można się przekonać studiując następną stronę sprawozdania. Wyróżniamy więc:

1. Ze względu na występującą liczbę aminowych oraz karboksylowych grup w cząsteczce wyróżniamy:

a) aminokwasy obojętne – ilość aminowych oraz karboksylowych grup jest równa,
b) aminokwasy kwaśne – ilość karboksylowych grup jest większa niż liczba grup aminowych,
c) aminokwasy zasadowe – ilość grup aminowych jest większa niż liczba grup karboksylowych.

2. Podział aminokwasów w związku z budową łańcucha węglowego:

a) aminokwasy alifatyczne,  hydroksyaminokwasy należą do nich seryna oraz treonina. Łańcuchy boczne, które posiadają są neutralne czyli pozbawione ładunku oraz polarne ze względu na obecność grupy hydroksylowej,
b) aminokwasy siarkowe należą do nich cysteina oraz metionina. Cysteina przy wpływie łagodnych czynników, które są utleniające dimeryzuje czyli podlega reakcji chemicznej do cystyny i tworzy się wiązanie disiarczkowe,
c) aminokwasy aromatyczne oraz heterocykliczne, należą do nich aminokwasy, które zawierają podstawnik aromatyczny czyli fenyloalanina, tyrozyna oraz tryptofan. W tyrozynie w pierścieniu występuje dodatkowo grupa hydroksylowa. Przykładem aminokwasu heteroaromatycznego jest tryptofan,
d) aminokwasy alifatyczne należą do nich: leucyna, alanina, walina, izoleucyna i prolina. Charakteryzują się posiadaniem alifatycznego, niepolarnego czyli hydrofobowego łańcucha bocznego (R).

3. Aminokwasy charakteryzujące się na polarnością grupy R występującej w pobliżu węgla a dzielimy na:

a) aminokwasy polarne – należą do ich: glicyna, arginina, asparagina, tyrozyna, lizyna, cysteina, kwas asparaginowy oraz glutaminowy, treonina, seryna i histydyna,
b) aminokwasy niepolarne – należą do ich: alanina,leucyna, izoleucyna, metionina, fenyloalanina, prolina i walina.

4. Podział aminokwasów w związku z położeniem grupy aminowej:

a) aminokwasy α – posiadające grupę aminową, która połączona jest z atomem węgla α, który znajduje się w sąsiedztwie grupy karboksylowej,
b) aminokwasy β – posiadające grupę aminową, która połączona jest z atomem węgla β, który połączony jest z grupą karboksylową,
c) aminokwasy γ – posiadające grupę aminową, która połączona jest z atomem węgla γ, który połączony jest z grupą karboksylową,
d) aminokwasy δ – posiadające grupę aminową, która połączona jest z atomem węgla δ, który połączony jest z grupą karboksylową,
e) aminokwasy ε – posiadające grupę aminową, która połączona jest z atomem węgla ε, który połączony jest z grupą karboksylową.

5. Ze względu na syntezę aminokwasów w organizmie:

a) aminokwasy egzogenne – w przypadku ludzi należą do ich: fenyloalaninę, leucynę, izoleucynę, metioninę, walinę, lizynę treoninę, tryptofan, histydynę oraz argininę,
b) aminokwasy endogenne – pozostałe aminokwasy białkowe.

Aminokwasy mogą ulegać zobojętnieniu, tworząc sól wewnętrzną. Takie oddziaływanie wewnątrzcząsteczkowe jest możliwe dzięki przeniesieniu protonu z grupy karboksylowej na atom azotu grupy aminowej. Zależnie od pH środowiska, w cząsteczkach aminokwasów zanacza się silniej charakter zasadowy grupy amonowej lub kwasowy grupy karboksylowej. Wartość pH, przy której obie te grupy są zdysocjowane w tym samym stopniu nazywamy punktem izoelektrycznym. Wartość ta jest uwarunkowana obecnością podstawników kwasowych lub zasadowych i wskazuje nam rozpuszczalność aminokwasu.

Organizmy roślin, zwierząt wyższych oraz człowieka posiadają aminokwasy mające konfigurację L, natomiast aminokwasy D występują zazwyczaj sporadycznie (np. w ścianach komórek bakteryjnych). Wszystkie białkowe aminokwasy poza glicyną nie posiadającą asymetrycznego węgla są α-aminokwasami. Przykładami mogą być aminokwasy egzogenne, które nie są wytwarzane w organizmie człowieka. Do aminokwasów endogennych tworzonych przez organizm, należą aminokwasy gliko- oraz ketogenne, które prowadzą do wytwarzania glukozy oraz związków ketonowych.

Aminokwasy ulegają reakcjom typowym dla amin, jak i dla kwasów karboksylowych. Jedną z ważniejszych reakcji jest konensacja ząsteczek aminokwasów z utworzeniem peptydów (amidów drugorzędowych). Powstałe wiązanie nosi miano wiązania peptydowego (-CO-NH-).

Poszczególne aminokwasy łączą się ze sobą szeregowo. Grupa aminowa jednego aminokwasu łączy się z grupą karboksylową następnego. Takie wiązanie nazywamy wiązaniem peptydowym.

