Zestaw 77

1. Udział witamin B₁ i B₆ w metabolizmie komórki.

Wit. B₁ - tiamina wzór:

- Składa się z pochodnej pirymidynowej i tiazolowej. Są one ze sobą połączone przez grupę metylenową.

- Difosforan tiaminy(TPP) jest aktywna postacią tiaminy.

Konwersję tiaminy do aktywnego difosforanu tiaminy katalizuje ATP-zależna difosfotransferaza tiaminowa występująca w tkance mózgowej i wątrobowej.

- Difosforan (pirofosforan) tiaminy jest koenzymem w reakcjach enzymatycznych z przenoszeniem aktywnych grup aldehydowych. Pirofosforan jest donorem stabilnego karboanionu-węgiel w poz.2 pierścienia tiazolowego-reagującego z węglem pozycji α substratu(grupa karbonylową substratu). Tak powstały związek addycyjny ulega dekarboksylacji, usuwającej CO₂ (tak jest w przypadku reakcji dekarboksylacji) lub następuje przeniesienie fragmentu przyłączonego do koenzymu na inny związek(tranferazy).

- Reakcje, w których bierze udział wit. B₁:

1. a) oksydacyjna dekarboksylacja 2-oksoketokwasów(koenzym liaz): dehydrogenaza

pirogronianowa, α-ketoglutaranowa - cykl Kresa - (budowa tych kompleksów enzymat.)

b) oksydacyjna dekarboksylacja w przemianach leucyny, izoleucyny i waliny - mitochondrialny

kompleks dehydrogenazy α-ketokwasów o łańcuchach rozgałęzionych katalizuje dekarboksylację α-ketokwasów powstałych z powyższych aminokwasów. Budowa tego kompleksu enzymatycznego jest podobna do dehydrogenazy pirogronianowej. Jej podjednostkami są: dekarboksylaza α-ketokwasowa(TPP), transacylaza, dehydrogenaza dihydrolipoilowa.

2. cykl pentozofosforanowy - transketolaza(koenzym transferaz) przenosząca fragment 2C z ksylulozo-5-fosforanu na rybozo-5-fosforan z utworzeniem sedoheptulozo-7- fosforanu i aldehydu 3-PG . W jednym z kolejnych etapów transketolaza przenosi fragment 2C z ksylulozo-5-fosforanu na erytrozo-4-fosforan z utworzeniem fruktozo-6-fosforanu i aldehydu 3-PG.

- Brak tiaminy powoduje:

a) zablokowanie lub znaczne ograniczenie reakcji zależnych od TPP i do akumulacji substratów tych reakcji.

b) jest przyczyną choroby beri-beri (objawy: neuropatia obwodowa, wyczerpanie, brak apetytu)

c) jest przyczyną encefalopatii Wernickiego - często u alkoholików, spożywających mało innych pokarmów

- Dzienne zapotrzebowanie: 1-2mg

- Dobrym źródłem tej witaminy jest: mąka razowa, drożdże, rośliny strączkowe, wieprzowina

Wit B₆ - składa się z 3 blisko spokrewnionych pochodnych pirydyny : pirydoksyny, pirydoksalu, pirydoksaminy oraz ich fosforanów. Wszystkie te związki wykazują taka sama aktywność biologiczną.

Pirydoksyna

- Główną postacią wit. B₆ w osoczu jest fosforan pirydoksalu(PLP)

- Większość tkanek zawiera kinazę pirydoksalową - katalizującą fosforyzację (przy udziale ATP) nieufosforylowanej postaci tej witaminy do odpowiednich estrów fosforanowych.

- PLP bierze udział w

A) jest koenzymem dla kilku enzymów przemiany aminokwasowej. Tworząc zasadę Schiffa(powstałą przez połączenie grupy aldehydowej z gr. NH₂ α-aminokw.)PLP może ułatwić wystąpienie zmian w zakresie pozostałych 3 wiązań węgla α-aminowego tj. transaminację, dekarboksylację, deaminację, racemizację lub rozszczepienie aldolowe aminokw., a także katalizuje reakcje węgli β (syntaza tryptofanowa) i γ (cystationaza)

Rola PLP w transaminacji - Harper str.749. - Jeśli brak jest substratu, to gr aldehydowa PLP tworzy zasadę Schiffa z gr ε-aminową reszty lizyny znajdującej się w centrum aktywnym enzymu(tworzy się aldoimina wewnętrzna). Po dodaniu substratu gr α-aminowa substratu wypiera gr ε-aminową lizyny(aldoimina wewnętrzna staje się aldoiminą zewnętrzną). Podczas transaminacji

1. aldoimina zewnętrzna traci proton przy Cα i tworzy chinonoid (produkt pośredni)

2. chinonoid ulega protonacji dając ketoiminę(wiązanie podwójne występuje między N i Cα w substracie)

3. ketoimina ulega hydrolizie do α-ketokwasu i fosforanu pirydoksaminy

Wymienione etapy to połowa procesu transaminacji. Druga część jest odwróceniem pierwszej, gdzie odtwarzany jest fosforan pirydoksalu.

• Wspólne cechy mechanizmu katalitycznego z udziałem enzymów zawierających PLP:

1. Między substratem(aminokw. lub składnik aminowy) a PLP(składnik karbonylowy) wytwarza się wiązanie typu zasady Schiffa.

2. PLP przechodząc w formę protonową działa jak pułapka elektronowa, co stabilizuje ujemnie naładowane intermediaty powstałe podczas katalizy. Azot pierścienia PLP przyciąga elektrony z substratów. PLP jest katalizatorem elektrofilowym

3. Zasada Schifa powstała podczas reakcji ulega hydrolizie.

• O wyborze jednej z możliwych dróg katalitycznych decyduje przestrzenne ułożenie elektronów (kontrola stereoelektronowa). Wiązanie, które ma być przerwane powinno być ułożone prostopadle do orbitali π cząsteczki PLP, np. w reakcji z udziałem aminotransferazy wiąz. C-H substratu przy węglu α jest ustawione prostopadle do pierścienia PLP.

Reakcje:

1) Koenzym aminotransferaz: np.a) aminotransferaza asparaginianowa

b) aminotransferaza alaninowa

c) aminotransferaza glutaminianowa i inne

Katalizują przeniesienie gr. NH₂ z odpowiedniego aminokw. na α-ketoglutaran z utworzeniem glutaminianu - jedna z reakcji przebiegającej podczas usuwania azotu z aminokw. Ponadto reakcje z udziałem tych enzymów są wykorzystywane do syntezy aminokwasów,np. alanina powstaje podczas transaminacji pirogronianu, a także są etapami pośrednimi w przemianach aminokw, np. hydroksyproliny, cysteiny.

2) Koenzym dehydratazy: treoninowej i serynowej - biorą udział w bezpośredniej deaminacji tych aminokw.

3) Koenzym kompleksu syntazy glicynowej, znajdującej się w mitochondriach wątroby, rozkładający glicynę do CO_2­ i NH₄⁺.

4) Koenzym hydroksymetylotransferazy serynowej - enzymu biorącego udział w powstawaniu glicyny z seryny. Podczas tego procesu atom Cβ bocznego łańcucha seryny zostaje przeniesiony na tetrahydrofolian.

5) Koenzym syntazy cystationinowej i cystationazy - enzymów biorących udział w syntezie cysteiny z homocysteiny i seryny. Najpierw te dwa składniki kondensują tworząc cystationinę (pod wpływem pierwszego enzymu), a potem pod wpływem drugiego następuje rozpad i deaminacja do cysteiny i α-ketomaślanu.

6) Koenzym syntazy tryptofanowej u E.Coli.

7) Koenzym dekarboksylazy DOPA - biorącej udział w przekształcaniu Dopa w dopaminę podczas przemian tyrozyny w norepinefrynę.

8) Koenzym dekarboksylazy glutaminowej przekształcającej glutaminian w γ-aminomaślan.

9) Koenzym kinukreninazy - enzym przekształcający kinukreninę i hydroksykinukreninę w hydroksylantranilan, w szlaku katabolizmu tryptofanu.

Hydroksylantranilan może być przekształcany w kwas nikotynowy. W przypadku niedoboru wit.B₆ może zostać upośledzona synteza NAD⁺ i NADP⁺ w wyniku niedostatecznej przemiany tryptofanu w kw. nikotynowy. Niedobór wit.B₆ może nasilić niedobór niacyny

10) Koenzym aldolazy treoninowej rozszczepiającej treoninę do glicyny i aldehydu octowego.

B) bierze udział w syntezie hemu. ,,Aktywuje” glicynę w reakcji jej kondensacji z sukcynylo-CoA prowadzącej do kwasu α-amino-β-ketoadypinowego, który natychmiast jest dekarboksylowany do ALA(kwasu δ-aminolewulinowego. Reakcja jest katalizowana przez syntezę ALA i zachodzi w mitochondriach.

C) Bierze udział w fosforolitycznym rozkładzie glikogenu. PLP tworzy zasadę Schiffa ze specyficzną resztą lizyny fosforylazy. Grupa 5'- fosforanowa PLP działa wspólnie z ortofosforanem, służąc jako donor, jak i akceptor protonów(uniwersalny katalizator kwasowo-zasadowy). Ortofosforan(w formie HPO₄^2-) oddaje proton na atom O-4 oddalającego się łańcucha glikogenowego i jednocześnie przejmuje proton z PLP. Jon karboniowy, będący związkiem przejściowym, ulega następnie atakowi przez ortofosforan, co prowadzi do powstania α-glukozo-1-fosforanu. W mięśniach każdy monomer fosforylazy(jest ona dimerem) zawiera 1 mol PLP.

D) Koenzym dekarboksylazy fosfatydyloseryny przekształcającej fosfatydyloserynę w fosfatydyloetanoloaminę.

- Niedobór:

a) Zwykle jest częścią niedoboru wielowitaminowego witamin z grupy B.

b) może wystąpić u dzieci karmionych piersią przez matki, u których zapasy tej wit. uległy wyczerpaniu na skutek długotrwałego zażywania doustnych środków antykoncepcyjnych.

c) może wystąpić u alkoholików w skutek przemiany etanolu do aldehydu octowego, stymulującego hydrolizę fosforanu pirydoksalu lub pirydoksaminy.

d) może być spowodowany izoniazydem - lekiem przeciwgruźliczym, tworzącym hydrazon z pi rydoksalem

e) może być jedną z przyczyn pelagry(główną przyczyną jest niedobór niacyny_

- Dzienne zapotrzebowanie: 2-3mg

- Dobre źródła: wątroba, makrela, jajka, awokado, banany.

2. Lipazy i fosfolipazy - lokalizacja, mechanizm działania.

Lipazy - enzymy hydrolizujące wiązania estrowe w triacyloglierolach, uczestniczą w trawieniu tłuszcz, przemianach lipoproteid i przemianach tłuszczy :

1. LIPAZA JĘZYKOWA :

- występuje w ślinie (jamie ustnej)

- produkowana przez gruczoły Ebnera, położone na grzbiecie języka

- trawi zemulgowane lipidy mleka (hydroliza wiązań w pozycji 3) - stąd też większa aktywność u niemowląt

- produkty działania enzymu to : kwasy tłuszczowe i 1,2-diacyloglicerole

- wykazuje małą aktywność (większa aktywność u niemowląt)

- optimum pH=4,0-4,5

2) LIPAZA ŻOŁĄDKOWA :

- występuje w soku żołądkowym

- trawi zemulgowane tłuszcze mleka

- rozszczepia wiązania α' - w pozycji 3

- wykazuje aktywność u dzieci(niemowląt), mała aktywność u dorosłych

- optimum pH=6 (takie jest w żołądku niemowląt)

- produkty działania enzymu to : kwasy tłuszczowe i 1,2-diacyloglicerole, krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe przedostają się do żyły wrotnej, natomiast długołańcuchowe rozpuszczają się w kroplach tłuszczu zawieszonych w treści żołądkowej i transportowane są do dwunastnicy.

- przy niskim pH ulega inaktywacji, ale jest aktywna podczas trawienia, co jest spowodowane buforującym działaniem białek zawartych w żołądku

3) LIPAZA TRZUSTKOWA

- występuje w soku trzustkowym wydzielanym do dwunastnicy

- wydzielana w postaci nieaktywnej przez trzustkę pod wpływem pankreozyminy

- aktywowana przy udziale kolipazy (białko trzustkowe; wydzielane w postaci nieaktywnej, do jej aktywacji konieczna jest hydroliza swoistych wiązań peptydowych przez trypsynę) i niskiego stężenia kw. żółciowych; aktywacja lipazy polega na odszczepieniu pentapeptydu z N-końca. Pentapeptyd działa jako sygnał sytości dla lipidów i nazywany jest enterostatyną.

- hydrolizuje zewnętrzne wiązania estrowe (1i 3) w TG z wytworzeniem WKT i 2-monoacylogliceroli, słabo działa na wiąz.β

- działa na tłuszcze zemulgowane przy udziale kwasów żółciowych

- hamowana przez sole kwasów żółciowych. Funkcją kolipazy jest przełamanie tego hamowania przez wiązanie się z lipazą (w stos: 1:1) oraz z fazą graniczną TG pokrytych solami kw. żółciowych. Kolipaza zakotwicza lipazę do substratu

4) LIPAZA AKTYWOWANA SOLAMI KWASÓW ŻÓŁCIOWYCH

- wydzielana przez trzustkę - występuje w oku trzustkowym wydzielanym do dwunastnicy; występuje także w mleku ludzkim

- jest dodatkowym czynnikiem zapewniający całkowite trawienie tłuszczów mleka(ważne u niemowląt, u których wydzielina trzustkowa nie jest jeszcze w pełni wykształcona.

- hydrolizuje wszystkie wiązania w TG, fosfolipidach(FL), estrach cholesterolu (ChE)

5) LIPAZA LIPOPROTEINOWA

- występuje w ścianach włosowatych naczyń krwionośnych, jest zakotwiczony do śródbłonka proteoglikanowym łańcuchem siarczanu heparanu. Syntetyzowana przez kom. parenchymalne nacz. krwion.

- nie występuje w wątrobie

- wymaga obecności fosfolipidów i apolipoproteiny C-II jako kofaktorów. ApoC-II ma swoje miejsce wiązania fosfolipidu, poprzez które jest związana z lipoproteiną.

- chylomikrony i VLDL dostarczają enzymowi zarówno substratów(TG) jak i kofaktorów

- hydroliza zachodzi, gdy lipoproteiny są przyłączone do enzymu na śródbłonku

- TG jest hydrolizowany stopniowo poprzez diacyloglicerol do monoacyloglicerolu, a w końcu do wolnego kwasu tłuszcz. I glicerolu

- niewielka ilość WKT wraca do krwiobiegu, gdzie jest wiązana z albuminą, znaczna część trafia do tkanki

- wynikiem działania tej lipazy jest utrata z chylomikronów ok. 90% TG i utrata apoC - powstają remnanty chylomikronów. Podobne zmiany zachodzą w VLDL i powstają IDL.

- aktywatory: apoC-II, insulina; inhibitory: WKT, siarczan protaminy

- ma różne powinowactwo do TG w zależności od miejsca, gdzie się znajduje: większe powinowactwo ma enzym znajdujący się w sercu niż w tk. tłuszcz. Ma to znaczenie w stanie głodu.

