17. METODY POZYSKIWANIA OOCYTÓW 1.Przyżyciowe:*aspiracja oocytów z pęcherzyków jajnikowych pod kontrolą USG - dopochwowo za pomocą sondy sprzężonej z igłą (technika OPU, ovum pick up) -krowy i klacze *laparotomia - wszystkie gatunki *laparoskopia - owce, kozy, świnie, krowy i klacze 2.Poubojowe: *aspiracja zawartości pęcherzyka za pomocą igły i strzykawki (lub igły z pompą ssącą) - wszystkie gatunki *rozrywania izolowanych pęcherzyków pod kontrolą mikroskopu stereoskopowego *nacinanie powierzchni jajnika prowadzące do uwalniania oocytów z pęcherzyków
Aspiracja przyżyciowa oocytów (technika OPU) * pozyskanych zostaje do 50% oocytów w stosunku do liczby aspirowanych pęcherzyków *możliwość powtarzania zabiegu dwukrotnie w ciągu jednego tygodnia, przez okres kilku miesięcy (jałówka - 13 oocytów przydatnych; 80-100 zarodków; 40 cieląt od jednej dawczyni w ciągu roku)* nie wpływa na uszkodzenie dróg rodnych dawczyni Aspiracja zawartości pęcherzyka za pomocą igły i strzykawki (pompy ssącej)powszechnie stosowana metoda pozyskiwania niedojrzałych oocytów u świń, bydła pozwala na uzyskanie od 30-60% oocytów w stosunku do liczby aspirowanych pęcherzyków trudnością w odzysku jest oddzielenie niektórych oocytów od przylegających komórek ziarnistych wzgórka jajonośnego biorąc pod uwagę, że tylko około 50% oocytów uzyskanych tym sposobem ma prawidłowy wygląd morfologiczny zaledwie 25% ogólnej populacji 2-6 mm pęcherzyków jajnikowych można wykorzystać do hodowli in vitro Rozrywanie izolowanych pęcherzyków pod kontrolą mikroskopu stereoskopowego* pozwala na uzyskanie praktycznie wszystkich oocytów zawartych w izolowanych pęcherzykach* odsetek prawidłowych morfologicznie oocytów jest o 20% wyższy niż przy metodzie aspiracji; ponad 60% ogólnej populacji 2-6mm pęcherzyków jajnikowych wykorzystywana jest do hodowli in vitro *ograniczenia: pracochłonność *metoda z wyboru w przypadku wykorzystywania cennego materiału genetycznego Nacinanie powierzchni jajnika prowadzące do uwalniania oocytów z pęcherzyków *pozwala uzyskać 3-krotnie więcej oocytów z jajnika w porównaniu z metodą aspiracji za pomocą igły i strzykawki * ograniczenia: pozyskane oocyty mogą pochodzić z bardzo małych pęcherzyków antralnych co może ograniczać ich szanse rozwojowe Pozyskiwanie oocytów *Oocyty pobiera się z małych i średniej wielkości pęcherzyków atrialnych np. u bydła z pęcherzyków o średnicy 2-6 mm *Oocyty uzyskane z pęcherzyków mniejszych niż 2 mm u bydła, a 1 mm u świni czy owiec mają bardzo ograniczone zdolności podjęcia mejozy i osiągnięcia In vKro stadium metafazy *W momencie pozyskiwania oocyty są kilkoma warstwami komórek ziarnistych zwanymi wieńcem promienistym oraz pasmem komórek należących do wzgórka jajonośnego i nazywane kompleksami oocyt-kumulus (COC)
18. OGÓLNE ZASADY DOJRZEWANIA I HODOWLI OOCYTÓW IN VITRO
Zapewnienie odpowiedniego środowiska zbliżonego do fizjologicznego poprzez dobór: *odpowiedniego składu pożywki -pH *os molarności *składu mieszanki gazowej *wilgotności *temperatury i czasu, w którym prowadzi się hodowlę. Podczas dojrzewania jądro oocytu osiąga stadium metafazy II podziału mejotycznego. W tym stadium oocyt jest dojrzały do zapłodnienia.
