System dwuhybrydowy w drożdżach:
Drożdżowy system dwuhybrydowy (Y2H) to jedna z najpowszechniej stosowanych metod identyfikacji
oddziaływań między białkami. Metoda ta wykorzystuje fakt, że czynniki transkrypcyjne są zbudowane
modułowo tj, posiadają dwie niezależne funkcjonalne domeny: wiązania DNA (BD- binding domain) i
domenę aktywatorową (AD- activator domain). System używany do ćwiczeń wykorzystuje drożdżowy
czynnik transkrypcyjny GAL4. Białko "przynęty" jest w tym układzie wyrażane w fuzji z GAL4-DNA-BD
zaÅ› "ofiara" - GAL4-AD (Fig1).
Fig1: W systemie Y2H domeny funkcjonalne
czynnika transkrypcyjnego GAL4 (domena wiÄ…zania
DNA oraz aktywatorowa) są połączone z białkiem
"przynęty" (BD-X) oraz potencjalnej "ofiary" (AD-
Y). Stransformowana komórka wyraża, zatem dwa
białka hybrydowe, które w przypadku oddziaływania
są w stanie aktywować ekspresje genów
reporterowych.
Do ćwiczeń wykorzystamy szczep reporterowy AH109, który posiada genotyp:
MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4", gal80", LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3,
GAL2UAS -GAL2TATA -ADE2, URA3::MEL1UAS -MEL1TATA -lacZ (James et al., 1996, A. Holtz,
unpublished).
Szczep ten posiada 3 geny reporterowe: HIS3 (kodujÄ…cy enzym szlaku biosyntezy histydyny), ADE2
(kodujÄ…cy enzym szlaku biosyntezy adeniny) oraz MEL1 lub LacZ (kodujÄ…ce odpowiednio Ä…- i ²-
galaktozydazę). Promotory tych genów są mają wprowadzone sekwencje UAS (ang: upstream activating
sequence (UASGAL)) oraz TATA-box, obecne w promotorach genów GAL1, GAL10, GAL2 i GAL7 (Fig 3).
Warto zwrócić uwagę, że zastosowanie aż trzech genów reporterowych znacznie zmniejsza możliwość
uzyskania wyników fałszywie pozytywnych (jest to szczególnie ważne w metodach wysokoprzepustowych,
ang: high-throuput), a usunięcie genów Gal4 i Gal80 dodatkowo zmniejsza ryzyko "wewnętrznej" aktywacji
genów repoterowych. Są one aktywowane tylko w sytuacji kiedy zachodzi oddziaływanie pomiędzy białkami
"przynęty" i "ofiary", a zatem domeny czynnika transkrypcyjnego są w stanie odtworzyć funkcjonalny
natywny układ.
Fig2: Przykładowe wektory stosowane w Y2H.
Plazmid pGBKT7 - umożliwia sklonowanie białka
"przynęty" w fuzji z domeną wiążącą DNA (DNA-
BD) oraz znacznikiem c-Myc. Wektor pGADT7
umożliwia sklonowanie białka "ofiary" w fuzji z
domenÄ… aktywatorowÄ… (AD) oraz znacznikiem HA.
Obydwa białka są wyrażane z konstytutywnych
promotorów genu ADH1 (dehydrogenaza
alkoholowa). Znaczniki umożliwiają wykrywanie
białek za pomocą odpowiednich przeciwciał
monoklonalnych.
 Komórki szczepu reporterowego są auksotroficzne pod względem histydyny, tryptofanu, leucyny oraz
wykazują fenotyp charakterystyczny dla mutacji genów szlaku biosyntezy adeniny tj., akumuluja czerwony
pigment w przypadku jej niedoboru w pożywce. Fenotyp Trp- / Leu- - umożliwia selekcję transformantów tj.
komórek, które pobrały plazmidy kodujące "przynętę" i "ofiarę" (Fig 2). Oddziaływanie pomiędzy badanymi
białkami hybrydowymi spowoduje aktywację genów (GAL1UAS-GAL1TATA)HIS3 oraz (GAL2 UAS -GAL2
)ADE2, czyli zniesienie fenotypu His- i Ade- (komórki stają się His+ oraz stracą czerwone zabarwienie
TATA
nie akumuluja intermediatów szlaku biosyntezy adeniny). Dodatkowo w tym przypadku aktywowany jest
popularny gen reporterowy LacZ, kodujÄ…cy ²-galaktozydazÄ™. Enzym ten rozkÅ‚ada X-gal (5-bromo-4-chloro-3-
indolilo-²-D-galaktopiranozyd) do niebieskiego, nierozpuszczalnego produktu, który powoduje zabarwienie
kolonii drożdży na szalce lub membranie. Możliwe są również ilościowe analizy spektrofotometryczne
aktywnoÅ›ci ²-galaktozydazy w drożdżowych ekstraktach biaÅ‚kowych, pozwalajÄ…ce na oszacowanie siÅ‚y
oddziaływania. Dobierając odpowiednie podłoża selekcyjne jesteśmy, zatem w stanie zidentyfikować klony,
w których zachodzi oddziaływanie pomiędzy "przynętą" a "ofiarą".
Fig3: Komórki drożdży posiadają liczne geny odpowiedzialne
za metabolizm galaktozy. Należą do nich tzw. geny strukturalne
(GAL1, GAL10, GAL2 i GAL7) kodujÄ…ce enzymy szlaku
katabolizmu galaktozy oraz geny regulatorowe (GAL4, GAL80 i
GAL3). Przez wiele lat drożdżowy czynnik transkrypcyjny
GAL4 - regulujący ekspresje genów strukturalnych- służył jako
model badawczy aktywacji transkrypcji u Eukaryota. Schemat
obok ilustruje regulacjÄ™ transkrypcji przez czynnik Gal4. W
warunkach nieindukujÄ…cych Gal80 blokuje domenÄ™
aktywatorową Gal4, uniemożliwiając tym samym aktywację
transkrypcji.
W warunkach indukcji galaktozą Gal80 odłącza się od Gal4, co
umożliwia jego domenie aktywatorowej rekrutację kolejnych
białek zaangażowanych w transkrypcję. Gal80 jest
transportowany na teren cytoplazmy, gdzie wiąże się silnie z
Ref 4.
Gal3. Grr1 i Dsg1 to enzymy zwiÄ…zane z systemem
ubikwitynacji (regulujÄ… poziomy Gal4) (4).
Literatura:
1) Van Criekinge W, Beyaert R "Yeast Two-Hybrid: State of the Art".
2) Guo D, Rajamäki ML, Valkonen J. (2008) " Protein-protein interactions: the yeast two-hybrid system"
Methods Mol Biol. 451:421-39.
3) Matchmaker"! GAL4 Two-Hybrid System 3 & Libraries User Manual - Clontech.
4) Traven A, Jelicic B, Sopta M. (2006) "Yeast Gal4: a transcriptional paradigm revisited" EMBO reports 7,
5, 496 499.