6) LIPAZA WĄTROBOWA

- występuje w hepatocytach

- substratami są TG i FL z HDL, remnantów chylomikronów,IDL, LDL , produktami są WKT, glicerol, cholesterol

- działa także jako ligand lipoproteidy

7) LIPAZA WRAŻLIWA NA HORMONY

- występuje w tkance tłuszczowej

- hydrolizuje TG do WKT i glicerolu. Glicerol przenika do osocza krwi, gdzie następnie jest wychwytywany przez takie narządy jak nerki, wątroba, które posiadają kinazę glicerolowi; natomiast WKT ulegają przekształceniu w acylo-CoA, a potem są reestryfikowane.

- jej aktywość jest regulowana przez procesy fosforylacji i defosforylacji. Forma ufosforylowana jest aktywna. Hormony wzmagające jej aktywność powodują pobudzenie cyklazy adenylowej, przekształcającej ATP w cAMP, który powoduje pobudzenie cAMP-zależnej kinazy białek, która powoduje fosforylację lipazy. Tak działa: adrenalina, noradrenalina, glukagon, TSH, ACTH,GH. Hamująco na fosfodiesterazę (enzym rozkładający cAMP) działają metyloksantyny, hormon tarczycy. Insulina pobudza fosfodiesterazę, hamuje cyklazę adenylową(hamują ją także kwas nikotynowy i prostaglandyna E₁), działa hamująco na aktywność lipazy. Glikokortykosteroidy pobudzają lipolizę przez stymulację syntezy białka, co może być hamowane przez insulinę.

FOSFOLIPAZY - enzymy pozwalające na degradację i przemodelowanie glicerolofosfolipidów.Są to enzymy trawienne oraz powodujące powstanie aktywnych cząsteczek sygnałowych lub ich bezpośrednich prekursorów.

1. FOSFOLIPAZA A₂

- wydzielana do dwunastnicy, występuje w soku trzustkowym

- wydzielana w postaci proenzymu, do jej aktywacji konieczna jest hydroliza swoistych wiązań peptydowych, katalizowana przez trypsynę

- działa na wiązanie β fosfolipidów

- aktywowana jonami C­a²⁺

- produktami jej działania są WKT i lizofosfolipidy, które są detergentami i wspomagają emulsyfikację i trawienie tłuszczy. Lizofosfolipid może być acylowany acyloCoA lub atakowany przez lizofosfolipazę usuwającą grupę acylową w poz.1 i pozostawiającą glicerol połączony fosfodiestrowo z odpowiednią zasadą.

- uwalnia także kwas arachidonowy - prekursor prostaglandyn, leukotrienów, tromboksanów

2) FOSFOLIPAZA A₁

- działa na wiązanie estrowe w pozycji 1

- występuje w soku trzustkowym

3) FOSFOLIPAZA B

- inaczej lizofosfolipaza

- katalizujje odszczepienie obydwu grup arylowych.

4) FOSFOLIPAZA C

-atakuje wiązanie w pozycji 3, uwalniając 1,2-diacyloglicerol i ufosforylowaną zasadę.

- jest to jedna z głównych toksyn bakteryjnych

- aktywowana jonami wapnia

- występuje w cytozolu kom.

- katalizuje rozszczepienie PIP₂(4,5-bisfosforan fosfatydyloinozytolu) do IP₃(1,4,5- trifosforanu inozytolu) i DAG

(diacyloglicerolu), które są cząsteczkami informacyjnymi(wewnątrzkomórkowymi przekaźnikami)

5) FOSFOLIPAZA D

- występuje u roślin

- katalizuje odhydrolizowanie zasady azotowej od fosfolipidu

3. Metody wyznaczania masy cząsteczkowej białek.

Wyznaczanie względnej masy cząsteczkowej jest jednym z etapów charakteryzowania białka pod względem chemicznym po wyizolowaniu go w czystej postaci.

Metody wyznaczania względnej masy cząsteczkowej:

1. ultrawirowanie przez wyznaczenie stałej sedymentacji Svedberga

Metoda ta mierzy szybkość sedymentacji białka w polu siły odśrodkowej. Prędkość sedymentacji zależy częściowo od jej masy. Cząstka o większej masie zawsze sedymentuje szybciej niż cząstka o tym samym kształcie i gęstości, ale o mniejszej masie. Współczynnik sedymentacji (s) jest to szybkość sedymentacji (v) podzielona przez przyspieszenie odśrodkowe (ω²r, gdzie ω - prędkość kątowa cząstek, r - promień okręgu, po jakim poruszają się cząstki).

m - masa cząstki ;
- cząstkowa objętość właściwa cząstki (odwrotność jej gęstości)

ρ - gęstość roztworu ; f - współczynnik tarcia cząstki

Wyraża się go najczęściej w swedbergach; 1 swedberg (S) = 10^-13 sekundy. Porównując stałą sedymentacji białka o nieznanej masie ze stałymi białek wzorcowych można wyznaczyć masę danego białka.

2. na podstawie składu białka (oznaczamy ilość O, C, N, S → masa białka)

3. na podstawie ciśnienia osmotycznego jakie białko wywiera na błonę półprzepuszczalną w ściśle określonym pH i stężeniu białka w roztworze

4. na podstawie efektu Tyndala (rozpraszania światła)

5. chromatografia na sitach molekularnych

Kolumny z żelu Sephadeks(dekstran) lub podobne matryce(np. agaroza lub poliakryloamid) mające pory(pory występują w ziarnach wypełnienia kolumny) o wiadomym rozmiarze kalibruje się, stosując białka o znanej masie cząsteczkowej. Małe cząsteczki mogą wejść do kanalików w ziarnach, natomiast większe lub o wydłużonym kształcie - nie mogą. Dlatego cząsteczki mniejsze znajdują się w płynie o większej objętości: jest to zarówno płyn otaczający porowate ziarna , jak i wypełniający znajdujące się w nich kanaliki. Natomiast cząsteczki większe występują tylko w płynie otaczającym ziarna, co sprawia, że przemieszczają się przez kolumnę szybciej i wypływają jako pierwsze.

Między względną objętością elucyjną białka (V_e/V_o, gdzie V_e oznacza objętość elucyjną danego białka, a V_o - objętość swobodną kolumny, czyli objętość rozpuszczalnika wypełniającego przestrzeń między ziarnami; rys 1b) a logarytmem jego masy cząsteczkowej występuje zależność liniowa(rys 1c). Stosując zatem białka o znanej masie cząsteczkowej, dla danej kolumny można wykreślić krzywą wzorcową przedstawiającą zależność V_e/V_o od log₁₀ masy cząsteczkowej. Znając objętość elucyjną białka można wyznaczyć jego masę cząsteczkową przez odczytanie jej wartości z krzywej wzorcowej(rys.1c).

6. elektroforeza żelowa SDS (SDS-PAGE)

Elektroforeza - poruszanie się cząsteczek obdarzonych ładunkiem w polu elektrycznym w kierunku jednej z elektrod.

W SDS-PAGE białka są denaturowane i otaczane ładunkem ujemnym [co jest wynikiem ich wiązania z cząsteczkami dodecylosiarczanu sodu (SDS)]. Najpierw białka poddaje się działaniu czynnika redukującego, takiego jak β-merkaptoetanol, w celu usunięcia wszystkich wiązań disiarczkowych. Następnie stosuje się silny detergent anionowy SDS, który zrywa prawie wszystkie wiązania niekowalencyjne, co prowadzi do rozfałdowania łańcucha polipeptydowego. Tym sposobem denaturowane białko wykazuje wypadkowy ładunek ujemny, proporcjonalny do jego masy cząsteczkowej (1 cząsteczka SDS, wiążąca się ze szkieletem polipept. dzięki hydrofobowemu łańcuchowi alifatycznemu, przypada na ok. 2 aminokw.)

Mieszaninę białko/SDS nakłada się do kieszonek w górnej części żelu poliakryloamidowego. Kierunek elektroforezy przebiega od góry do dołu (elektroforeza przebiega na pionowo ustawionych płytkach z żelem).Po przeprowadzeniu elektroforezy żel jest usuwany, a białka uwidoczniane, np srebrem lub barwnikiem typu błękit Coomassiego, pojawia się wówczas seria prążków. Białka o małej masie cząsteczkowej pokonują w żelu najdłuższą drogę, natomiast duże poruszają się znacznie wolniej, ponieważ są zatrzymywane przez wiązania poprzeczne w żelu i pozostają blisko jego górnej części. W tych warunkach ruchliwość większości łańcuchów polipeptydowych zależy liniowo od logarytmu ich masy. Dlatego masę cząsteczkową nieznanego białka można wyznaczyć przeprowadzając jego elektroforezę w obecności białek o znanej masie cząsteczkowej.

7. metoda wirowania w różnych gradientach stężeń

60-20% roztwór sacharozy

6M roztwór chlorku cezu sam tworzy gradient

Białka wzorcowe i te nieznane są nawarstwiane na gradient stężeń zbuforowanej sacharozy. Roztwór sacharozy jest najbardziej stężony przy dnie probówki. Podczas wirowania różne białka przemieszczają się w dół probówki do pozycji równowagowej, w której ich gęstość jest równa gęstości sacharozy z tej warstwy. Wirowanie kończy się, zanim najszybciej sedymentujące białko osiągnie dno probówki. Rozdzielone warstwy można zebrać tworząc otwór w dnie probówki i następnie zbierając wyciekające krople do probówek. Następnie określa się ruchliwość nieznanego białka, wyrażoną w odniesieniu do standardów o znanych masach cząsteczkowych i określa się jego masę cząsteczkową.

Są to metody porównawcze naszego białka z białkiem stanowiącym wzorzec standardowy.

Zestaw 78

1. Enzymy metabolizujące leki.

- Pojęcie metabolizmu leku obejmuje wchłanianie, dystrybucję, biotransformację i wydalanie.

- Biotransformacja to zespół przemian biochemicznych, którym lek ulega w organizmie pod wpływem endogennych enzymów. Przemiany te prowadzą do wzrostu polarności metabolizowanego związku, co na ogół ma na celu jego szybkie inaktywowanie i wydalenie z organizmu. Reakcje biotransformacji zostały podzielone na procesy

I fazy ( utlenianie, redukcja, hydroliza) - mają na celu zmianę struktury chemicznej związku w taki sposób, aby mogły zajść reakcje II fazy tzn. prowadzą do wytworzenia grup funkcyjnych, umożliwiających lub ułatwiających procesy sprzęgania. Procesy te prowadza do przekształcenia związków litofilnych, które bardzo wolno są wydalane z organizmu, ze względu na wchłanianie zwrotne w cewkach nerkowych - na związki bardziej hydrofilowe, usuwane łatwiej z organizmu.

i II fazy(sprzęganie z kwasem glukuronowym, siarczanem, aminokwasami, glutationem, reakcje acetylacji i alkilacji) - prowadzą one do wzrostu polarności związku, co umożliwia jego wydalenie z ustroju.

- Enzymy, które metabolizują leki biorą udział w procesie biotransformacji, zarówno w reakcjach I, jak i II fazy.

- Enzymy, biorące udział w reakcjach I fazy:

1. enzymy układu monooksygenaz (oksydazy o mieszanej funkcji)

a) zlokalizowane w błonach siateczki śródplazmatycznej (przede wszystkim komórek wątroby)

b) biorą udział w utlenianiu związków endogennych (sterydów, aminokw., kw. tłuszcz., prostaglandyn, kw. żółciowych, poch. wit. D₃) oraz egzogennych (ksenobiotyków)

c) katalizuje reakcję: NADPH + H⁺ + O₂ + RH
NADP⁺ + H₂O + ROH

RH - substrat utleniany ; ROH - hydroksylowany metabolit substratu

4. wykorzystuje 2 systemy transportu elektronów:

• I - system transportu elektronów zależny od NADPH + H⁺ jako dawcy elektronów

• II - system transportu elektronów zależny od NADH + H⁺ jako dawcy elektronów

NADPH + H⁺ - - - - -> Oksydoreduktaza - - - - - --> Cytochrom P-450 RH

NADPH: Cyt.P-450 ↑ O₂+2H⁺

| ROH

Fosfolipidy | Kw. nas.

NADH + H⁺
- - - - - -> Oksydoreduktaza - - - - - - -> Cyt.b₅ - - - - - -> Desaturaza

NADH:cyt. b₅ kwasów tłuszcz. Kw nienas.

• 
  
  
  I system transportu elektronów składa się z oksydoreduktazy NADPH:cytochrom P-450 i cytochromu P-450. Białka te są zanurzone w fosfolipidach błonowych (głównie w fosfatydylocholinie - tworzy ona hydrofobowe środowisko, umożliwiające utworzenie funkcjonalnego kompleksu oksydoreduktazy z cytochromem P-450 oraz ułatwia dotarcie i przyłączenie litofilnych substratów do cyt.P-450).

1. Oksydoreduktaza NADPH:cytochrom P-450

-flawoproteina zawierająca 1 cząsteczkę FAD i 1 cząsteczkę FMN.

- przenosi elektrony z NADPH + H⁺ na cytochrom P-450

- FAD pełni rolę akceptora elektronów z NADPH + H⁺

- FMN pełni rolę donora elektronów na cytochrom P-450

Atom Fe cytochromu P-450 przyjmuje jednorazowo tylko 1 elektron przekazywany przez flawoproteinę z NADPH + H⁺ .

2. Cytochrom P-450

- końcowa oksydaza systemu transportu elektronów zależnego od NADPH

- bierze bezpośredni udział w wiązaniu substratu, wiązaniu cząsteczki O₂ oraz w inkorporacji atomu tlenu do substratu. Drugi atom tlenu jest zużywany o tworzenia wody. Energia uzyskana podczas syntezy wody umożliwia wprowadzenie atomu tlenu do cząsteczki substratu.

- w specyficznych warunkach katalizuje tworzenie anionów nadtlenkowych oraz wolnych rodników tlenowych, będących inicjatorami peroksydacji lipidów lub oksydacyjnej degradacji hemu.

- może wykazywać właściwości:

a) monooksygenazy: RH + NADPH + H⁺ + O₂ - - - -> ROH + NADP⁺ + H₂O

b) oksydazy : NADPH + H⁺ + O₂ - - - -> NADP⁺ + H₂O₂, np. przy niedoborze substratu, na skutek mutacji punktowej, która zmienia 1 aminokw. W centrum aktywnym cytochromu.

c) peroksydazy: RH + XOOH - - - -> ROH + XOH XOOH - cykliczny nadtlenek

przy nieobecności tlenu, reduktazy i NADPH

- jego nazwa pochodzi od tego, że zredukowana forma tej hemoproteiny tworzy kompleks z CO, który wykazuje max. absorbancji przy dł. fali 450 nm.

- zbudowany z 6 podjednostek, z których każda zawiera 1 cząsteczkę żelazoporfiryny III i 3 reszty węglowodanowe. Hem jest niekowalencyjnie związany z apoproteiną. 4 wiazania koordynacyjne Fe hemowego są wysycane przez atomy azotu pierścieni pirogowych porfiryny, piąte łączy się z atomem siarki cysteiny, a szóste jest wysycane przez pierścień imidazolowy histydyny. Ligand imidazolowy jest najsłabiej związany z Fe hemowym i może być zastąpiony przez CO. Cząsteczka tlenu przyłącza się pomiędzy Fe hemowym, a ligandem siarkowym. Pozycja ta pozwala cząsteczce tlenu korzystać z elektronów zarówno atomu Fe, jak i siarki.

- Mechanizm działania :

I. Utl. forma cytochromu P-450 ( Fe³⁺) reaguje odwracalnie z cząsteczką substratu, tworząc kompleks cytochrom P-450 - substrat.