Pożywki i ich skład stosowane do dojrzewania i hodowli oocytów in vitro W procedurze dojrzewania oocytów (IVM) kluczowe jest zastosowanie odpowiednich mediów hodowlanych. Najczęściej: TCM-199 (roztwór soli Earla uzupełniony aminokwasami i glutaminą i pirogronianem sodu + dodatek hormonów).Inne medium NCSU-23 (z powodzeniem do dojrzewania oocytów świńskich) Pożywkę często uzupełnia się związkami energetycznymi (pirogronian sodu, mleczan sodu, glukoza) oraz białkiem (albumina surowicy bydlęcej, surowice różnych gatunków) Pożywka do współhodowli oocytów z komórkami ziarnistymi pęcherzyka, uzupełniona surowicą płodów cielęcych (FCS), powinna zawierać również dodatki hormonalne (FSH, LH, estradiol)
Warunki dojrzewania i hodowli oocytów in vitro * pH pożywki- granice 7.2-7A dla większości oocytów ssaków, pożywki buforuje się HEPES-em lub wodorowęglanem sodu (NaHCO,), hodowlę przeprowadza się w atmosferze 5% C02*Okres hodowli oocytów (zależy od tempa dojrzewania czyli osiągnięcia stadium metafazy II) -bydlęce i owcze 24 godz. - koźlęce 27 godz. - świńskie 40- 48 godz. Końskie 24-30 (36) godz. o *Temperatura - granice 35 -39*C - najczęściej stosowana temperatura dla oocytów bydlęcych to 39°C -Czas powinien być dłuższy, gdy dojrzewanie jest przeprowadzone w niższej temperaturze
19. KLASYFIKACJA MORFOLOGICZNA OOCYTÓW PO POZYSKANIU Z JAJNIKÓW 1. grupa a)otoczenie b) ooplazma. 1. a) powyżej trzech warstw ściśle przylegających komórek wzgórka jajonośnego b) równomierna granulacja, plazma równomiernie wypełnia osłonkę przejrzystą. bez przejaśnień i ziarnistości 2.a) warstwy komórek wieńca promienistego o grubości poniżej trzech warstw po części zwarte* niecałkowicie otaczają oocyt b) ooplazma wypełnia osłonkę przejrzystą, zbrylenia rab nierównomierne rozmieszczenie ooplazmy. 3. A) komórki wieńca promienistego rozpołchniene, komórki ułożone luźniej lab oocyt nagi— brak komórek wieńca promienistego b) ooplazma obknrczona, luerównomiernie wypełnia osłonkę przejrzysta, zregenerowana, fragmentacja, pusta osłonka.
20 CELE KRIOKONSERWACJI ZARODKÓW _I_ ZWIERZĄT GOSPODARSKICH *Kriokonserwacja zarodków wykorzystywanych w Standardowej metodzie transplantacji zarodków *Jako metoda ułatwiająca międzynarodową wymianę zarodków (transport zarodków zamiast zwierząt) * Tworzenie rezerwy genetycznej (ochrona zagrożonych ras zwierząt) *Tworzenia nowych linii lub ras - w przypadku ich wygasania
21 . METODY KRIOKONSERWACJ I OOCYTÓW I ZARODKÓW 1. zamrazanie zestalenie się schładzanego płynu na drodze krystalizacji ok. 1 °C/min 2 . witryfikacja- zestalanie się schładzanego płynu, poprzez bardzo szybki wzrost lepkości, w formie zeszklonej ok. 1200 "C/min. Szybkość rozmrażania w obu metodach kriokonserwacji Ok. 1800 °C/min (w zależności od temp. rozmrażania)
ZAMRAŻANIE Zestalanie się schładzanego płynu na drodze krystalizacji. Zarodki i oocyty zamraża się w specjalnych zamrażarkach sterowanych komputerowych, umożliwiających uzyskanie kontrolowanego spadku temperatury. Metody: Konwencjonalna wolna - stopniowe ochładzanie do temperatury ciekłego azotu,, najczęściej stosowane krioprotektory to glicerol, siarkotlenek dimetylu (DMSO), glikol etylowy Dwustopniowa szybka, gdzie docelowe stężenie krioprotektora i docelową temperaturę osiąga się bardzo szybko, taki proces wymaga wysoko zaawansowanej technologii i aparatury
