Podstawowe enzymy modyfikujące DNA przydatne do klonowania

Alkaliczna fosfataza

- z jelita cielęcego (CIP lub CIAP)

- bakteryjna (z E. coli)

- Shrimp (z krewetki)

Katalizuje usuwanie grup 5'fosforanowych z DNA, RNA oraz trifosforanów.

Enzymy różnią się odpornością na inaktywację termiczną, najbardziej odporna jest 7

fosfataza bakteryjna, najmniej fosfataza z krewetek (można ją inaktywować w 65oC).

Zastosowanie:

- defosforylacja końców DNA przy przygotowywaniu wektorów do klonowania

(fragmenty pozbawione grup fosforanowych na końcach nie mogą zamykać się

w kółko w reakcji ligacji)

- defosforylacja DNA lub RNA przed znakowaniem końców przy uŜyciu kinazy

polinukleotydowej T4

- defosforylacja białek

Fragment Klenowa polimerazy DNA I

Fragment Klenowa jest produktem proteolizy polimerazy DNA I z E. coli,

który ma aktywność polimeryzacji (3'→5') i aktywność egzonukleolityczną 3'→5',

ale stracił aktywność egzonukleolityczną 5'→3'. Dzięki temu zachował wierność

polimeryzacji holoenzymu nie degradując końców 5'.

Zastosowanie:

- wypełnianie lepkich końców (jednoniciowe odcinki wysunięte w kierunku

5', nić 3' cofnięta)

- sekwencjonowanie metodą Sangera

- synteza drugiej nici cDNA

- znakowanie metodą losowych oligonukleotydów ( tu moŜna zastosować

fragment Klenowa exo- , bez obydwu aktywności egzonukleolitycznych)

Nukleaza S1

Degraduje jednoniciowe odcinki kwasów nukleinowych

Zastosowania

- usuwanie jednoniciowych odcinków (3' i 5') na końcach DNA.

- przecinanie struktur szpilki do włosów

- mapowanie transkryptów

Egzonukleaza III

Egzonukleaza 3'→5' uwalniająca 5' mononukleotydy z dwuniciowych odcinków

DNA. Działa na DNA z jednoniciowymi nacięciami, degradując przeciętą nić. Nie

działa na wystające końce 3' o długości przynajmniej 4 nukleotydów i na DNA

jednoniciowy.

Zastosowanie:

- konstrukcja jednokierunkowych delecji we fragmentach DNA

- wytwarzanie jednoniciowych fragmentów DNA (np. jako matryc do

sekwencjonowania metodą Sangera).

Kinaza polinukleotydowa T4 8

Enzym, który katalizuje przeniesienie grupy γ-fosforanowej z ATP na koniec 5'-

OH DNA, RNA, oligonukleotydów lub nukleozydo 3'-monofosforanów i katalizuje

wymianę 5'-końcowej grupy fosforanowej. Ma równieŜ aktywność 3' fosfatazy.

Zastosowanie:

- dołączanie grup fosforanowych do syntetycznych oligonukleotydów

- znakowanie końców 5' kwasów nukleinowych

Odwrotna transkryptaza

Polimeraza DNA zaleŜna od RNA, kodowana przez gen pol z retrowirusów, np.

(M-MuLV, AMV czy M-MLV).

Zastosowanie:

- synteza pierwszej nici cDNA

- analiza RNA poprzez wydłuŜanie starter

---