II. Powstały kompleks ulega jednoelektrodowej redukcji przy udziale oksydoreduktazy NADPH: cytochrom P-450.

III Do zredukowanego kompleksu przyłącza się cząsteczka tlenu, tworząc potrójny kompleks „oksytocytochrom” P-450 - lek.

4. Następuje przeniesienie elektronu z Fe²⁺ na cząsteczkę tlenu przekształcając ją w rodnik ponadtlenkowy (rodnik ten może oddysocjować od kompleksu i w wyniku dysmutacji przekształcić się w H₂O₂ - przy niedostatecznym wysyceniu układu tlenem).

V. Powstały w ten sposób kompleks ulega powtórnej redukcji. Elektron może pochodzić z oksydoreduktazy NADPH:cytochrom P-450 lub z cytochromu b₅. Z powstałego „peroksycytochromu” może uwolnić się jon nadtlenkowy, który po protonacji przekształca się w nadtlenek wodoru.

VI. Jon nadtlenkowy ulega dysocjacji na tlen atomowy oraz jon tlenkowy, który po protonacji tworzy cząsteczkę wody. Drugi atom tlenu tzw. „aktywny tlen” zostaje połaczony z cytochromem P-450.

VII. Powstaje wolny rodnik substratu i reaktywna forma tlenu.

VIII. „Aktywny atom tlenu” zostaje przeniesiony na cząsteczkę substratu (między C a H)

IX. Kompleks utlenionej formy cytochromu P-450 z utlenionym substratem ulega spontanicznemu rozpadowi a utleniona forma cytochromu P-450 może wejść do następnego cyklu reakcji.

• Oprócz różnorodnych funkcji katabolicznych bierze udział w syntezie sterydów w nadnerczach, w

biosyntezie kwasów żółciowych i wit. D₃ w wątrobie oraz w degradacji hemu. W nadnerczach cytochrom P-450 występuje w błonie mitochondrialnej. Bezpośrednim donorem elektronów dla mitochondrialnego cytochromu P-450 jest białko żelazosiarkowe - adrenodoksyna, która ulega redukcji przez reduktazę NADPH:adrenodoksyna. Reduktaza NADPH: adrenodoksyna jest flawoproteiną zawierającą FAD. Transport odbywa się następująco:

NADPH + H⁺ ---->reduktaza NADPH:adrenodoksyna -----> adrenodoksyna ---->cytochrom P-450

Adrenodoksyna przekazuje na cyt. P-450 obydwa elektrony (w 2 etapach).

Układ mitochondrialnej monooksygenazy współdziała z 2 hydroksylazami. Pierwsza atakuje specyficznie cholesterol i odszczepia jego łańcuch boczny, natomiast druga hydroksyluje pozycję 11β w pierścieniu.

W błonie jądrowej zawarty jest także układ monooksygenazy analogiczny do zawartego w błonach siateczki śródplazmatycznej, co stwarza niebezpieczeństwo interakcji pomiędzy kwasami nukleinowymi a powstającymi aktywnymi metabolitrami, np. epoksydami i może prowadzić do efektów toksycznych i genotoksycznych (może powodować mutacje)

• Ogromna różnorodność substratów i typów reakcji katalizowanych przez cytochrom P-450 możliwa jest

dzięki występowaniu wielu form molekularnych cytochromu P-450 o różnych, chociaż nakładających się specyficznościach substratowych. U człowieka wyizolowano ponad 100 różnych izoenzymów cytochromu P-450. Kazda forma molekularna cytochromu P-450 jest produktem innego genu. Izoenzymy cytochromu P-450 różnią się :

1. składem aminokwasowym

2. podatnością na indukcję przez różne induktory

3. wrażliwością na działanie inhibitorów

4. specyficznością substratową

5. względną masą cząsteczkową w zakresie 47000 - 56000

6. maksimum absorbancji zredukowanego kompleksu z CO w zakresie od 447 do 452

7. właściwościami elektroforetycznymi i immunochemicznymi

Formy te wykazują również specyficzność narządową, gatunkową oraz zależność od płci i wieku.

Nomenklatura cytochromów jest oparta na podobieństwach sekwencji aminokwasowejposzczególnych form molekularnych:

1. cytochromy należące do 1 rodziny posiadają co najmniej 40% sekwencji aminokwasów podobnych. Rodziny oznacza się cyframi arabskimi: 1,2,3,...

2. w obrębie podrodziny istnieje co najmniej 55-60% analogicznych sekwencji. Podrodziny oznakowano kolejnymi dużymi literami alfabetu: A,B,C, ...

3. Formy molekularne w obrębie tej samej podrodziny oznacza się np. 1A1, 1A2

Najwięcej leków i najczęściej metabolizującym leki enzymem jest cytochrom 3A4.

Rozmieszczenie wewnątrzbłonowe układu monooksygenaz:

Oksydoreduktaza NADPH: cytochrom P-450 składa się z części hydrofobowej zanurzonej w błonie retikulum oraz z aktywnej katalitycznie części hydrofilowej wystającej ponad powierzchnię błony. Część hydrofobowa związana jest ściśle z fosfolipidami (głównie z fosfatydylocholiną) błony. Cytochrom P-450 jest głęboko zanurzony w błonie lecz jego części wystają na zewnątrz zarówno od strony cytoplazmatycznej jak i światła kanalika siateczki endoplazmatycznej. Cytochrom P-450 jest również otoczony przez lipidy błony. Jest on zakotwiczony w błonie za pomocą 2 transmembranowych pętli. Miejsce wiązania substratu znajduje się od strony błony retikularnej, natomiast hem jest ułożony równolegle do powierzchni błony.

Liczba cząsteczek cytochromu P-450 jest znacznie wyższa niż liczba cząsteczek oksydoreduktazy NADPH:cytochrom P-450. Każda cząsteczka tej flawoproteiny otoczona jest przez kilka cząsteczek cytochromu P-450, z którymi może bezposrednio reagować. W błonie siateczki śródplazmatycznej zanurzone są również cząsteczki cytochromu P-450, które nie mają bezpośredniego kontaktu z oksydoreduktazą.

System monooksygenaz katalizuje różne reakcje w zależności od substratu i pozycji w cząsteczce, do której przyłączany jest atom tlenu. Jeśli tlen włączamy:

• Do wiązania węgiel-wodór, zachodzi reakcja hydroksylacji

• Do podwójnego wiązania węgiel-węgiel, zachodzi epoksydacja substratu

• Przy węglu grupy alkilowej przylegającej do heteroatomu (N, O, S), zachodzi N-, O-, S-dealkilacja substratu:

R-NH-CH₃ - - -> [R-NH-CH₂OH] ---> R-NH₂ + HCOH

N-dealkilacja

• Zamiast grupy NH₂, zachodzi oksydacyjna dezaminacja

OH O

| ||

R - CH - CH₃ → R - C - CH₃ → R - C - CH₃ + NH₃

| |

NH₂ NH₂

• Zamiast S, zachodzi desulfurylacja lub utleniane atomu S (reakcje S - oksydacji)

O

||

R₁ - S - R₂ - - - -> R₁ - S - R₂

• Zamiast NO₂ - denitryfikacja

• Utlenianie atomu azotu (reakcje N-oksydacji)

• II system transportu elektronów składa się z oksydoreduktazy NADH:cytochrom b₅, cytochromu b₅ i czynnika wrażliwego na cyjanki (desaturazy tw. tłuszcz.)

• Oksydoreduktaza NADH:cytochrom b₅ :

- flawoproteina zawierająca FAD jako grupę prostetyczną

- jej zadaniem jest przenoszenie elektronów z NADH na cytochrom b₅

B) Cytochrom b₅:

- białko zawierające jako grupę prostetyczną żelazoporfirynę III.

- przenosi elektrony na desaturazę kw. tłuszcz.

- może być też donorem elektronów dla cyklicznych reakcji z udziałem cytochromu P-450

C) Desaturaza kw. tłuszczowych

- białko zawierające niehemowo związane Fe, które ma zdolność pobierania elektronów ze zredukowanego cytochromu b₅

- katalizuje desaturację kw. tłuszcz.

- jest wrażliwa na jony cyjankowe

* Reakcje redukcji I fazy są katalizowane przez reduktazy znajdujące się w cytozolu kom. wątroby i nerek.

Natomiast reakcje hydrolizy są katalizowane przez hydrolazy w cytozolu kom. jak i przez hydrolizy znajdujące się w lizosomach i osoczu krwi.

2. Inne enzymy metabolizujące leki (reakcje I fazy):

- dehydrogenaza alkoholowa

- dehydrogenaza aldehydowa

- oksydaza ksantynowa

- oksydaza aminowa (monoaminooksydaza, diamionooksydaza)

- oksydaza alkilohydrazynowa

- aromatazy

- monooksygenazy flawinowe

- Enzymy biorące udział w reakcjach II fazy:

1. Sprzęganie z kwasem glukuronowym katalizuje UDP- glukuronylotransferaza:

- występuje we frakcji mikrosomalnej

- przenosi kwas UDP-glukuronowy na odpowiedni substrat

- substratami dla tego enzymu są związki endogenne (bilirubina, sterydy, serotonina) lub egzogenne (ksenobiotyki)

- reakcji tej podlegają związki zawierające grupę OH, COOH, NH₂, NH, SH

- w reakcji uczestniczy aktywna forma kwasu glukuronowego, która powstaje w wyniku utlenienia UDP-glukozy pod wpływem dehydrogenazy UDP-glukozy w obecności NAD.

- zachodzi głównie w wątrobie, ale też w jelicie cienkim, płucach, nerkach

2. Sprzęganie z kwasem siarkowym katalizuje sulfotransferaza

- występuje w cytozolu

- przenosi resztę kwasu siarkowego z aktywnego siarczanu (PAPS) na substraty zawierające grupę OH lub NH₂ ( są to związki alifatyczne, aromatyczne z grupą OH lub aminy aromatyczne, mogą to być także związki endogenne - sterydy, cholina, adrenalina, heparyna, kw. chondroitynosiarkowy)

*synteza aktywnego siarczanu zachodzi w 2 etapach:

a) z ATP i kw. siarkowego, pod wpływem adenylilotransferazy siarczanowej, tworzy się kwas adenylosiarkowy

b) utworzony kwas pod działaniem kinazy adenylulosiarczanowej i ATP tworzy aktywny siarczan (PAPS)

3. Reakcje acetylacji katalizuje acetylotransferaza

- przenosi grupę acetylową z acetylo-CoA na odpowiedni akceptor - zawierający gr. NH₂, OH, SH (sulfonamidy, aminy, poch. hydrazyny, aminokwasy, aminocukry, cholina, histamina, spermina, spermidyna.

4. Reakcje alkilacji (N-, O-, S-alkilacja) są katalizowane przez odpowiednie metylotransferazy(najczęściej zachodzącą reakcją jest metylacja).

- następuje przeniesienie grupy metylowej, która pochodzi z S-adenozylometioniny na akceptor.

5. Sprzęganie aminokwasami (glicyna, seryna, tauryna)

- ulegają tej reakcji kwasy aromatyczne , niektóre alifatyczne. Przed sprzęganiem związki te ulegają aktywacji, podobnie jak kwasy tłuszczowe,

- u człowieka dominuje sprzęganie z glicyną. Układy enzymatyczne biorące udział w tym procesie znajdują się w wątrobie i nerkach. Ich substratem może być kw. benzoesowy, fenylooctowy, cholowy, indolooctowy.

6. Sprzęganie z glutationem jest katalizowane przez S-transferazę glutationową

- występuje ona w cytozolu kom. wątroby, nerek, jelit, płuc, niewielkie jej ilości mogą występować w mikrosomach

- reakcja ta ma znaczenie w detoksykacji silnie mutagennych, elektrofilowych związków: epoksydów, aromatycznych chloro-, nitrozwiązków.

- Pochodne glutationowe ksenobiotyków są przekształcane w kwasy merkapturowe i wydalane z moczem lub żółcią

- III faza biotansformacji leków. Tą nazwą określa się dalszy metabolizm pochodnych glutationowych ksenobiotyków( kwasów merkapturowych lub połączeń z cysteiną). Związki te są wydzielane z żółcią do jelita, gdzie pod wpływem liazy C-S, przekształcają się w pochodne sulfhydrylowe, które po metylacji ponownie przechodzą do wątroby. Tam są utleniane do metylotiozwiązków i wydalane. Takim przemianom ulega np.kofeina.

2. Biosynteza kwasów tłuszczowych - lokalizacja, przebieg.

- synteza palmitynianu z acetylo-CoA zachodzi w cytozolu

- elongacja łańcucha kwasu tłuszczowego zachodzi w siateczce śródplazmatycznej kom. wątroby

- synteza nienasyconych kwasów tłuszcz. zachodzi w siateczce śródplazmatycznej

- przebieg:

1) transport acetylo-CoA z mitochondriów do cytozolu: acetylo-CoA kondensuje ze szczawiooctanem do cytrynianu pod wpływem syntazy cytrynianowej. Potem następuje translokacja cytrynianu za pośrednictwem transportera trikarbosylanów(na wymianę z jabłczanem) na zewnątrz mitochondriów, gdzie ulega rozszczepieniu do acetylo-CoA i szczawiooctanu, w reakcji katalizowanej przez liazę ATP-cytrynianową. Szczawiooctanmoże tworzyc jabłczan pod wpływem działania NADH-zaleznej dehydrogenazy jabłczanowej, po czym następuje generacja NADPH pod wpływem enzymu jabłczanowego. Inną alternatywą dla jabłczanu jest transport do mitochondriów.

2) synteza malonylo-CoA: zachodzi w procesie karboksylacji acetylo-CoA w obecności ATP, HCO₃^-(jako źródło CO₂) i karboksylazy acetylo-CoA (biotyna jest niezbędna do działania tego enzymu). Enzym ten ma zmienną liczbę identycznych podjednostek, w każdej występuje: biotyna, karboksylaza biotyny, białko nośnikowe karboksybiotyny,, transkarboksylaza, allosteryczne miejsce regulatorowe. Reakcja zachodzi w 2 etapach: a) karboksylacja biotyny(z udziałem ATP); b) przeniesienie karboksylu na acetylo-CoA z utworzeniem malonylo-CoA

3) reakcje katalizowane przez syntazę kwasu tłuszczowego. Występują 2 typy tego enzymu: u bakterii, roślin, niższych form poszczególne enzymy układu występują oddzielnie, a reszty acylowe występują w połączeniu z białkiem przenoszącym acyl (ACP). U ssaków, ptaków, drożdży układ syntazy jest kompleksem wieloenzymowym, a ACP jest częścią tego kompleksu. Połączenie enzymów określonego szlaku w 1 funkcjonalną jednostkę sprawia, że szlak jest bardziej wydajny i wolny od wpływu innych procesów współzawodniczących o substrat. Ponadto wszystkie enzymy kompleksu są syntetyzowane w sposób skoordynowany, gdyż jest on kodowany przez pojedynczy gen.