WITRYFIKACJA- Zestalanie się schładzanego płynu w formie zeszklonej, a nie krystalicznej. Głównym warunkiem uzyskania witryfikacji danego roztworu jest konieczność użycia wysokich koncentracji związków osłaniających. • Następuje wzrost lepkości skoncentrowanej mieszaniny substancji osłaniających ■ Najlepiej do witryfikacji nadają się zarodki mysie, szczurze, królicze, owcze, kozie, końskie i bydlęce Zalety kriokonserwacji metodą witryfikacji w porównaniu do tradycyjnej metody zamrażania Zestalanie się płynu w formie zeszklonej, a nie krystalicznej co usuwa jedną z podstawowych przyczyn uszkodzeń komórek w trakcie zamrażania Metoda jest szybka i łatwa w użyciu Nie wymaga stosowania kosztownych urządzeń do kontrolowanego spadku temperatury (freezery), co jest niezbędne w przypadku zamrażania „Otwarte" metody witryfikacji - bezpośredni kontakt witryfikowanego płynu z ciekłym azotem 1.metoda kroplowa - „minimum drop size" - mieszanina witryfikacyjna o objętości kilku nanolitrów jest poddawana schłodzeniu w ciekłym azocie poniżej -210°C Technika sprawdzona z powodzeniem w przypadku oocytów świńskich i bydlęcych oraz bydlęcych i owczych zarodków (Araviwsp, 2002) Zaleta: mniejsze stężenia krioprotektorów mają wpływ na zarodek, wysoka przeżywalnośc zarodków po rozmrożeniu 2.metoda OPS (Open Pulled Straw) - opiera się na maksymalnym ograniczeniu ilości płynu zawierającego witryfikowane zarodki (bydło, świnie)
Metody kriokonserwacji oocytów i zarodków ssaków: Kriokonserwacja oocytów: *możliwość krikonserwacji materiału genetycznego cennych klaczy, *kriokonserwacja oocytów skuteczna u wielu gatunków, np. myszy, bydła, ludzi, koni, bydła. *przeżywalność 16% przy kriokonserwacji glikolu etylenowym wykorzystując metodę powolnego chłodzenia i 17% przy nitryfikacji. *dojrzałe jak i niedojrzałe oocyty klaczy mogą być skutecznie kriokonserwowane z użyciem nitryfikacji, aczkolwiek jest niższa niż w przypadku oocytów bydlęcych. Kriokonserwacja zarodków: -przez dłuższy czas możliwość ta zaniedbywana (problemy z rejestracją źrebiąt uzyskanych w ten sposób, superowulacja rzadko wywoływana - znacznie ograniczona ilość pozyskiwanych zarodków), -zamrażanie zarodków koni skomplikowane- zarodek otoczony kapsułą, która utrudnia penetracje krioprotektantów do wnętrza blastycyst. Zarodki koni lepiej znoszą proces zamrażania kapsuły, gdy w stadium moruli lub wczesnej balstocysty i ich średnia nie przekracza 300 um, -większość zagrożonych blastocyst nie jest eksportowanych, ale są one przechowywane w ramach konserwacji materiału genetycznego (banki zarodków)
22. CZYNNIKI WARUNKUJĄCE KRIOKONSERWACJĘ ZARODKÓW SSAKÓW * gatunek *Stadium rozwoju *Stan fizjologiczny *Jakość zarodka *Metoda kriokoriserwacjr *Związek osłaniający: rodzaj, koncentracja, sposób dodawania oraz usuwani
