W Lodiszu od strony 157, ale nie wszystko co tu jet to tam znalazłem (np. nie ma tam o spektrynie i przyjaciołach)

21. Białka błon i ich lokalizacja w tych strukturach

Białka stanowią ok 50% masy błon biologicznych i to one odpowiadają za wiele z jej istotnych funkcji. Są transporterami substancji, kotwiczą błonę do makromolekuł po obu jej stronach, działają jako receptory cząsteczek sygnałowych i biorą udział w wielu innych procesach m.in. adhezji komórek. Zestaw białek dla każdej błony w komórce jest charakterystyczny, podobnie jak zestaw białek w błonach plazmatycznych rożnych typów komórek.

Białka błonowe mogą mieć różna lokalizację. Integralne białka błonowe przechodzą przez membranę, peryferyjne leżą na membranie zasocjowane z integralnymi, a lipoproteiny posiadają resztę lipidową kowalencyjnie związaną z łańcuchem polipeptydowym, która zanurza się w hydrofobowym zrębie membrany. Oczywiście, białka mają ściśle ustaloną orientację, tzn integralne zawsze eksponują tą samą domenę do cytozolu a peryferyjne i zakotwiczone leżą po określonej stronie błony.

22. Integralne białka błonowe

Integralne białka błonowe, które można oddzielić od błony jedynie detergentami lub rozpuszczalnikiem organicznym, składają się z trzech głównych części. Dwie hydrofilowe domeny podobne do rozpuszczalnych w wodzie białek rozdzielone są domeną hydrofobową, która przechodzi przez dwuwarstwę lipidową. Domena transbłonowa zawiera aminokwasy alifatyczne, które oddziałują przez oddziaływania van der Waalsa i hydrofobowe z hydrofobowymi ogonami łańcuchów kwasów tłuszczowych. Domeny hydrofilowe mogą zawierać aminokwasy naładowane dodatnio, które wiążąc ujemnie naładowane główki fosfolipidów dodatkowo kotwiczą białko w błonie.

Istnieje kilka klas białek integralnych, dzielonych ze względu na charakter domeny transmembranowej.

Pierwsze z nich to białka z hydrofobową α-helisą przebiegającą w poprzek membrany. Helisa idealnie nadaje się do tej roli, ponieważ polarne grupy wiązania peptydowego (NH i O=) mogą w jej wnętrzu tworzyć ze sobą oddziaływania wodorowe, co zmniejsza ich niekorzystne oddziaływania z hydrofobowym środowiskiem. Helisy takie mają typowo 20-25 hydrofobowych aminokwasów i długość ok 3,5nm czyli akurat tyle, żeby przebić się przez membranę. Białka integralne z transbłonowymi helisami mogą ich mieć jedną lub kilka. Przykładem białka z jedną helisa jest glikoforyna, główne białko integralne erytrocytów. Helisy glikoforyny w membranie oddziałują ze sobą tworząc dimery „coiled-coil”. Do białek posiadających wiele helis należą m.in. receptory sprzężone z białkami G, która mają 7 transbłonowych helis. Kanały jonowe to tetramery podjednostek zawierających po 2 helisy. Łączą się w taki sposób, że hydrofilowe aminokwasy helis tworzą pomiędzy podjednostkami hydrofilowy kanał, a hydrofobowe reszty oddziałują z błoną.

Odmienną domenę transmembranową posiadają bakteryjne białka - poryny (nie akwaporyna, ona ma alfa helisy). Zawierają one baryłki utworzone z 16 wstążek beta, w których hydrofilowe resztywystają do środka i tworzą kanał dla małych rozpuszczalnych w wodzie substancji, a hydrofobowe wystają na zewnątrz i oddziałują z lipidami błony i innymi porynami asocjując w trimery.

23. Przykłady białek zakotwiczonych w błonie przez resztę lipidową

Są trzy różne modyfikacje polegające na dołączeniu kotwic lipidowych:

• dołączenie GPI ( glikozylofosfatydyloinozytolu ) do białek zewnętrznej strony błony komórkowej. GPI zawiera fosfatydyloinozytol oraz zmienna ilość reszt mannozy, N-acetyloglukozoaminy i fosfoetanoloaminy i jest związany przez fosfoetanoloaminę z C-końcem białek. W ten sposób modyfikowane są np. alkaliczna fosfataza i Thy-1

• dołączenie reszty prenylowej (15 węglowy farnezyl albo 20 węglowy geranylogeranyl) wiązaniem tioeterowym do cysteiny na C-końcu lub blisko C-końca. Czasami mogą być dwie kotwice. Przykładem tak modyfikowanych białek jest Ras i Laminy typu B

• dołączeniem reszty mirystynianu albo palmitynianu do N-końcowej glicyny

Białka z GPI i z acylowane lokalizują się w raftach, białka prenylowane wręcz przeciwnie.

