Temat: Oznaczanie bilirubiny w surowicy krwi.
Metoda – opis:
Bilirubina jest u ssaków produktem degradacji hemu pochodzącego przede wszystkim z uwalnianej przy rozpadzie krwinek hemoglobiny, ale także z innych katabolizowanych hemoprotein. Bilirubina powstaje w układzie siateczkowo – śródbłonkowym i transportowana jest wraz z krwią. W komórkach wątroby bilirubina przekształcana jest w diglukuronid bilirubiny wydzielana z żółcią do jelita i ostatecznie wydalana z kałem. Oznaczanie bilirubiny polega na przekształceniu jej w diazobarwnik w reakcji sprzęgania z chlorkiem diazoniowym kwasu sulfanilowego i kolorymetrycznym oznaczeniu stężenia barwnego produktu. Do mieszaniny reakcyjnej dodaje się też kofeiny lub metanolu, które powodują przejście nierozpuszczalnej bilirubiny do roztworu.
Wykonanie:
a) krzywa kalibracyjna: sporządzić odczynnik diazowy. Przygotować 7 probówek. Do pierwszej (próba odczynnikowa) odmierzyć 4,5 ml metanolu, a do następnych (próby wzorcowe w dwóch powtórzeniach) odmierzać parami odpowiednie ilości metanolu i roztworu wzorcowego bilirubiny, dzięki czemu otrzymujemy stężenia bilirubiny 0,02 mg%, 0,1 mg% i 0,2 mg%. Do każdej probówki dodać 0,5 ml odczynnika diazowego i wymieszać. Po 30 min zmierzyć absorbancję wszystkich prób wzorcowych wobec próby odczynnikowej przy długości fali 546 nm. Na podstawie wartości stężeń i odpowiadających im absorbancji obliczyć współczynnik kalibracji F = c/A dla danych warunków reakcji.
b) wykonanie oznaczenia: Surowicę wołową rozcieńczyć 5-krotnie wodą. Przygotować 4 probówki. Do każdej odmierzyć po 2,5 ml metanolu. Do probówek 1. i 2. (kontrolne) dodać po 0,5 ml rozcieńczonego HCl, a do probówek 3. i 4. (badane) po 0,5 ml odczynnika diazowego. Do wszystkich czterech probówek odmierzyć po 2 ml rozcieńczonej surowicy. Zawartość probówek dokładnie wymieszać. Po 30 min mierzyć absorbancję wszystkich 4 prób wobec próby odczynnikowej przy 546 nm.
Obliczenia:
C [mg%] = (Ab - Ak) * F * 5