23. Przygotowanie gamet do zapłodnienia Dojrzewanie oocytów- jako wzrost oocytu określa się jego przekształcenia zachodzące w diktiotenie (diplotenie profazy I), czyli od narodzin samicy (także kobiety) do jajeczkowania. Od owulacji czyli od wznowienia mejozy do drugiego bloku w metafazie 2- komórka jajowa dojrzewa . CSF blokuje rozpad MPF- u do momentu dostania się plemnika do oocytu. Wtedy oba czynniki zostają zdegradowane. U różnych organizmów drugi blok oocytu następuje w odmiennym czasie. Dla przykładu: *blok w metafazie I występuje u rozgwiazd, niektórych pierścienic, owadów i mięczaków, *blok w metafazie II u ssaków, płazów, ryb i lancetnika, *brak zatrzymania mejozy u jeżowca, parzydełkowców. Kapacytacja- zmiany zachodzące w plemniku w drogach rodnych samicy umożliwiające zapłodnienie. Czas trwania kapacytacji wynosi ok. 3-7 godz. W tym czasie osłonka glikoproteinowa leżąca nad akrosomem i białka płynu nasiennego zostają usunięte, następuje hiperaktywacja plemnika. Plemnik musi przejść kapacytację aby mogła nastąpić reakcja akrosomowi- kolejny etap w procesie wnikania plemnika do oocytu. Reakcja ta jest odwracalna. Reakcja akrosomowa- związanie plemnika na osłonce przejrzystej przez ZP3 spełniające rolę receptora indukuje reakcję akrosomowi. Polega ona na fuzji błony plazmatycznej główki plemnika i zewnętrznej błony akrosomowej. Prowadzi to do egzocytotycznego uwolnienia akrosomu licznych enzymów które trawią osłonkę przejrzystą. Indukcja reakcji akrosomowej prawdopodobnie zachodzi przy współudziale białek G znajdujących się w błonie komórkowej plemnika. Stymulacja receptora ZP3 uaktywnia reakcję białka G oraz powoduje depolimeryzację błony plemnika. Następuje aktywacja kanałów wapniowych, napływ pozakomórkowego Ca2+ i w efekcie wzrost poziomu wewnątrzkomórkowego Ca2+ w plemniku. Po związaniu się z białkiem receptorowym ZP3 w plemniku obserwowany jest także stały wzrost pH. Warunkuje to kaskadę wewnątrzkomórkowych reakcji prowadzących do uwalniania wewnątrzkomórkowych zapasów wapnia. Alkalizacja plemnika w odpowiedzi na związanie z ZP3 prowadzi do aktywacji cyklazy adenylanowej, fosfatazy białkowej, kinazy białkowej A, kinazy tyrozynowej i fosfolipazy A2. Fosfolipaza A2 odpowiedzialna jest za rozłożenie fosfatydylocholiny na lizofosfatydylocholinę i kwas arachidonowy, które wywołują fuzję zewnętrznej błony akrosomowej z błoną komórkową plemnika. Odsłonięcie wewnętrznej błony akrosomu powoduje uwidocznienie białka PH 20 wiążącego się z receptorem ZP2 osłonki przejrzystej. Białkowy receptor ZP2 stabilizuje związanie plemnika po ukończeniu reakcji akrosomowej. REAKCJA AKROSOMOWA- Szereg zmian prowadzących do wniknięcia plemnika. Zachodzi ona po ukończeniu kapacytacji, w bezpośrednim kontakcie plemnika i oocytu. Podczas reakcji akrosomowej plemnik uwalnia z akrosomu enzymy trawiące: *hialuronidazę - przenikającą wieniec promienisty *trypsynopodobne enzymy i akrozynę - trawiące osłonkę przejrzystą *kwaśne fosfatazy *β-N-acetyloglukozaminidazę *fosfolipazy *kolagenazy *neuraminidazy *specyficzne esterazy