24. Białka peryferyjne

Są to białka, które „leżą” po którejś ze stron błony, zasocjowane albo z białkami integralnymi, albo jak się niedawno okazało z polarnymi głowami fosfolipidów błonowych.

Istnieje kilka domen rozpoznających polarne fragmenty lipidów, najpopularniejsze to:

• PH (pleckstrin homology) rozpoznaje PIP2 i PIP3i posiadają ją np. plekstryna, PKB, fosfolipaza C

• C2 rozpoznaje kwaśne fosfolipidy i posiadają ją np. PKC, PI-3K i PTEN kinaza

• powtórzenie ankirynowe (ankirin repeat) rozpoznaje PS i posiada je, o dziwo, ankiryna

• FREM rozpoznaje PIP2 i posiadają ją: białko pasma 4.1, moezyna, ezryna i inne

Klasyczna definicja podaje tylko oddziaływanie z białkami integralnymi jako metodę zakotwiczenia przy błonie i dodaje jeszcze, że można je oddzielić od błony łagodnymi warunkami elucji a mianowicie: niską siłą jonową i wysokim lub niskim pH.

Ważnym białkiem peryferyjnym jest też spektryna, która tworzy szkielet błonowy. Z błoną połączona jest przez ankirynę (peryferyjną) i białko pasma 3(integralne). Oraz białko pasma 4.1, które wiąże ją do cytozolowych domen glikoforyny i pasma 3.

25. BPA, glikoforyna, spektryna, ankiryna

BPA - białko przenoszące aniony = białko pasma 3. Integralne białko błony erytrocytu. Jego nazwy wywodzą się od funkcji i od lokalizacji na żelu po rozdziale elektroforetycznym. W błonie występuje w postaci dimerów lub tetramerów utrzymywanych dzięki mostkom disiarczkowym, a każda podjednostka przebija błonę (hehehehe :>) ponad 10 (chyba 11, ale nie pamiętam dokładnie a nie mogę znaleźć) helisami. Takie kompleksy tworzą kanały które umożliwiają wymianę jonów HCO3 - na Cl - (kierunek zależy od gradientu stężeń) co jest ważne, bo erytrocyty przenoszą dwutlenek węgla z tkanek do płuc gównie w postaci anionów węglanowych rozpuszczonych w cytozolu. Oligomery BPA tworzą dodatkowo w błonie kompleksy z glikoforyną, które przez ankirynę i białko pasma 4,1 stanowią miejsca przyczepu szkieletu błonowego.

Glikoforyna - to sjaloglikoproteina błony erytrocytu. Składa się (masowo) z 40% polipeptydu i 60% reszt cukrowych. Zawiera jeden łańcuch polipeptydowy z N-końcem na zewnątrz komórki i jedną transbłonową helisą (reszty 62-95). Zewnątrzkomórkowa domena zawiera wiele reszt Ser/Thr, które są O-glikozylowane w sumie w 16 miejscach. Wewnątrzkomórkowa domena zawiera wiele polarnych i kwaśnych aminokwasów, ale ma też kilka naładowanych dodatnio, umieszczonych blisko główek fosfolipidów wewnętrznego listka błony. Oddziaływanie elektrostatyczne między nimi zapewnia dodatkowe kotwiczenie. Glikoforyna, jak już gdzieś było wspomniane, tworzy dimery „coiled-coil”. Jej główną funkcją jest tworzenie ujemnie naładowanego płaszcza dookoła erytrocytu, który umożliwia mu swobodne krążenie w krwi i przeciskanie się w wąskich naczyniach, bo zmniejsza adhezję do ścian naczyń.