Jeśli powstały w ten sposób związek liczy kilka aminokwasów, nazywamy go peptydem, jeśli więcej - mówimy o polipeptydzie. W białku długość łańcucha przekracza 100 aminokwasów, zazwyczaj jest ich znacznie więcej. Poszczególne białka różnią się ilością aminokwasów oraz kolejnością ich ułożenia (sekwencją). Istnieje niewyobrażalnie wiele możliwości ułożenia 20 rodzajów aminokwasów w łańcuchu liczącym kilka czy też kilkanaście tysięcy ogniw. Stąd bierze się ogromna różnorodność białek.

Struktura I-rzędowa to kolejność ułożenia aminokwasów w cząsteczce białka. Pomiędzy aminokwasami tworzącymi łańcuch polipeptydowy mogą powstawać inne wiązania (nie peptydowe!). Często aminokwasy takie leżą w pewnej odległości od siebie i powstanie nowego wiązania powoduje wygięcie i określone ułożenie łańcucha w przestrzeni. Najczęściej struktura taka wygląda dość chaotycznie, ale czasami, na niektórych odcinkach łańcucha przyjmuje regularną postać helisy (α helisa), rzadziej strukturę pofałdowanej kartki (β harmonijka). Rodzaj struktury II-rzędowej zależy od rodzaju aminokwasów w łańcuchu i sposobu ich ułożenia.

Struktura II-rzędowa to sposób ułożenia łańcucha aminokwasów w przestrzeni. Rodzaj struktury II-rzędowej zależy od struktury I-rzędowej. Cząsteczka posiadająca już strukturę II-rzędową układa się przestrzennie, tworząc ostateczny swój kształt. Na sposób ułożenia się cząsteczki również mają wpływ oddziaływania między aminokwasami. Szczególną rolę odgrywają tu aminokwasy zawierające siarkę. Pomiędzy nimi tworzą się wiązania zwane mostkami siarczkowymi.

Struktura III-rzędowa to ostateczny kształt cząsteczki białka w przestrzeni. Rodzaj struktury III-rzędowej zależy od struktury I- i II-rzędowej. W zależności od typu struktury III-rzędowej białka możemy podzielić na globularne (o kształcie cząsteczki zbliżonym do kulki. Taką strukturę ma większość białek, przede wszystkim te, które są enzymami) oraz fibrylarne, czyli włókniste. Występują rzadziej i są białkami budulcowymi, np. kolagen.

Niektóre białka tworzą jeszcze bardziej skomplikowane układy - kilka cząsteczek łączy się ze sobą i dopiero wtedy powstaje ostatecznie białko. Przykładem może tu być hemoglobina, składająca się z czterech podjednostek. Struktura IV-rzędowa to połączenie kilku białkowych podjednostek w jedną cząsteczkę.

f. Chromatografia cienkowarstwowa dabsylowych pochodnych aminokwasów

Chromatografia cienkowarstwowa jest techniką chromatografii wykonywanej na nośniku (żel krzemionkowy, tlenek glinu, mikrostatyczna celuloza, sefadeks) umieszczonym w postaci cienkiej warstwy na płytkach lub foliach (aluminiowych, szklanych lub wykonanych z tworzyw sztucznym). Wartością określającą układ jest współczynnik Rf, czyli stosunek odległości przebytej od linii startu przez składnik mieszaniny, do odległości przebytej przez rozpuszczalnik.

Wykonanie: W probówkach ze szliefem zmieszałem 0,5 ml roztworu badanego aminokwasu i 0,5 ml roztworu chlorku dabsylu. Następnie dodałem do probówek 0,5 ml buforu węglanowego. Probówki szczelnie zamknąłem korkiem i wstawiłem do łaźni wodnej o temperaturze 70 stopni Celsjusza na klika minut. Powstały roztwór schłodziłem. Następnie przygotowałem płytki, na których narysowałem ołówkiem linię startu na wysokości 2 cm od brzegu i zaznaczyłem miejsca nanoszenia próbek, odległe od siebie o 2 cm. Zaś pod drugą stroną podpisałem pierwszymi trzema literami nakraplane aminokwasy. Po każdej naniesionej kropli suszyłem żel. Po nakropleniu aminokwasów i wysuszeniu płytek, umieściłem je w zlewce z układem rozwijającym, tak, że linia startu znajdowała się pod linią startu. Zlewkę przykryłem folią aluminiową. Wyciągnąłem płytki gdy układ rozwijający sięgał do wysokości 2 cm od górnej krawędzi płytki. Linię frontu obrysowałem i wysuszyłem, a następnie zaznaczyłem środki poszczególnych plam. Wartości Rf podałem w tabelce. Wyniki zamieszczam w formie kserokopii.

Wniosek: Badany aminokwas X, to glicyna, ponieważ mają zbliżony Rf.

Tabela:

Nazwa aminokwasu	Odległość osiągnięta przez aminokwas od startu	Współczynnik Rf
Glicyna (Gly)	1,7 cm	0,33
Fenyloalanina (Fel)	3,4 cm	0,66
Alanina (Ale)	3,6 cm	0,71
Leucna (Leu)	2,8 cm	0,55
Kwas asparginowy (Asp)	3,0 cm	0,59
Kwas glutaminowy (Kwg)	3,3 cm	0,65
Próba kontrolna (chlorek dabsylu)	2,3 cm	0,42
Próba badana (X)	1,6 cm	0,31

Odległość przebyta przez rozpuszczalnik – 5,1 cm