ACP zawiera kwas pantotenowy w formie 4'-fosfopantoteiny; w układzie syntazy przejmuje rolę CoA

U ssaków kompleks syntazy jest dimerem, w którym obydwa monomery są identyczne i zawierają wszystkie 7 aktywności enzymatycznych syntazy kw.tłuszcz. oraz ACP. 2 monomery leżą w stosunku do siebie w konfiguracji „głowa do ogona”; w bezpośrednim sąsiedztwie gr.SH fosfopantoteiny ACP leży gr.SH reszty cysteiny syntazy 3-ketoacylowej drugiego monomeru. Jedynie cały dimer jest aktywny.

a) acetylo-CoA łączy się z grupą SH cysteiny, co jest katalizowane przez transacylazę acetylową;

malonylo-CoA łączy się z sąsiadującą gr.SH 4'-fosfopantoteiny, należącą do ACP drugiego monomeru, co jest katalizowane przez transacylazę malonylową i wytwarza się acetylo(acylo)malonyloenzym.

b) grupa acetylowa atakuje grupę metylenową reszty malonylowej w reakcji katalizowanej przez syntazę 3-ketoacylową i uwalnia CO₂, tworząc 3-ketoacyloenzym(acetoacetyloenzym). To uwalnia gr.SH cysteiny. Dekarboksylacja pozwala na zajście reakcji do końca.

c) powstała gr. 3-ketoacylowa zostaje zredukowana pod wpływem reduktazy 3-ketoacylowej, przy udziale NADPH+H⁺, powstaje 3-hydroksyacylo-enzym

d) 3-hydroksyacyloenzym zostaje odwodniony pod wpływem hydratazy, powstaje 2,3-nienasycony acylo-enzym

e) powstały powyżej związek ulega redukcji pod wpływem reduktazy enoilowej, przy udziale NADPH+H⁺ i tworzy się acylo-enzym.

Nowa cząsteczka malonylo-CoA łączy się z gr.SH 4'-fosfopantoteiny, wypierając nasyconą resztę acylową na wolną gr.SH cysteiny. Powyższa sekwencja reakcji powtarza się 6 razy, aż do powstania 16-węglowego (palmitylowego) rodnika.

f) rodnik palmitynowy jest uwalniany z kompleksu enzymatycznego przy udziale tioesterazy(deacylazy). Wolny palmitynian musi zostać zaktywowany do acylo-CoA, zanim będzie mógł wejść do innego szlaku metabolicznego. Najczęściej jest to estryfikacja do acylogliceroli * W gruczole sutkowym istnieje oddzielna tioesteraza, swoista dla reszt acylowych C₈, C₁₀, C₁₂, które następnie znajdują się w tłuszczu mleka.

Istnieją 2 centra aktywności w kompleksie dimerycznym, które działają niezależnie, tworząc jednocześnie 2 cząsteczki palmitynianu.

- Równanie sumaryczne całkowitej syntezy palmitynianu:

CH₃CO-S-CoA + 7HOOC-CH₂CO-S-CoA + 14NADPH + 14H⁺ → CH₃(CH₂)₁₄COOH + 7CO₂ + 6H₂O + 8CoA-SH + 14NADP⁺

Z acetylo-CoA tworzą się atomy C 15 i 16 palmitynianu. Dodawanie następnych reszt 2-węglowych poprzedza tworzenie malonylo-CoA. W wątrobie i gruczole sutkowym jako cząsteczka inicjująca może działać butyrylo-CoA. Jeżeli propionylo-CoA działa jako cząsteczka inicjująca powstają kwasy tłuszczowe o nieparzystej liczbie at.C.

- Źródła NADPH dla lipogenezy:

a) szlak pentozofosforanowy

b) reakcja przekształcająca jabłczan w pirogronian, katalizowana przez „enzym jabłczanowy” (dehydrogenazę jabłczanową dekarboksylującą).

c) pozamitochondrialna reakcja dehydrogenazy izocytrynianowej.

• Elongacja kwasów tłuszczowych

- przekształca CoA-pochodne kw.tłuszcz. w poch. acylowe mające o 2 at.C więcej, przy uzyciu malonylo-CoA i NADPH

- grupami acylowymi działającymi jako cząsteczki inicjujące są nas. kw. tłuszcz. od C₁₀ wzwyż, jak i nienasycone kw. tłuszcz.

- reakcję katalizuje układ enzymów nazywany elongazą kwasu tłuszczowego:

a) acylo-CoA + malonylo-CoA pod wpływem syntazy 3-ketoacylowej tworzą 3-ketoacylo-CoA

b) 3-ketoacylo-CoA pod wpływem reduktazy 3-ketoacylo-CoA, przy użyciu NADPH+H⁺ tworzy 3-hydroksyacylo-CoA

c) 3-hydroksyacylo-CoA pod wpływem hydratazy ulega odwodnieniu i tworzy 2,3-nienasycony acylo-CoA

d) 2,3-nienasycony acylo-CoA pod wpływem reduktazy 2,3-nienasyconych acylo-CoA i NADPH+H⁺ tworzy acylo-CoA o 2 at. C dłuższy od wyjściowego związku.

• Synteza nienasyconych kwasów tłuszczowych

- następuje z odpowiednich nasyconych kwasów tłuszcz.

- pierwsze wiązanie podwójne jest wprowadzane prawie zawsze w poz. ∆⁹

- jest katalizowana przez układ enzymatyczny ∆⁹-desaturaza, z udziałem NADH:

1. Oksydoreduktaza NADH:cytochrom b₅ :

- flawoproteina zawierająca FAD jako grupę prostetyczną

- jej zadaniem jest przenoszenie elektronów z NADH na cytochrom b₅

B) Cytochrom b₅:

- białko zawierające jako grupę prostetyczną żelazoporfirynę III

- przenosi elektrony na desaturazę kw. tłuszcz.

- może być też donorem elektronów dla cyklicznych reakcji z udziałem cytochromu P-450

C) Desaturaza kw. tłuszczowych

- białko zawierające niehemowo związane Fe, które ma zdolność pobierania elektronów ze zredukowanego cytochromu b₅

- katalizuje desaturację kw. tłuszcz.

- jest wrażliwa na jony cyjankowe

- zredukowana forma Fe (Fe²⁺) pozwala na interakcje z tlenem i nasyconymi łańcuchami acylo-CoA, stanowiącymi substraty reakcji. Podczas tworzenia wiązania podwójnego uwalniane są 2 cząsteczki wody. 2 elektrony pochodzą z NADH, 2 z pojedynczego wiązania substratu.

- zwierzęta nie mogą syntetyzować kwasu linolowego ani linolenowego, więc należy te kwasy dostarczać z pożywieniem. Służą one do syntezy innych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, należących do rodziny ω6 i ω3, np. kwasu arachidonowego.

3. Fragmenty Okazaki

- Powstają podczas replikacji

- 2 nici w helisie DNA są antyrównoległe względem siebie. Jedna nić biegnie w kierunku 5'→3', a nić do niej komplementarna w kierunku odwrotnym. W widełkach replikacyjnych dochodzi do rozplecenia helisy DNA i nowe cząsteczki DNA powstają na każdej z jednoniciowych matryc. Widełki replikacyjne składają się z 4 komponentów: 1)helikazy DNA, która rozplata krótki fragment macierzystego DNA; 2)primazy, która zapoczątkowuje biosyntezę cząsteczki RNA niezbędnej do biosyntezy DNA; 3) polimerazy DNA, która zapoczątkowuje biosyntezę nowego siostrzanego pasma; 4)białka SSB, wiążące jednoniciowy DNA, zapobiegające przedwczesnemu zwinięciu się dna w podwójną helisę.

- Polimerazy DNA syntetyzują DNA zawsze w kierunku 5'→3'. Dlatego też w widełkach replikacyjnych na nici matrycowej o orientacji 3'→5' potomny DNA jest syntetyzowany w postaci ciągłej nici w kierunku 5'→3'; nić syntetyzowana w taki sposób nazywa się nicią wiodącą. Na drugiej nici matrycowej, mającej orientację 5'→3', polimeraza DNA syntetyzuje krótkie odcinki nowego DNA(o dł. ok. 1000 nukleotydów) w kierunku 5'→3' nazywane fragmentami Okazaki.; odcinki te następnie ulegają połączeniu (z udziałem ligazy DNA) w jedną całość. Nić Dna syntetyzowana w ten nieciągły sposób nazywa się nicią opóźnioną.

- Polimeraza DNA nie może zacząć syntezy DNA bez startera. Nawet każdy fragment Okazaki, do inicjacji swej syntezy wymaga startera, stanowiącego krótki odcinek RNA(o dł. ok. 5 nukleotydów). Startery są syntetyzowane przez polimerazę RNA, nazywaną prymazą. Prymaza może może syntetyzować RNA bezpośrednio na jednoniciowej matrycy DNA, bez obecności startera. Starter RNA ulega wydłużaniu przez polimerazę DNA III, która katalizuje syntezę nici wiodącej i opóźnionej. Proces zapoczątkowania wydłużania startera obejmuje nukleofilowy atak grupy 3'-hydroksylowej primera RNA na fosforan pierwszego wchodzącego trifosforanu deoksynukleozydu z odszczepieniem pirofosforanu. Grupa 3'-hydroksylowa świeżo przyłączonego monofosforanu deoksyrybonukleozydu staje się dostępna do przeprowadzenia kolejnego ataku nukleofilowego.Wybór odpowiedniego deoksyrybonukleotydu, którego terminalna gr. 3'-OH będzie podlegała atakowi, zależy od odpowiedniego parowania z siostrzanym pasmem cząsteczki DNA. Potem polimeraza DNA I, wykorzystuje swoją aktywność egzonukleazową 5'→3', usuwa starter, a powstałą lukę uzupełnia nowym DNA. W kolejnym etapie kompletne fragmenty DNA zostają połączone przez ligazę DNA.

Helikaza towarzyszy primazie, aby zapewnić jej odpowiedni dostęp do matrycy, co pozwala na wytworzenie primeru RNA na nici opóźnionej i potem rozpoczęcie replikacji przez polimerazę. Ruchliwy kompleks złożony z primazy i helikazy nosi nazwę primosomu.

Powyższy schemat syntezy fragmentów Okazaki występuje u Procaryota. Jednakże u Eucaryota ogólny schemat replikacji jest taki sam. Różnice: polimeraza DNA α katalizuje syntezę nici opóźnionej poprzez fragmenty Okazaki, natomiast polimeraza DNA δ syntetyzuje nic wiodącą. Startery konieczne do inicjacji syntezy DNA są tworzone przez polimerazę DNA α, w skład której wchodzi podjednostka o aktywności primazy. Nowo syntetyzowana nić opóźniona podlega korekcie dokonywanej przez odrębne białko pomocnicze, bo polimeraza DNA α nie ma aktywności egzonukleazowej.

Zestaw 79

1. Cytochrom P-450 - formy molekularne, zasady klasyfikacji.

Cytochrom P-450

- jeden z głównych enzymów biorących udział w metabolizmie leków (w reakcjach I fazy)

- końcowa oksydaza systemu transportu elektronów zależnego od NADPH

- bierze bezpośredni udział w wiązaniu substratu, wiązaniu cząsteczki O₂ oraz w inkorporacji atomu tlenu do substratu. Drugi atom tlenu jest zużywany o tworzenia wody. Energia uzyskana podczas syntezy wody umożliwia wprowadzenie atomu tlenu do cząsteczki substratu.

- w specyficznych warunkach katalizuje tworzenie anionów nadtlenkowych oraz wolnych rodników tlenowych, będących inicjatorami peroksydacji lipidów lub oksydacyjnej degradacji hemu.

- może wykazywać właściwości:

a) monooksygenazy: RH + NADPH + H⁺ + O₂ - - - -> ROH + NADP⁺ + H₂O

b) oksydazy : NADPH + H⁺ + O₂ - - - -> NADP⁺ + H₂O₂, np. przy niedoborze substratu, na skutek mutacji punktowej, która zmienia 1 aminokw. W centrum aktywnym cytochromu.

c) peroksydazy: RH + XOOH - - - -> ROH + XOH XOOH - cykliczny nadtlenek

przy nieobecności tlenu, reduktazy i NADPH

- jego nazwa pochodzi od tego, że zredukowana forma tej hemoproteiny tworzy kompleks z CO, który wykazuje max. absorbancji przy dł. fali 450 nm.

- zbudowany z 6 podjednostek, z których każda zawiera 1 cząsteczkę żelazoporfiryny III i 3 reszty węglowodanowe. Hem jest niekowalencyjnie związany z apoproteiną. 4 wiazania koordynacyjne Fe hemowego są wysycane przez atomy azotu pierścieni pirogowych porfiryny, piąte łączy się z atomem siarki cysteiny, a szóste jest wysycane przez pierścień imidazolowy histydyny. Ligand imidazolowy jest najsłabiej związany z Fe hemowym i może być zastąpiony przez CO. Cząsteczka tlenu przyłącza się pomiędzy Fe hemowym, a ligandem siarkowym. Pozycja ta pozwala cząsteczce tlenu korzystać z elektronów zarówno atomu Fe, jak i siarki.

- Mechanizm działania :

I. Utl. forma cytochromu P-450 ( Fe³⁺) reaguje odwracalnie z cząsteczką substratu, tworząc kompleks cytochrom P-450 - substrat.

II. Powstały kompleks ulega jednoelektrodowej redukcji przy udziale oksydoreduktazy NADPH: cytochrom P-450.

III Do zredukowanego kompleksu przyłącza się cząsteczka tlenu, tworząc potrójny kompleks „oksytocytochrom” P-450 - lek.

IV.Następuje przeniesienie elektronu z Fe²⁺ na cząsteczkę tlenu przekształcając ją w rodnik ponadtlenkowy (rodnik ten może oddysocjować od kompleksu i w wyniku dysmutacji przekształcić się w H₂O₂ - przy niedostatecznym wysyceniu układu tlenem).

V. Powstały w ten sposób kompleks ulega powtórnej redukcji. Elektron może pochodzić z oksydoreduktazy NADPH:cytochrom P-450 lub z cytochromu b₅. Z powstałego „peroksycytochromu” może uwolnić się jon nadtlenkowy, który po protonacji przekształca się w nadtlenek wodoru.

VI. Jon nadtlenkowy ulega dysocjacji na tlen atomowy oraz jon tlenkowy, który po protonacji tworzy cząsteczkę wody. Drugi atom tlenu tzw. „aktywny tlen” zostaje połaczony z cytochromem P-450.

VII. Powstaje wolny rodnik substratu i reaktywna forma tlenu.

VIII. „Aktywny atom tlenu” zostaje przeniesiony na cząsteczkę substratu (między C a H)

IX. Kompleks utlenionej formy cytochromu P-450 z utlenionym substratem ulega spontanicznemu rozpadowi a utleniona forma cytochromu P-450 może wejść do następnego cyklu reakcji.

• Oprócz różnorodnych funkcji katabolicznych bierze udział w syntezie sterydów w nadnerczach, w

biosyntezie kwasów żółciowych i wit. D₃ w wątrobie oraz w degradacji hemu. W nadnerczach cytochrom P-450 występuje w błonie mitochondrialnej. Bezpośrednim donorem elektronów dla mitochondrialnego cytochromu P-450 jest białko żelazosiarkowe - adrenodoksyna, która ulega redukcji przez reduktazę NADPH:adrenodoksyna. Reduktaza NADPH: adrenodoksyna jest flawoproteiną zawierającą FAD. Transport odbywa się następująco:

NADPH + H⁺ ---->reduktaza NADPH:adrenodoksyna -----> adrenodoksyna ---->cytochrom P-450

Adrenodoksyna przekazuje na cyt. P-450 obydwa elektrony (w 2 etapach).

Układ mitochondrialnej monooksygenazy współdziała z 2 hydroksylazami. Pierwsza atakuje specyficznie cholesterol i odszczepia jego łańcuch boczny, natomiast druga hydroksyluje pozycję 11β w pierścieniu.