24. Testy laboratoryjne wykorzystywane do [oceny żywotności gamet i zarodków. Ocena oocytów(A)TEST BCB W teście wykorzystuje się obecność enzymu dehydrogenazy glukozo-6-fosforanu (G6PDH), który syntetyzowany jest w rosnących komórkach, bierze udział tn.in.. w szlaku pentozowym, który ma na celu dostarczaniu NADPH, niezbędnego do biosyntez redukcyjnych. W celu pomiaru aktywności S6PDH stosowany jest barwnik Brilliant cresyl blue (BCB). Niebieski barwnik w obecności aktywnego enzymu 96PDH odbarwia się. (B) Barwienie HOECHST 33258. Ocena zarodków(A) METODY FLUORESCENCYJNE I) Niespecyficzne substraty esterazy - barwniki fluorescencyjne (dioctan fluoresceiny, FDA; dioctan 6-karboxyfluoresceiny, CFDA) >Polega na hodowli zarodków w roztworze CFDA >CFDA ulega przekształceniu do fluorescencyjnego związku fluoresceiny pod wpływem esteraz znajdujących się w żywych komórkach. >Zarodki ocenia się przy użyciu światła ultrafioletowego, nie uszkodzone zarodki wykazują silną fluorescencję w kolorze zielonym. II) Barwniki fluorescencyjne mające powinowactwo do kwasów nukleinowych> W przypadku naruszeni przepuszczalności błon membranowych barwnik fluorescencyjny wiąże się z DNA chromatyny zarodka a) Barwienie DAPI *(4,6-diamino-2-phenylindol ) - barwnik wiążący DNA, wiążąc się z martwymi jądrami komórkowymi daje fluorescencję. *Może być używany w kombinacji z CDFA. b) Barwienie HOECHST 33342 Badanie przydatne do oceny liczby blastomerów (jąder komórkowych), uwidocznienia przedjądrzy, jak też chromosomów (B) APOPTOZA - PROGRAMOWANA ŚMIERĆ KOMÓRKI *Ściśle regulowany aktywny proces fizjologiczny o charakterystycznych cechach morfologicznych, w wyniku którego usuwane są niepotrzebne lub niewykorzystane komórki podczas embriogenezy i rozwoju organów oraz uszkodzone, nieprawidłowo umiejscowione, zmutowane lub zainfekowane komórki, co stanowi mechanizm obronny organizmu; Do identyfikacji komórek apoptotycznych stosuje sią szereg metod, które pozwalają na wykrywanie endonukleotitycznej fragmentacji DNA, zmian morfologii komórek oraz aktywacji lub supresji określonych białek Metody identyfikacji apoptozy - badania fluorescencyjne i) Wykrywanie zmian w błonie komórkowej *Przemieszczenie fosfatydyloseryny (PS) z wewnętrznej do zewnętrznej warstwy błony komórkowej (asymetrię błony) zapewnia flipaza, która jest inaktywowana przez *Do PS łatwo przyłącza sią białko aneksyna V, która po wyznakowaniu f luorochromem (FITC), służy do wykrycia w mikroskopii fluorescencyjnej lub cytometrii przepływowej PS na powierzchni komórek. (ii) Wykrywanie fragmentacji DNA (a) Metoda analizy ,,komet", elektroforeza pojedynczych komórek w żelu agarozowym, SCSE) *jest czułą metodą oznaczania uszkodzeń DNA na poziomie pojedynczych komórek *opiera się na wykorzystaniu zdolności zdenaturowanych fragmentów DNA do migracji w polu elektrycznym *pozwala na identyfikację jedno- (SSB) i dwuniciowych pęknięć (DSB) cząsteczki DNA (b) Wykrywanie fragmentacji DNA - technika TUNEL *Pęknięcie łańcucha DNA można wykrywać przez enzymatyczne dobudowanie znakowanych nukleotydów. W tym celu stosuje się trifosforan deoksyurydyny (dUTP) lub bromodeoksyurydyny (Br-dUTP) sprzężony z f luoresceiną, który przy użyciu enzymów, takich jak terminalna transferaza deoksynukleotydów (TdT) czy polimeraza DNA jest wbudowywany w miejscach pęknięć łańcuch DNA. Sygnał fluorescencyjny może być wykryty przez cytometrię przepływową lub w mikroskopie fluorescencyjnym (C) TESTY OCENIAJĄCE METABOLIZM ZARODKÓW" pomiary dehydrogenazy mleczanowej, pomiary ubywania tleniu i wzrostu stężenia COz w pożywkach