Spektryna - Jest to peryferyjne białko błonowe występujące we wszystkich komórkach (chyba), nie tylko erytrocytach, choć tam jest najlepiej poznana. Stanowi 25% masy wszystkich białek błony. Jest głównym składnikiem szkieletu błonowego, tworząc charakterystyczną heksagonalną sieć. Spektryna występuje normalnie w postaci tetramerów mających postać giętkich prętów o długości ok 200nm. Tetramer ten jest homodimerem heterodimerów o długości 100nm złożonych z dwóch równoległych nawiniętych na siebie łańcuchów -  o masie 260kDa i  o masie 225kDa. Każdy z łańcuchów składa się z powtórzonej 106 aminokwasowej domeny tworzącej 3-niciową superhelisę. Kompleksy węzłowe składają się z krótkiego filamentu aktynowego (13 podjednostek aktynowych, 37nm) do którego dochodzi 6 włókien spektryny. Dodatkowo znajdują się tam białka wspomagające wiązanie aktynę ze spektryną: białko 4.4, dematyna (4.9) i adducyna. Szkielet błonowy jest przymocowany do błony w środku tetrameru spektrynowego. Beta-spektryna wiąże się z z ankiryną a ta z BPA (band 3).

Funkcje szkieletu błonowego to:

• regulacja rozmieszczenia białek błonowych

• umożliwienie komórce zmian kształtu i elastyczności (np. przeciskające się erytrocyty)

• zwiększenie stabilności błony i odporności mechanicznej komórki (bez szkieletu błonowego komórka pękałaby jak bańka mydlana)

Ankiryna - inaczej białko pasma 2.1. Jej głównym zadaniem jest kotwiczenie spektryny do BPA. Waży 206kDa i składa się z: domeny N-końcowej wiążącej BPA, domeny centralnej wiążącej spektrynę i C-końcowej domeny regulatorowej z dwoma oddzielnymi miejscami regulatorowymi dla wiązania spektryny i BPA.

26. Mechanizm utrzymywania asymetrii lipidów błonowych.

Utrzymywanie asymetrii lipidów błonowych odbywa się na dwóch poziomach. Syntezy lipdów i „flip-flop”. Pierwszy dotyczy zwłaszcza glikolipidów, których części lipidowe syntetyzowane są w ER a reszty cukrowe dodawane w aparacie Golgiego po stronie światła. Odrywające się od ER i Golgiego pęcherzyki mają glikolipidy po wewnętrznej stronie, a zlewają się z błoną w taki sposób, że ich środek zlewa się ze środowiskiem na zewnątrz komórki. Nie ma flipakolipidowych, dlatego zostają one po zewnętrznej stronie błony. (inaczej mówiąc, syntetyzowane są po niecytozolowej stronie błony a transport w komórce działa tak,że pęcherzyki zachowują tą samą niecytozolową stronę co inne błony) Fosfolipidy syntetyzowane są głównie po cytozolowych stronach błon z fosfoglicerolu i kwasów tłuszczowych. Żeby nie rósł tylko jeden listek muszą się równomiernie rozkładać. Ponieważ spontaniczny „flip-flop” jest ekstremalnie niekorzystny energetycznie (główka musi przejść przez zrąb ogonów) flipaza fosfolipidowa katalizuje flip-flop PC, PE i PS w obie strony dając średni czas półtrwania tych lipidów w jednym listku ok 0,5 min. Bardzo ważną flipazą jest translokaza aminofosfolipidowa, która utrzymuje większe stężenie PE i PS po wew. stronie błony w procesie zależnym od ATP. W komórkach starzejących się organizmów oraz komórkach apoptotycznych enzym ten jest inaktywowany, co powoduje zaburzenie asymetrii błon. W utrzymaniu PS w wewnętrznym listku błony bierze udział także spektryna, która w komórkach apoptotycznych oddziela się od błony i agreguje w cytozolu.

27. Detergenty zastosowanie a badaniach błon.

Detergenty to substancje amfipatyczne - posiadają jedną część dobrze rozpuszczalną w wodzie, a drugą dobrze rozpuszczalną w rozpuszczalnikach niepolarnych. W małych stężeniach rozpuszczają się w wodzie, a w większych tworzą micele, które eksponują do wody hydrofilowe główki. Detergenty mają zdolności solubilizowania lipidów i białek błony niszcząc struktury błon biologicznych. Z lipidami tworzą mieszane micele, a w przypadku białek opłaszczają hydrofobowe regiony i tworzą rozpuszczalne w wodzie agregaty. Grupa polarna detergentów może posiadać ładunek albo nie. Detergenty jonowe (te z ładunkiem) dodatkowo denaturują białka.

Jonowe: SDS, sole kwasów żółciowych (cholany), Niejonowe: Triton, Tween, oktyloglukozyd.

W badaniu błon detergenty używa się przede wszystkim do ekstrakcji białek integralnych. Głównie stosuje się niejonowe, aby nie zdenaturować ekstrahowanych białek.

Detergenty w małych stężeniach stosuje się też jeśli trzeba zwiększyć przepuszczalność albo płynność błony.

---