W błonie jądrowej zawarty jest także układ monooksygenazy analogiczny do zawartego w błonach siateczki śródplazmatycznej, co stwarza niebezpieczeństwo interakcji pomiędzy kwasami nukleinowymi a powstającymi aktywnymi metabolitrami, np. epoksydami i może prowadzić do efektów toksycznych i genotoksycznych (może powodować mutacje)

-Ogromna różnorodność substratów i typów reakcji katalizowanych przez cytochrom P-450 możliwa jest

dzięki występowaniu wielu form molekularnych cytochromu P-450 o różnych, chociaż nakładających się specyficznościach substratowych. U człowieka wyizolowano ponad 100 różnych izoenzymów cytochromu P-450. Kazda forma molekularna cytochromu P-450 jest produktem innego genu. Izoenzymy cytochromu P-450 różnią się :

1. składem aminokwasowym

2. podatnością na indukcję przez różne induktory

3. wrażliwością na działanie inhibitorów

4. specyficznością substratową

5. względną masą cząsteczkową w zakresie 47000 - 56000

6. maksimum absorbancji zredukowanego kompleksu z CO w zakresie od 447 do 452

7. właściwościami elektroforetycznymi i immunochemicznymi

Formy te wykazują również specyficzność narządową, gatunkową oraz zależność od płci i wieku.

Nomenklatura cytochromów jest oparta na podobieństwach sekwencji aminokwasowej poszczególnych form molekularnych:

1. cytochromy należące do 1 rodziny posiadają co najmniej 40% sekwencji aminokwasów podobnych. Rodziny oznacza się cyframi arabskimi: 1,2,3,...

2. w obrębie podrodziny istnieje co najmniej 55-60% analogicznych sekwencji. Podrodziny oznakowano kolejnymi dużymi literami alfabetu: A,B,C, ...

3. Formy molekularne w obrębie tej samej podrodziny oznacza się np. 1A1, 1A2

-Najwięcej leków i najczęściej metabolizującym leki enzymem jest cytochrom 3A4.

-Geny kodujące te białka oznacza się kursywą, białko - normalną czcionką.

-Niektóre izoformy CYP450 wykazują regio- i stereospecyficzność w stosunku do katalizowanych reakcji, np. hydroksylazy zaangażowane w syntezę hormonów steroidowych są stereospecyficzne.

-zawartość niektórych izoform CYP450 zależy od czynników patofizjologicznych, np. w głodzeniu obserwujemy wyższe stęż. 2B1, 2B2, 2E1

-opisano 30 rodzin cytochromu P-450, w tym 12 ussaków

-użycie selektywnych inhibitorów enzymatycznych stanowi jedną z metod do identyfikacji izoenzymów CYP450

-przykłady: CYP450 2D6 katalizuje metabolizm β-adrenolitryków, leków antydepresyjnych, analgetyków

CYP450 3A4,5,7 katalizuje metabolizm m.in. makrolidów(erytromycyny), leków antyarytmicznych, antagonistów wapnia, steroidów, opioidów

CYP450 11A,B, 17,19,21 biorą udział w syntezie hormonów steroidowych w nadnerczach i gonadach

W cukrzycy wzrasta zawartość izoform 2A1, 2C7, 2C12, 2E1, 3A2, 4A2, 4A3

W genetycznie uwarunkowanym nadciscieniu wzrasta zawartość 1A1, 2C11, 3A2

-Najważniejsze izoformy CYP zaangażowane w biotransformację leków : CYP1A2, 2D6, 2E1, 3A4

Rozmieszczenie wewnątrzbłonowe układu monooksygenaz:

Oksydoreduktaza NADPH: cytochrom P-450 składa się z części hydrofobowej zanurzonej w błonie retikulum oraz z aktywnej katalitycznie części hydrofilowej wystającej ponad powierzchnię błony. Część hydrofobowa związana jest ściśle z fosfolipidami (głównie z fosfatydylocholiną) błony. Cytochrom P-450 jest głęboko zanurzony w błonie lecz jego części wystają na zewnątrz zarówno od strony cytoplazmatycznej jak i światła kanalika siateczki endoplazmatycznej. Cytochrom P-450 jest również otoczony przez lipidy błony. Jest on zakotwiczony w błonie za pomocą 2 transmembranowych pętli. Miejsce wiązania substratu znajduje się od strony błony retikularnej, natomiast hem jest ułożony równolegle do powierzchni błony.

Liczba cząsteczek cytochromu P-450 jest znacznie wyższa niż liczba cząsteczek oksydoreduktazy NADPH:cytochrom P-450. Każda cząsteczka tej flawoproteiny otoczona jest przez kilka cząsteczek cytochromu P-450, z którymi może bezpośrednio reagować. W błonie siateczki śródplazmatycznej zanurzone są również cząsteczki cytochromu P-450, które nie mają bezpośredniego kontaktu z oksydoreduktazą.

System monooksygenaz katalizuje różne reakcje w zależności od substratu i pozycji w cząsteczce, do której przyłączany jest atom tlenu. Jeśli tlen włączamy:

• Do wiązania węgiel-wodór, zachodzi reakcja hydroksylacji

• Do podwójnego wiązania węgiel-węgiel, zachodzi epoksydacja substratu

• Przy węglu grupy alkilowej przylegającej do heteroatomu (N, O, S), zachodzi N-, O-, S-dealkilacja substratu:

R-NH-CH₃ - - -> [R-NH-CH₂OH] - R-NH₂ + HCOH

N-dealkilacja

• zamiast grupy NH₂, zachodzi oksydacyjna dezaminacja

OH O

| ||

R - CH - CH₃ → R - C - CH₃ → R - C - CH₃ + NH₃

| |

NH₂ NH₂

• zamiast S, zachodzi desulfurylacja lub utleniane atomu S (reakcje S - oksydacji)

O

||

R₁ - S - R₂ - - - -> R₁ - S - R₂

• Zamiast NO₂ - denitryfikacja

• Utlenianie atomu azotu (reakcje N-oksydacji)

2. Biosynteza glicerolofosfolipidów - lokalizacja, przebieg.

- Lokalizacja: cytozol komórek

- Przebieg:

Glicerolofosfolipidy mogą być syntetyzowane w różny sposób:

I. Sposób:

1. Synteza kwasu fosfatydowego (diacyloglicerolo-3-fosforanu):

fosfodihydroksyaceton (z glikolizy)

↓ dehydrogenaza glicerolo-3-fosforanowa (NADH+H⁺→NAD⁺)

glicerol
glicerolo-3-fosforan
1-acyloglicerolo-3-fosforan
1,2-diacyloglicerolo-3-fosforan (kwas fosfatydowy)

• Reakcja katalizowana przez kinazę glicerolową wymaga ATP.

Glicerolo-3-fosforan z fosfodihydroksyacetonu powstaje w tkankach, gdzie nie ma kinazy glicerolowej, np. tk.tłuszczowa.

• Reakcja powstawania 1-acyloglicerolo-3-fosforanu zachodzi przy udziale acyloCoA (głównie nasyconego)

• Reakcja powstawania 1,2-diacyloglicerolo-3-fosforanu zachodzi przy udziale acyloCoA (głównie nasyconego)

2. Utworzenie cytydynodiacyloglicerolu(CDP-diacloglicerol).

Kwas fosfatydowy + CTP → CDP-diacyloglicerol, reakcja jest katalizowana przez cytydylotransferazę CTP-fosfatydanową; reakcję tą ,,napędza” hydroliza CTP z odszczepieniem pirofosforanu

3. Następnie zaktywowany fosfatyd reaguje z grupą hydroksylową polarnego alkoholu.

Jeśli tym alkoholem jest seryna, to produktem reakcji jest fosfatydyloseryna i CMP; reakcja katalizowana przez serynotransferazę CDP-diacyloglicerolową.

Podobnie powstaje fosfatydyloinozytol. Jest on tworzony w wyniku przeniesienia grupy fosforanu diacyloglicerolu z cząsteczki CDP-diacyloglicerolu na cząsteczkę inozytolu; reakcja katalizowana przez inozytolotransferazę CDP-diacyloglicerolową. Kolejne fosforylacje fosfatydyloinozytolu katalizowane przez specyficzne kinazy(z udziałem ATP) prowadzą do powstania najpierw fosfatydyloinozytolo-4-fosforanu, a następnie fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforanu.

Jest to kluczowy związek w procesie przekazywania sygnału w komórce. Stymulacja hormonalna aktywuje fosfolipazę C - enzym hydrolizujący ten fosfolipid do diacyloglicerolu(DAG) i inozytolo-1,4,5-trifosforanu (IP₃), które spełniają rolę przekaźników drugiego rzędu.

II. Sposób:

1. Kwas fosfatydowy → 1,2-diacyloglicerol, pod wpływem fosfohydrolazy fosfatydanowej (z udziałem H₂O, odłącza się reszta fosforanowa). 1,2-DAG może także powstać z monoacyloglicerolu z udziałem acyloCoA pod wpływem acylotransferazy monoglicerolowej (w jelicie).

2. Cholina → fosfocholina ; pod wpływem kinazy choliny, z udziałem ATP.

3. Fosfocholina → CDP-cholina ; pod wpływem cytydylotransferazy fosfocholinowej, z udziałem CTP (następuje uwalnianie pirofosforanu).

4. CDP-cholina + 1,2-diacyloglicerol → fosfatydylocholina ; pod wpływem diacyloglicerolotransferazy fosfocholinowej, z odłączeniem CMP.

W analogiczny sposób powstaje fosfatydyloetanoloamina.

III. Sposób(przekształcenia wzajemne fosfolipidów):

Fosfatydyloseryna może ulegać dekarboksylacji (pod wpływem dekarboksylazy zależnej od PLP) do fosfatydyloetanoloaminy. Następnie grupa aminowa tego fosfolipidy jest trzykrotnie metylowana, co prowadzi do powstania fosfatydylocholiny. Reakcje metylacji przebiegają z udziałem S-adenozylometioniny(donora grup metylowych), pod wpływem metylotransferaz (grupy metylowe S-adenozynometioniny mogą pochodzić z metyleno-H₄-folianu. Fosfatydyloseryna może powstawać z fosfatydyloetanoloaminy bezpośrednio w reakcji wymiany z seryną.

• SYNTEZA KARDIOLIPINY (difosfatydyloglicerolu)

1. glicerolo-3-fosforan + CDP-diacyloglicerol→ fosfatydyloglicerolofosforan (odłącza się CMP) → fosfatydyloinozytol (pod wpływem H₂O, odłącza się fosforan)

2. fosfatydyloglicerol + CDP-diacyloglicerol → kardiolipina (odłącza się CMP)

Kardiolipina wchodzi w skład wewnętrznej błony mitochondrialnej. Jest niezbędna w szczególności dla funkcjonowania transportera fosforanu i dla aktywności oksydazy cytochromowej.

• SYNTEZA GLICEROLOFOSFOLIPIDÓW ETEROWYCH

- zachodzi w tylko w peroksysomach!!!

- zawierają grupę eterową przy atomie C1.

- synteza:

1. fosfodihydroksyaceton + acyloCoA → 1-acylofosfodihydroksyaceton , pod wpływem acylotransferazy

2. 1-acylofosfodihydroksyaceton + alkohol o długim łańcuchu węglowym → 1-alkilofosfodihydroksyaceton + kwas karboksylowy ; pod wpływem syntazy. Jest to reakcja wymiany reszty acylowej na alkohol; powstały związek zawiera wiązanie eterowe.

3. 1-alkilofosfodihydroksyaceton → 1-alkiloglicerolo-3-fosforan; pod wpływem reduktazy z udziałem NAPDH+H⁺

4. 1-alkiloglicerolo-3-fosforan + acyloCoA → 1-alkilo-2-acyloglicerolo-3-fosforan; pod wpływem acylotransferazy

5. 1-alkilo-2-acyloglicerolo-3-fosforan → 1-alkilo-2-acyloglicerol; pod wpływem fosfohydrolazy, z udziałem wody odłącza się reszta fosforanowa

a) synteza plazmalogenów:

6. 1-alkilo-2-acyloglicerol + CDP-etanoloamina → 1-alkilo-2-acyloglicerolo-3-fosfoetanoloamina + CMP ; pod wpływem fosfoetanoloaminotransferazy.

7. 1-alkilo-2-acyloglicerolo-3-fosfoetanoloamina → 1-alkenylo-2-acyloglicerolo-3-fosfoetanoloamina ; pod wpływem desaturazy, z udziałem NADPH, O₂ (w katalizie uczestniczy cytochrom b₅)

b) synteza PAF ( czynnika aktywującego płytki)

6. 1-alkilo-2-acyloglicerol + CDP-cholina → 1-alkilo-2-acyloglicerolo-3-fosfocholina + CMP ; pod wpływem fosfocholinotransferazy

7. 1-alkilo-2-acyloglicerolo-3-fosfocholina → 1-alkilo-2-lizoglicerolo-3-fosfocholina + kwas karboksylowy ; pod wpływem fosfolipazy A₂, z udziałem H₂O

8. 1-alkilo-2-lizoglicerolo-3-fosfocholina + acyloCoA → 1-alkilo-2-acetyloglicerolo-3-fosfocholina (PAF) ; pod wpływem acetylotransferazy

PAF powoduje agregację płytek i rozszerzenie naczyń krwionośnych. Reszta octanowa przy C2 zwiększa rozpuszczalnośc w wodzie. Ma działanie wrzodotwórcze, uczestniczy w procesach odpowiedzi biologicznej: zapaleniu, chemotaksji, fosforylacji białek.

3. Utlenianie cytoplazmatycznego NADH w warunkach tlenowych

1. Transport NADH do mitochondriów.

- wewnętrzna błona mitochondrialna nie jest przepuszczalna dla NADH

- w cytozolu jest on produkowany głównie w szlaku glikolitycznym, w reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę aldehydu 3-fosfoglicerynowego, ponadto przez dehydrogenazę dihydroorotanową w syntezie pirymidyn.

- transport:

a) czółenko glocerolofosforanowe:

fosfodihydroksyaceton zostaje przekształcony w glicerolo-3-fosforan pod wpływem dehydrogenazy glicerol-3-fosforanowej (zawierającej jako grupę prostetyczną NAD- następuje utlenienie NADH do NAD; reakcja zachodzi w cytoplazmie). Glicerolo-3-fosforan dyfunduje przez zewnętrzną błonę mitochondrialną i tam z udziałem mitochondrialnej dehydrogenazy glicerol-3-fosforanowej (zawierającej jako grupę prostetyczną FAD- następuje redukcja FAD; znajdującej się po zewnętrznej stronie wewnętrznej błony mitochondrialnej), zostaje ponownie utleniony do fosfodihydroksyacetonu, który dyfunduje z powrotem do cytoplazmy. 2 elektrony zostają przeniesione z NAD na FAD.

b) czółenko jabłczanowo-asparaginianowe(głównie w sercu i wątrobie):

w cytoplazmie elektrony z NADH (dehydrogenazy jabłczanowej) są przenoszone do szczawiooctanu tworząc jabłczan. Jabłczan przechodzi przez wewnętrzną błonę mitochondrialną (wymieniając się z α-ketoglutaranem), w matriks ulega ponownemu utlenieniu z udziałem NAD (dehydrogenazy jabłczanowej mitochondrialnej) do szczawiooctanu. Powstały związek nie przechodzi łatwo przez błonę mitochondrialną. Ulega więc transaminacji z glutaminianem, tworząc asparaginian i α-ketoglutaran (pod wpływem aminotransferazy). Asparaginian przechodzi na stronę cytoplazmatyczną (dzięki przenośnikowi glutaminowo-asparginowemu, przenoszącemu H⁺ z glutaminianem), gdzie ulega odtworzeniu szczawiooctan.

2. Utleniane przy udziale łańcucha oddechowego zlokalizowanego w błonie mitochondrialnej.

Łańcuch oddechowy zbudowany jest z 4 kompleksów: I - oksydoreduktaza NADH+H⁺:CoQ

II - oksydoreduktaza bursztynian:CoQ

III - oksydoreduktaza ubihydrochinin:cytochrom C

IV - oksydaza cytochromowi

Kompleks I : Elektrony z NADH zostają przeniesione na łańcuch oddechowy na poziomie kompleksu I (FMN,centra żelazowo-siarkowe, koenzym Q)

Z NADH elektrony są przenoszone na FMN (znajdujące się od strony matriks), następnie z FMNH₂ na 3 centra żelazowo-siarkowe (typu 4Fe-4S), potem na związany koenzym Q ( w wyniku redukcji powstaje ubichonol QH₂), tam zmienia się bieg elektronów (ulegają odbiciu o 90º). Następnie są przekazywane do centrum [2Fe-2S] i wreszcie do ruchomej puli Q.

Kompleks ten ma kształt litery L. Hydrofobowe ramię jest ułożone poziomo w błonie, natomiast ramię pionowe jest wysunięte do matriks. NADH łączy się z ramieniem pionowym i oddaje swe elektrony na FMN.

Przejście 2 elektronów z NADH powoduje wypompowanie 4 H⁺ z matriks na cytoplazmatyczną stronę wewnętrznej błony mitochondrialnej.

Kompleks II: jego część stanowi dehydrogenaza bursztynianowa. Dostarcza elektrony z FADH₂. Elektrony z FADH₂ są przenoszone na centra Fe-S, a następnie na ruchomy Q, który przekazuje je na łańcuch oddechowy. Nie ma wypompowywania elektronów, bo energia katalizowanych reakcji jest zbyt mała.

To pytanie nie jest skończone, także trzeba jeszcze powiedzieć o pozostałych kompleksach łańcucha oddechowego, syntezie ATP.

Zestaw 80

1. Mikrosomalny system transportu elektronów

- Enzymy, biorące udział w reakcjach I fazy metabolizmu leków:

1. enzymy układu monooksygenaz (oksydazy o mieszanej funkcji)

a) zlokalizowane w błonach siateczki śródplazmatycznej (przede wszystkim komórek wątroby)

b) biorą udział w utlenianiu związków endogennych (sterydów, aminokw., kw. tłuszcz., prostaglandyn, kw. żółciowych, poch. wit. D₃) oraz egzogennych (ksenobiotyków)

c) katalizuje reakcję: NADPH + H⁺ + O₂ + RH
NADP⁺ + H₂O + ROH

RH - substrat utleniany ; ROH - hydroksylowany metabolit substratu

5. wykorzystuje 2 systemy transportu elektronów:

• I - system transportu elektronów zależny od NADPH + H⁺ jako dawcy elektronów

• II - system transportu elektronów zależny od NADH + H⁺ jako dawcy elektronów







NADPH + H⁺ - - - - -> Oksydoreduktaza - - - - - --> Cytochrom P-450 RH



NADPH: Cyt.P-450 ↑ O₂+2H⁺

| ROH




Fosfolipidy | Kw. nas.





NADH + H⁺
- - - - - -> Oksydoreduktaza - - - - - - -> Cyt.b₅ - - - - - -> Desaturaza



NADH:cyt. b₅ kwasów tłuszcz. Kw nienas.

• 
  
  
  I system transportu elektronów składa się z oksydoreduktazy NADPH:cytochrom P-450 i cytochromu P-450. Białka te są zanurzone w fosfolipidach błonowych (głównie w fosfatydylocholinie - tworzy ona hydrofobowe środowisko, umożliwiające utworzenie funkcjonalnego kompleksu oksydoreduktazy z cytochromem P-450 oraz ułatwia dotarcie i przyłączenie litofilnych substratów do cyt.P-450).

1. Oksydoreduktaza NADPH:cytochrom P-450

-flawoproteina zawierająca 1 cząsteczkę FAD i 1 cząsteczkę FMN.

- przenosi elektrony z NADPH + H⁺ na cytochrom P-450

- FAD pełni rolę akceptora elektronów z NADPH + H⁺

- FMN pełni rolę donora elektronów na cytochrom P-450

Atom Fe cytochromu P-450 przyjmuje jednorazowo tylko 1 elektron przekazywany przez flawoproteinę z NADPH + H⁺ .

2. Cytochrom P-450

- końcowa oksydaza systemu transportu elektronów zależnego od NADPH

- bierze bezpośredni udział w wiązaniu substratu, wiązaniu cząsteczki O₂ oraz w inkorporacji atomu tlenu do substratu. Drugi atom tlenu jest zużywany o tworzenia wody. Energia uzyskana podczas syntezy wody umożliwia wprowadzenie atomu tlenu do cząsteczki substratu.

- w specyficznych warunkach katalizuje tworzenie anionów nadtlenkowych oraz wolnych rodników tlenowych, będących inicjatorami peroksydacji lipidów lub oksydacyjnej degradacji hemu.

- może wykazywać właściwości:

a) monooksygenazy: RH + NADPH + H⁺ + O₂ - - - -> ROH + NADP⁺ + H₂O

b) oksydazy : NADPH + H⁺ + O₂ - - - -> NADP⁺ + H₂O₂, np. przy niedoborze substratu, na skutek mutacji punktowej, która zmienia 1 aminokw. W centrum aktywnym cytochromu.

c) peroksydazy: RH + XOOH - - - -> ROH + XOH XOOH - cykliczny nadtlenek

przy nieobecności tlenu, reduktazy i NADPH

- jego nazwa pochodzi od tego, że zredukowana forma tej hemoproteiny tworzy kompleks z CO, który wykazuje max. absorbancji przy dł. fali 450 nm.

- zbudowany z 6 podjednostek, z których każda zawiera 1 cząsteczkę żelazoporfiryny III i 3 reszty węglowodanowe. Hem jest niekowalencyjnie związany z apoproteiną. 4 wiazania koordynacyjne Fe hemowego są wysycane przez atomy azotu pierścieni pirogowych porfiryny, piąte łączy się z atomem siarki cysteiny, a szóste jest wysycane przez pierścień imidazolowy histydyny. Ligand imidazolowy jest najsłabiej związany z Fe hemowym i może być zastąpiony przez CO. Cząsteczka tlenu przyłącza się pomiędzy Fe hemowym, a ligandem siarkowym. Pozycja ta pozwala cząsteczce tlenu korzystać z elektronów zarówno atomu Fe, jak i siarki.

- Mechanizm działania :

I. Utl. forma cytochromu P-450 ( Fe³⁺) reaguje odwracalnie z cząsteczką substratu, tworząc kompleks cytochrom P-450 - substrat.

II. Powstały kompleks ulega jednoelektrodowej redukcji przy udziale oksydoreduktazy NADPH: cytochrom P-450.

III Do zredukowanego kompleksu przyłącza się cząsteczka tlenu, tworząc potrójny kompleks „oksytocytochrom” P-450 - lek.

5. Następuje przeniesienie elektronu z Fe²⁺ na cząsteczkę tlenu przekształcając ją w rodnik ponadtlenkowy (rodnik ten może oddysocjować od kompleksu i w wyniku dysmutacji przekształcić się w H₂O₂ - przy niedostatecznym wysyceniu układu tlenem).

V. Powstały w ten sposób kompleks ulega powtórnej redukcji. Elektron może pochodzić z oksydoreduktazy NADPH:cytochrom P-450 lub z cytochromu b₅. Z powstałego „peroksycytochromu” może uwolnić się jon nadtlenkowy, który po protonacji przekształca się w nadtlenek wodoru.

VI. Jon nadtlenkowy ulega dysocjacji na tlen atomowy oraz jon tlenkowy, który po protonacji tworzy cząsteczkę wody. Drugi atom tlenu tzw. „aktywny tlen” zostaje połaczony z cytochromem P-450.

VII. Powstaje wolny rodnik substratu i reaktywna forma tlenu.

VIII. „Aktywny atom tlenu” zostaje przeniesiony na cząsteczkę substratu (między C a H)

IX. Kompleks utlenionej formy cytochromu P-450 z utlenionym substratem ulega spontanicznemu rozpadowi a utleniona forma cytochromu P-450 może wejść do następnego cyklu reakcji.

• Oprócz różnorodnych funkcji katabolicznych bierze udział w syntezie sterydów w nadnerczach, w

biosyntezie kwasów żółciowych i wit. D₃ w wątrobie oraz w degradacji hemu. W nadnerczach cytochrom P-450 występuje w błonie mitochondrialnej. Bezpośrednim donorem elektronów dla mitochondrialnego cytochromu P-450 jest białko żelazosiarkowe - adrenodoksyna, która ulega redukcji przez reduktazę NADPH:adrenodoksyna. Reduktaza NADPH: adrenodoksyna jest flawoproteiną zawierającą FAD. Transport odbywa się następująco:

NADPH + H⁺ ---->reduktaza NADPH:adrenodoksyna -----> adrenodoksyna ---->cytochrom P-450

Adrenodoksyna przekazuje na cyt. P-450 obydwa elektrony (w 2 etapach).

Układ mitochondrialnej monooksygenazy współdziała z 2 hydroksylazami. Pierwsza atakuje specyficznie cholesterol i odszczepia jego łańcuch boczny, natomiast druga hydroksyluje pozycję 11β w pierścieniu.

W błonie jądrowej zawart jest także układ monooksygenazy analogiczny do zawartego w błonach siateczki śródplazmatycznej, co stwarza niebezpieczeństwo interakcji pomiędzy kwasami nukleinowymi a powstającymi aktywnymi metabolitrami, np. epoksydami i może prowadzić do efektów toksycznych i genotoksycznych (może powodować mutacje)

• Ogromna różnorodność substratów i typów reakcji katalizowanych przez cytochrom P-450 możliwa jest

dzięki występowaniu wielu form molekularnych cytochromu P-450 o różnych, chociaż nakładających się specyficznościach substratowych. U człowieka wyizolowano ponad 100 różnych izoenzymów cytochromu P-450. Kazda forma molekularna cytochromu P-450 jest produktem innego genu. Izoenzymy cytochromu P-450 różnią się :

1. składem aminokwasowym

8. podatnością na indukcję przez różne induktory

9. wrażliwością na działanie inhibitorów

10. specyficznością substratową

11. względną masą cząsteczkową w zakresie 47000 - 56000

12. maksimum absorbancji zredukowanego kompleksu z CO w zakresie od 447 do 452

13. właściwościami elektroforetycznymi i immunochemicznymi

Formy te wykazują również specyficzność narządową, gatunkową oraz zależność od płci i wieku.

Nomenklatura cytochromów jest oparta na podobieństwach sekwencji aminokwasowejposzczególnych form molekularnych:

4. cytochromy należące do 1 rodziny posiadają co najmniej 40% sekwencji aminokwasów podobnych. Rodziny oznacza się cyframi arabskimi: 1,2,3,...

5. w obrębie podrodziny istnieje co najmniej 55-60% analogicznych sekwencji. Podrodziny oznakowano kolejnymi dużymi literami alfabetu: A,B,C, ...

6. Formy molekularne w obrębie tej samej podrodziny oznacza się np. 1A1, 1A2

Najwięcej leków i najczęściej metabolizującym leki enzymem jest cytochrom 3A4.

Rozmieszczenie wewnątrzbłonowe układu monooksygenaz:

Oksydoreduktaza NADPH: cytochrom P-450 składa się z części hydrofobowej zanurzonej w błonie retikulum oraz z aktywnej katalitycznie części hydrofilowej wystającej ponad powierzchnię błony. Część hydrofobowa związana jest ściśle z fosfolipidami (głównie z fosfatydylocholiną) błony. Cytochrom P-450 jest głęboko zanurzony w błonie lecz jego części wystają na zewnątrz zarówno od strony cytoplazmatycznej jak i światła kanalika siateczki endoplazmatycznej. Cytochrom P-450 jest również otoczony przez lipidy błony. Jest on zakotwiczony w błonie za pomocą 2 transmembranowych pętli. Miejsce wiązania substratu znajduje się od strony błony retikularnej, natomiast hem jest ułożony równolegle do powierzchni błony.

Liczba cząsteczek cytochromu P-450 jest znacznie wyższa niż liczba cząsteczek oksydoreduktazy NADPH:cytochrom P-450. Każda cząsteczka tej flawoproteiny otoczona jest przez kilka cząsteczek cytochromu P-450, z którymi może bezposrednio reagować. W błonie siateczki śródplazmatycznej zanurzone są również cząsteczki cytochromu P-450, które nie mają bezpośredniego kontaktu z oksydoreduktazą.

System monooksygenaz katalizuje różne reakcje w zależności od substratu i pozycji w cząsteczce, do której przyłączany jest atom tlenu. Jeśli tlen włączamy:

• Do wiązania węgiel-wodór, zachodzi reakcja hydroksylacji

• Do podwójnego wiązania węgiel-węgiel, zachodzi epoksydacja substratu

• Przy węglu grupy alkilowej przylegającej do heteroatomu (N, O, S), zachodzi N-, O-, S-dealkilacja substratu:

R-NH-CH₃ - - -> [R-NH-CH₂OH] ---> R-NH₂ + HCOH

N-dealkilacja

• Zamiast grupy NH₂, zachodzi oksydacyjna dezaminacja

OH O

| ||

R - CH - CH₃ → R - C - CH₃ → R - C - CH₃ + NH₃

| |

NH₂ NH₂

• Zamiast S, zachodzi desulfurylacja lub utleniane atomu S (reakcje S - oksydacji)

O

||

R₁ - S - R₂ - - - -> R₁ - S - R₂

• Zamiast NO₂ - denitryfikacja

• Utlenianie atomu azotu (reakcje N-oksydacji)

• II system transportu elektronów składa się z oksydoreduktazy NADH:cytochrom b₅, cytochromu b₅ i czynnika wrażliwego na cyjanki (desaturazy tw. tłuszcz.)

• Oksydoreduktaza NADH:cytochrom b₅ :

- flawoproteina zawierająca FAD jako grupę prostetyczną

- jej zadaniem jest przenoszenie elektronów z NADH na cytochrom b₅

B) Cytochrom b₅:

- białko zawierające jako grupę prostetyczną żelazoporfirynę III.

- przenosi elektrony na desaturazę kw. tłuszcz.

- może być też donorem elektronów dla cyklicznych reakcji z udziałem cytochromu P-450

C) Desaturaza kw. tłuszczowych

- białko zawierające niehemowo związane Fe, które ma zdolność pobierania elektronów ze zredukowanego cytochromu b₅

- katalizuje desaturację kw. tłuszcz.

- jest wrażliwa na jony cyjankowe

- zredukowana forma Fe (Fe²⁺) pozwala na interakcje z tlenem i nasyconymi łańcuchami acylo-CoA, stanowiącymi substraty reakcji. Podczas tworzenia wiązania podwójnego uwalniane są 2 cząsteczki wody. 2 elektrony pochodzą z NADH, 2 z pojedynczego wiązania substratu.

Zestaw 81

2. Reakcje I fazy metabolizmu leków.

- Pojęcie metabolizmu leku obejmuje wchłanianie, dystrybucję, biotransformację i wydalanie.

- Biotransformacja to zespół przemian biochemicznych, którym lek ulega w organizmie pod wpływem endogennych enzymów. Przemiany te prowadzą do wzrostu polarności metabolizowanego związku, co na ogół ma na celu jego szybkie inaktywowanie i wydalenie z organizmu. Reakcje biotransformacji zostały podzielone na procesy

I fazy ( utlenianie, redukcja, hydroliza) - mają na celu zmianę struktury chemicznej związku w taki sposób, aby mogły zajść reakcje II fazy tzn. prowadzą do wytworzenia grup funkcyjnych, umożliwiających lub ułatwiających procesy sprzęgania. Procesy te prowadza do przekształcenia związków litofilnych, które bardzo wolno są wydalane z organizmu, ze względu na wchłanianie zwrotne w cewkach nerkowych - na związki bardziej hydrofilowe, usuwane łatwiej z organizmu. W wyniku reakcji I fazy może dojść do zmiany działania biologicznego ksenobiotyków. Zmiany te obejmują: zahamowanie lub osłabienie działania, nasilenie aktywności biologicznej bądź uaktywnienie nieaktywnego prekursora.

i II fazy(sprzęganie z kwasem glukuronowym, siarczanem, aminokwasami, glutationem, reakcje acetylacji i alkilacji) - prowadzą one do wzrostu polarności związku, co umożliwia jego wydalenie z ustroju.

Reakcje I fazy obejmują utleniane, redukcję, hydrolizę.

Do reakcji utleniania zaliczamy:

1. hydroksylację związków aromatycznych, alifatycznych, alicyklicznych

2. O-, N-, S-dealkilację

3. N-, S-oksydację

4. Oksydacyjną dezaminację

5. Oksydacyjną dehalogenację

6. Desulfurylację

7. Denitryfikację

8. Utleniane aldehydów aldehydów alkoholi

9. Aromatyzację połączeń alicyklicznych

Reakcje redukcji obejmują: redukcję związków nitrowych, azowych, dehalogenację, redukcję dwusiarczków do merkaptanów, dehydroksylację. Reakcje te katalizują reduktazy zlokalizowane w cytozolu kom. wątroby i nerek.

Reakcje hydrolizy obejmują: hydrolizę estrów, amidów, nitryli, karbaminianów, hydrazydów, hydrolityczną dehalogenację, hydrolityczne rozszczepienie pierścienia związków alicyklicznych. Mają miejsce w osoczu krwi i lizosomach. Są katalizowane przez hydrolazy

- Enzymy, biorące udział w reakcjach I fazy:

1. enzymy układu monooksygenaz (oksydazy o mieszanej funkcji)

a) zlokalizowane w błonach siateczki śródplazmatycznej (przede wszystkim komórek wątroby)

b) biorą udział w utlenianiu związków endogennych (sterydów, aminokw., kw. tłuszcz., prostaglandyn, kw. żółciowych, poch. wit. D₃) oraz egzogennych (ksenobiotyków)

c) katalizuje reakcję: NADPH + H⁺ + O₂ + RH
NADP⁺ + H₂O + ROH

RH - substrat utleniany ; ROH - hydroksylowany metabolit substratu

6. wykorzystuje 2 systemy transportu elektronów:

• I - system transportu elektronów zależny od NADPH + H⁺ jako dawcy elektronów

• II - system transportu elektronów zależny od NADH + H⁺ jako dawcy elektronów







NADPH + H⁺ - - - - -> Oksydoreduktaza - - - - - --> Cytochrom P-450 RH



NADPH: Cyt.P-450 ↑ O₂+2H⁺

| ROH




Fosfolipidy | Kw. nas.





NADH + H⁺
- - - - - -> Oksydoreduktaza - - - - - - -> Cyt.b₅ - - - - - -> Desaturaza



NADH:cyt. b₅ kwasów tłuszcz. Kw nienas.

• 
  
  
  I system transportu elektronów składa się z oksydoreduktazy NADPH:cytochrom P-450 i cytochromu P-450. Białka te są zanurzone w fosfolipidach błonowych (głównie w fosfatydylocholinie - tworzy ona hydrofobowe środowisko, umożliwiające utworzenie funkcjonalnego kompleksu oksydoreduktazy z cytochromem P-450 oraz ułatwia dotarcie i przyłączenie litofilnych substratów do cyt.P-450).

1. Oksydoreduktaza NADPH:cytochrom P-450

-flawoproteina zawierająca 1 cząsteczkę FAD i 1 cząsteczkę FMN.

- przenosi elektrony z NADPH + H⁺ na cytochrom P-450

- FAD pełni rolę akceptora elektronów z NADPH + H⁺

- FMN pełni rolę donora elektronów na cytochrom P-450

Atom Fe cytochromu P-450 przyjmuje jednorazowo tylko 1 elektron przekazywany przez flawoproteinę z NADPH + H⁺ .

2. Cytochrom P-450

- końcowa oksydaza systemu transportu elektronów zależnego od NADPH

- bierze bezpośredni udział w wiązaniu substratu, wiązaniu cząsteczki O₂ oraz w inkorporacji atomu tlenu do substratu. Drugi atom tlenu jest zużywany o tworzenia wody. Energia uzyskana podczas syntezy wody umożliwia wprowadzenie atomu tlenu do cząsteczki substratu.

- w specyficznych warunkach katalizuje tworzenie anionów nadtlenkowych oraz wolnych rodników tlenowych, będących inicjatorami peroksydacji lipidów lub oksydacyjnej degradacji hemu.

- może wykazywać właściwości:

a) monooksygenazy: RH + NADPH + H⁺ + O₂ - - - -> ROH + NADP⁺ + H₂O

b) oksydazy : NADPH + H⁺ + O₂ - - - -> NADP⁺ + H₂O₂, np. przy niedoborze substratu, na skutek mutacji punktowej, która zmienia 1 aminokw. W centrum aktywnym cytochromu.

c) peroksydazy: RH + XOOH - - - -> ROH + XOH XOOH - cykliczny nadtlenek

przy nieobecności tlenu, reduktazy i NADPH

- jego nazwa pochodzi od tego, że zredukowana forma tej hemoproteiny tworzy kompleks z CO, który wykazuje max. absorbancji przy dł. fali 450 nm.

- zbudowany z 6 podjednostek, z których każda zawiera 1 cząsteczkę żelazoporfiryny III i 3 reszty węglowodanowe. Hem jest niekowalencyjnie związany z apoproteiną. 4 wiazania koordynacyjne Fe hemowego są wysycane przez atomy azotu pierścieni pirogowych porfiryny, piąte łączy się z atomem siarki cysteiny, a szóste jest wysycane przez pierścień imidazolowy histydyny. Ligand imidazolowy jest najsłabiej związany z Fe hemowym i może być zastąpiony przez CO. Cząsteczka tlenu przyłącza się pomiędzy Fe hemowym, a ligandem siarkowym. Pozycja ta pozwala cząsteczce tlenu korzystać z elektronów zarówno atomu Fe, jak i siarki.

- Mechanizm działania :

I. Utl. forma cytochromu P-450 ( Fe³⁺) reaguje odwracalnie z cząsteczką substratu, tworząc kompleks cytochrom P-450 - substrat.

II. Powstały kompleks ulega jednoelektrodowej redukcji przy udziale oksydoreduktazy NADPH: cytochrom P-450.

III Do zredukowanego kompleksu przyłącza się cząsteczka tlenu, tworząc potrójny kompleks „oksytocytochrom” P-450 - lek.

6. Następuje przeniesienie elektronu z Fe²⁺ na cząsteczkę tlenu przekształcając ją w rodnik ponadtlenkowy (rodnik ten może oddysocjować od kompleksu i w wyniku dysmutacji przekształcić się w H₂O₂ - przy niedostatecznym wysyceniu układu tlenem).

V. Powstały w ten sposób kompleks ulega powtórnej redukcji. Elektron może pochodzić z oksydoreduktazy NADPH:cytochrom P-450 lub z cytochromu b₅. Z powstałego „peroksycytochromu” może uwolnić się jon nadtlenkowy, który po protonacji przekształca się w nadtlenek wodoru.

VI. Jon nadtlenkowy ulega dysocjacji na tlen atomowy oraz jon tlenkowy, który po protonacji tworzy cząsteczkę wody. Drugi atom tlenu tzw. „aktywny tlen” zostaje połaczony z cytochromem P-450.

VII. Powstaje wolny rodnik substratu i reaktywna forma tlenu.

VIII. „Aktywny atom tlenu” zostaje przeniesiony na cząsteczkę substratu (między C a H)

IX. Kompleks utlenionej formy cytochromu P-450 z utlenionym substratem ulega spontanicznemu rozpadowi a utleniona forma cytochromu P-450 może wejść do następnego cyklu reakcji.

• Oprócz różnorodnych funkcji katabolicznych bierze udział w syntezie sterydów w nadnerczach, w

biosyntezie kwasów żółciowych i wit. D₃ w wątrobie oraz w degradacji hemu. W nadnerczach cytochrom P-450 występuje w błonie mitochondrialnej. Bezpośrednim donorem elektronów dla mitochondrialnego cytochromu P-450 jest białko żelazosiarkowe - adrenodoksyna, która ulega redukcji przez reduktazę NADPH:adrenodoksyna. Reduktaza NADPH: adrenodoksyna jest flawoproteiną zawierającą FAD. Transport odbywa się następująco:

NADPH + H⁺ ---->reduktaza NADPH:adrenodoksyna -----> adrenodoksyna ---->cytochrom P-450

Adrenodoksyna przekazuje na cyt. P-450 obydwa elektrony (w 2 etapach).

Układ mitochondrialnej monooksygenazy współdziała z 2 hydroksylazami. Pierwsza atakuje specyficznie cholesterol i odszczepia jego łańcuch boczny, natomiast druga hydroksyluje pozycję 11β w pierścieniu.

W błonie jądrowej zawart jest także układ monooksygenazy analogiczny do zawartego w błonach siateczki śródplazmatycznej, co stwarza niebezpieczeństwo interakcji pomiędzy kwasami nukleinowymi a powstającymi aktywnymi metabolitrami, np. epoksydami i może prowadzić do efektów toksycznych i genotoksycznych (może powodować mutacje)

• Ogromna różnorodność substratów i typów reakcji katalizowanych przez cytochrom P-450 możliwa jest

dzięki występowaniu wielu form molekularnych cytochromu P-450 o różnych, chociaż nakładających się specyficznościach substratowych. U człowieka wyizolowano ponad 100 różnych izoenzymów cytochromu P-450. Kazda forma molekularna cytochromu P-450 jest produktem innego genu. Izoenzymy cytochromu P-450 różnią się :

1. składem aminokwasowym

• podatnością na indukcję przez różne induktory

1. wrażliwością na działanie inhibitorów

• specyficznością substratową

• względną masą cząsteczkową w zakresie 47000 - 56000

• maksimum absorbancji zredukowanego kompleksu z CO w zakresie od 447 do 452

• właściwościami elektroforetycznymi i immunochemicznymi

Formy te wykazują również specyficzność narządową, gatunkową oraz zależność od płci i wieku.

Nomenklatura cytochromów jest oparta na podobieństwach sekwencji aminokwasowejposzczególnych form molekularnych:

7. cytochromy należące do 1 rodziny posiadają co najmniej 40% sekwencji aminokwasów podobnych. Rodziny oznacza się cyframi arabskimi: 1,2,3,...

8. w obrębie podrodziny istnieje co najmniej 55-60% analogicznych sekwencji. Podrodziny oznakowano kolejnymi dużymi literami alfabetu: A,B,C, ...

9. Formy molekularne w obrębie tej samej podrodziny oznacza się np. 1A1, 1A2

Najwięcej leków i najczęściej metabolizującym leki enzymem jest cytochrom 3A4.

Rozmieszczenie wewnątrzbłonowe układu monooksygenaz:

Oksydoreduktaza NADPH: cytochrom P-450 składa się z części hydrofobowej zanurzonej w błonie retikulum oraz z aktywnej katalitycznie części hydrofilowej wystającej ponad powierzchnię błony. Część hydrofobowa związana jest ściśle z fosfolipidami (głównie z fosfatydylocholiną) błony. Cytochrom P-450 jest głęboko zanurzony w błonie lecz jego części wystają na zewnątrz zarówno od strony cytoplazmatycznej jak i światła kanalika siateczki endoplazmatycznej. Cytochrom P-450 jest również otoczony przez lipidy błony. Jest on zakotwiczony w błonie za pomocą 2 transmembranowych pętli. Miejsce wiązania substratu znajduje się od strony błony retikularnej, natomiast hem jest ułożony równolegle do powierzchni błony.

Liczba cząsteczek cytochromu P-450 jest znacznie wyższa niż liczba cząsteczek oksydoreduktazy NADPH:cytochrom P-450. Każda cząsteczka tej flawoproteiny otoczona jest przez kilka cząsteczek cytochromu P-450, z którymi może bezposrednio reagować. W błonie siateczki śródplazmatycznej zanurzone są również cząsteczki cytochromu P-450, które nie mają bezpośredniego kontaktu z oksydoreduktazą.

System monooksygenaz katalizuje różne reakcje w zależności od substratu i pozycji w cząsteczce, do której przyłączany jest atom tlenu. Jeśli tlen włączamy:

• Do wiązania węgiel-wodór, zachodzi reakcja hydroksylacji

• Do podwójnego wiązania węgiel-węgiel, zachodzi epoksydacja substratu

• Przy węglu grupy alkilowej przylegającej do heteroatomu (N, O, S), zachodzi N-, O-, S-dealkilacja substratu:

R-NH-CH₃ - - -> [R-NH-CH₂OH] ---> R-NH₂ + HCOH

N-dealkilacja

• Zamiast grupy NH₂, zachodzi oksydacyjna dezaminacja

OH O

| ||

R - CH - CH₃ → R - C - CH₃ → R - C - CH₃ + NH₃

| |

NH₂ NH₂

• Zamiast S, zachodzi desulfurylacja lub utleniane atomu S (reakcje S - oksydacji)

O

||

R₁ - S - R₂ - - - -> R₁ - S - R₂

• Zamiast NO₂ - denitryfikacja

• Utlenianie atomu azotu (reakcje N-oksydacji)

• II system transportu elektronów składa się z oksydoreduktazy NADH:cytochrom b₅, cytochromu b₅ i czynnika wrażliwego na cyjanki (desaturazy tw. tłuszcz.)

• Oksydoreduktaza NADH:cytochrom b₅ :

- flawoproteina zawierająca FAD jako grupę prostetyczną

- jej zadaniem jest przenoszenie elektronów z NADH na cytochrom b₅

B) Cytochrom b₅:

- białko zawierające jako grupę prostetyczną żelazoporfirynę III.

- przenosi elektrony na desaturazę kw. tłuszcz.

- może być też donorem elektronów dla cyklicznych reakcji z udziałem cytochromu P-450

C) Desaturaza kw. tłuszczowych

- białko zawierające niehemowo związane Fe, które ma zdolność pobierania elektronów ze zredukowanego cytochromu b₅

- katalizuje desaturację kw. tłuszcz.

- jest wrażliwa na jony cyjankowe

2. Inne enzymy metabolizujące leki (reakcje I fazy):

- dehydrogenaza alkoholowa

- dehydrogenaza aldehydowa

- oksydaza ksantynowa

- oksydaza aminowa (monoaminooksydaza, diamionooksydaza)

- oksydaza alkilohydrazynowa

- aromatazy

- monooksygenazy flawinowe

Zestaw 82

1. Reakcje II fazy metabolizmu leków.

- Pojęcie metabolizmu leku obejmuje wchłanianie, dystrybucję, biotransformację i wydalanie.

- Biotransformacja to zespół przemian biochemicznych, którym lek ulega w organizmie pod wpływem endogennych enzymów. Przemiany te prowadzą do wzrostu polarności metabolizowanego związku, co na ogół ma na celu jego szybkie inaktywowanie i wydalenie z organizmu. Reakcje biotransformacji zostały podzielone na procesy

I fazy ( utlenianie, redukcja, hydroliza) - mają na celu zmianę struktury chemicznej związku w taki sposób, aby mogły zajść reakcje II fazy tzn. prowadzą do wytworzenia grup funkcyjnych, umożliwiających lub ułatwiających procesy sprzęgania. Procesy te prowadza do przekształcenia związków litofilnych, które bardzo wolno są wydalane z organizmu, ze względu na wchłanianie zwrotne w cewkach nerkowych - na związki bardziej hydrofilowe, usuwane łatwiej z organizmu.

i II fazy(sprzęganie z kwasem glukuronowym, siarczanem, aminokwasami, glutationem, reakcje acetylacji i alkilacji) - prowadzą one do wzrostu polarności związku, co umożliwia jego wydalenie z ustroju. Procesy sprzęgania wymagają źródła energii. W pierwszym etapie lek lub czynnik sprzęgający ulega przemianie w połączenie aktywne, a w drugim etapie forma zaktywowana zostaje przeniesiona na inny składnik układu sprzęgającego.

- Enzymy biorące udział w reakcjach II fazy:

1. Sprzęganie z kwasem glukuronowym katalizuje UDP- glukuronylotransferaza:

- występuje we frakcji mikrosomalnej

- przenosi kwas UDP-glukuronowy na odpowiedni substrat

- substratami dla tego enzymu są związki endogenne (bilirubina, sterydy, serotonina) lub egzogenne (ksenobiotyki)

- reakcji tej podlegają związki zawierające grupę OH (fenole, alkohole, enole), COOH(kwasy aromatyczne i alifatyczne), NH₂ , NH(aminy alifatyczne i aromatyczne, amidy, sulfonamidy, związki heterocykliczne z azotem), SH

- w reakcji uczestniczy aktywna forma kwasu glukuronowego, która powstaje w wyniku utlenienia UDP-glukozy pod wpływem dehydrogenazy UDP-glukozy w obecności NAD.

- zachodzi głównie w wątrobie, ale też w jelicie cienkim, płucach, nerkach

2. Sprzęganie z kwasem siarkowym katalizuje sulfotransferaza

- występuje w cytozolu

- przenosi resztę kwasu siarkowego z aktywnego siarczanu (PAPS) na substraty zawierające grupę OH lub NH₂ ( są to związki alifatyczne, aromatyczne z grupą OH lub aminy aromatyczne, mogą to być także związki endogenne - sterydy, cholina, adrenalina, heparyna, kw. chondroitynosiarkowy)

*synteza aktywnego siarczanu zachodzi w 2 etapach:

a) z ATP i kw. siarkowego, pod wpływem adenylilotransferazy siarczanowej, tworzy się kwas adenylosiarkowy

b) utworzony kwas pod działaniem kinazy adenylulosiarczanowej i ATP tworzy aktywny siarczan (PAPS)

3. Reakcje acetylacji katalizuje acetylotransferaza

- przenosi grupę acetylową z acetylo-CoA na odpowiedni akceptor - zawierający gr. NH₂, OH, SH (sulfonamidy, aminy, poch. hydrazyny, aminokwasy, aminocukry, cholina, histamina, spermina, spermidyna.

4. Reakcje alkilacji (N-, O-, S-alkilacja) są katalizowane przez odpowiednie metylotransferazy(najczęściej zachodzącą reakcją jest metylacja).

- następuje przeniesienie grupy metylowej, która pochodzi z S-adenozylometioniny na akceptor.

5. Sprzęganie aminokwasami (glicyna, seryna, tauryna)

- ulegają tej reakcji kwasy aromatyczne , niektóre alifatyczne. Przed sprzęganiem związki te ulegają aktywacji, podobnie jak kwasy tłuszczowe,

- u człowieka dominuje sprzęganie z glicyną. Układy enzymatyczne biorące udział w tym procesie znajdują się w wątrobie i nerkach. Ich substratem może być kw. benzoesowy, fenylooctowy, cholowy, indolooctowy.

- przykładem udziału seryny w procesach sprzęgania może być jej połączenie z kwasem ksanturenowym - metabolitem tryptofanu.

6. Sprzęganie z glutationem jest katalizowane przez S-transferazę glutationową

- występuje ona w cytozolu kom. wątroby, nerek, jelit, płuc, niewielkie jej ilości mogą występować w mikrosomach

- reakcja ta ma znaczenie w detoksykacji silnie mutagennych, elektrofilowych związków: epoksydów, aromatycznych chloro-, nitrozwiązków.

- Pochodne glutationowe ksenobiotyków są przekształcane w kwasy merkapturowe i wydalane z moczem lub żółcią

- III faza biotansformacji leków. Tą nazwą określa się dalszy metabolizm pochodnych glutationowych ksenobiotyków( kwasów merkapturowych lub połączeń z cysteiną). Związki te są wydzielane z żółcią do jelita, gdzie pod wpływem liazy C-S, przekształcają się w pochodne sulfhydrylowe, które po metylacji ponownie przechodzą do wątroby. Tam są utleniane do metylotiozwiązków i wydalane. Takim przemianom ulega np.kofeina.

2.Nieodwracalne reakcje glikolizy i ich znaczenie.

Reakcjami nieodwracalnymi w przebiegu glikolizy są

1.Przekształcenie glukozy w glukozo-6-fosforan(G-6-P), katalizowana przez heksokinazę(lub przez glukokinazę w wątrobie).

2. Przekształcenie fruktozo-6-fosforanu(F-6-P) w fruktozo-1,6-bisfosforan, katalizowane przez fosfofruktokinazę

3. Przekształcenie fosfoenolopirogronianu w pirogronian, katalizowane przez kinazę pirogronianową.

Pierwsze 2 reakcje zużywają ATP, natomiast w reakcji 3 powstaje cząsteczka ATP.

Szlak glikolityczny służy 2 zasadniczym celom: wytwarzaniu ATP kosztem degradacji glukozy i dostarczaniu składników budulcowych do różnych reakcji syntez, np. tworzenie długich łańcuchów kwasów tłuszczowych. Aby sprostać tym zadaniom, szybkość przemiany glukozy w pirogronian jest regulowana. Miejscami regulacji szlaków metabolicznych są enzymy katalizujące reakcje nieodwracalne, a więc w naszym przypadku enzymy katalizujące reakcje wymienione powyżej. W związku z tym enzymy te pełnią zarówno rolę katalityczną, jak i regulacyjną.

Ich aktywność jest regulowana przez odwracalne wiązanie czynników allosterycznych, lub modyfikację kowalencyjną i jednocześnie ich ilość jest regulowana przez kontrolę transkrypcyjną.

Heksokinaza:

- jest hamowana przez:

• G-6-P (hamowanie allosteryczne)

• hamowanie fosfofruktokinazy, gdyż zwiększa się wtedy stężenie fruktozo-6-fosforanu i jednocześnie wzrasta poziom G-6-P, znajdującego się w równowadze z F-6-P.

- transkrypcja genu kodującego ten enzym jest pobudzana przez insulinę

Glukokinaza(od heksokinazy różni się tym, że działa przy wysokich stężeniach glukozy, sprzyjając pobieraniu glukozy do wątroby w przypadku jej dużego stężenia występującego w żyle wrotnej po posiłku. Dostarcza G-6-P do syntezy glikogenu. Wysoka stała K_M glukokinazy w wątrobie zapewnia w pierwszej kolejności dostarczenie glukozy do mózgu i mieśni w sytuacji, gdy jej zapas jest ograniczony.)

- nie jest hamowana G-6-P

- transkrypcja genu kodującego ten enzym jest pobudzana przez insulinę

Fosfofruktokinaza

- najważniejszy enzym odpowiedzialny za kontrolę glikolizy

- jest hamowana przez:

• wysoki poziom ATP (zmniejsza on powinowactwo enzymu do F-6-P). Wywołuje efekt allosteryczny przez związanie ATP do specyficznego miejsca regulatorowego, oddalonego miejsca katalitycznego.

• jony H⁺, co zapobiega nadmiernemu tworzeniu się mleczanu oraz gwałtownemu obniżeniu pH krwi.

• cytrynian. Jego wysoki poziom oznacza, że prekursory biosyntetyczne występują w dostatecznej ilości i nie jest potrzebne rozkładanie dodatkowych ilości glukozy. Wzmacnia on hamujący efekt ATP.

• kwasy tłuszczowe

- jest pobudzana przez:

• *AMP - znosi hamujące działanie ATP. Jej aktywność wzrasta w momencie obniżenia stosunku ATP/AMP.

• Fruktozo-2,6-bisfosforan - zwiększa powinowactwo enzymu do F-6-P oraz osłabia efekt ATP. Przesuwa równowagę konformacyjną enzymu ze stanu T do stanu R.

Fruktozo-2,6-bisfosforan:

-powstaje podczas fosforylacji F-6-P, w reakcji katalizowanej przez fosfofruktokinazę 2 (PFK2).

- jest hydrolizowany do F-6-P przez specyficzną fosfatazę - fruktozobisfosfatazę 2 (FBPaza2)

PFK2 i FBPaza2 są obecne w pojedynczym łańcuchu polipeptydowym. Ten dwufunkcyjny enzym zawiera przy N końcu domenę regulatorową, za którą znajduje się domena o aktywności fosfatazy.

F-6-P przyspiesza syntezę F-2,6-BP i hamuje jego hydrolizę, co natomiast stymuluje fosfofruktokinazę. Proces ten nazywa się sprzężeniem dodatnim. Ponadto, aktywności PFK2 i FBPazy2 są kontrolowane przez fosforylację pojedynczej reszty Ser. Przy małej ilości glukozy, wzrost stężenia glukagonu wyzwala kaskadę cAMP prowadzącą do fosforylacji tego enzymu dwufunkcyjnego. Aktywuje to FBPazę2 a hamuje PFK2, obniżając poziom F-2,6-BP. W sytuacji odwrotnej, przy dużym stężeniu glukozy, enzym traci przyłączoną wcześniej grupę fosforanową, co prowadzi do wzrostu poziomu F-2,6-BP i w konsekwencji przyspiesza glikolizę.

Kinaza pirogronianowa

- kontroluje wypływ związków z tego szlaku.

- występuje kilka form tego enzymu, kodowanych przez różne geny. Typ L dominuje w wątrobie, a typ M w mięśniach i mózgu

- hamowana przez:

• ATP - allosterycznie, zwalnia szybkość glikolizy, gdy ładunek energetyczny kom. jest duży. Działa podobnie do alaniny

• Alanina (w wątrobie i w nerce) - przesuwa równowagę dimer-tetramer w stronę dimeru - formy mniej aktywnej.

- aktywowana przez:

• Fruktozo-1,6-bisfosforan (powoduje on asocjację 2 dimerów enzymu w tetrametr - formę bardziej aktywną).

*Aktywność katalityczna formy L jest regulowana przez odwracalną fosforylację. Enzym ufosforylowany wykazuje mniejszą aktywność. - Glukagon, wyzwalający kaskadę cAMP, powoduje fosforylację, zmniejszając aktywność enzymu. Zwiększenie stężenia jonów Ca²⁺ (indukowane np. przez wazopresynę), także powoduje fosforylację. Odwrotnie działa insulina, która ponadto przyspiesza transkrypcję genów kodujących ten enzym. Kontrola przez fosforylację zapobiega zużywaniu glukozy przez wątrobę, gdy jest ona bardziej potrzebna w mózgu i mięśniach.

Zestaw 83

1. Czynniki wpływające na metabolizm leków.

- czynniki genetyczne (gatunek, rasa, szczep)

- czynniki fizjologiczne (wiek, płeć, stan zdrowia, dieta, ciąża)

- czynniki fizyczne - np. wzrost temperatury obniża szybkość metabolizmu leków

- czynniki środowiskowe - zanieczyszczenia przemysłowe, środki ochrony roślin, leki, środki konserwujące

Związki chemiczne mają zróżnicowany wpływ na aktywność enzymów biorących udział w biotransformacji leków. Można je podzielić na:

- substancje przyspieszające metabolizm:

a) aktywatory - związki podwyższające aktywność enzymów

b) induktory - związki, które powodują wzrost ilości enzymów poprzez podwyższenie ich syntezy lub obniżenie procesów degradacji

- substancje zmniejszające szybkość metabolizmu:

a) inhibitory - związki obniżające aktywność enzymów

b) represory - związki obniżające ilość enzymów poprzez hamowanie ich syntezy(na etapie transkrypcji) lub przyspieszanie degradacji.

Aktywatory:

1. jony metali 2-wartościowych (działają prawdopodobnie przez zmianę struktury błon mikrosomalnych, ułatwiając w ten sposób interakcję substratu z cytochromem P-450 oraz transport ee w systemie mikrosomalnym)

2. hemoglobina uwolniona w trakcie hemolizy

3. aceton w niskim stężeniu (jako ciało ketonowe)

4. lotne anastetyki (halotan)

5. poliaminy (spermina, spermidyna, putrescyna) - stabilizują kompleks cyt.P-450-O₂ lub powodują wzrost szybkości transportu ee z reduktazy na CYP450

6. czynniki cytoplazmatyczne (ułatwiają tworzenie kompleksu COP450 z lekiem

Induktory :

1. policykliczne węglowodory aromatyczne (benzopiren w dymie tytoniowym i z grilla, 3-metylocholantren)

2. poch. kwasu barbiturowego (np.fenobarbital)

3. sterydy (deksametazon)_

4. etanol, aceton - w dużych stężeniach

5. leki hipolipidemiczne (klofibrat)

6. antybiotyki makrolidowe (erytromycyna)

Związki te różnią się właściwościami fizyki-chemicznymi, zdolnością indukowania enzymów biorących udział w metabolizmie leków oraz różnych form molekularnych CYP450.

Wpływ fenobarbitalu. Powoduje on powiększenie wątroby, rozrost siateczki endoplazmatycznej wątroby, wzrost syntezy białek mikrosomalnych oraz fosfolipidów, wzrost aktywności oksydoreduktazy NADPH:cytochrom P-450, UDP-glukuronylotransferazy, wzrost zawartości cytochromu P-450 (głównie izoenzymów 2B1, 2B2)

Wpływ policyklicznych węglowodorów aromatycznych: wzrost zawartości cytochromów P-450 1A1, 1A2.

Ze zdolnością indukującą ksenobiotyków związane są następujące właściwości:

• rozpuszczalność w lipidach - im większa tym związek indukujący może łatwiej przeniknąć do wnętrza kom.

• akumulacja - dla wywołania indukcji konieczne jest utrzymywanie przez dłuższy czas odpowiedniego poziomu w kom.

• zdolność do reagowania z CYP450

Istnieje kilka przyczyn zwiększonego poziomu enzymów metabolizujących leki w warunkach indukcji:

1. wzrost szybkości transkrypcji genów strukturalnych oraz procesów translacji

2. szybkość transportu mRNA do cytoplazmy

3. większa stabilność mRNA

4. obniżenie procesów degradacji białek

Enzymy biorące udział w metabolizmie leków i ulegające indukcji: oksydoreduktaza NADPH:cytochrom P-450, cytochrom P-450, oksydoreduktaza NADH:cytochrom b₅, cytochrom b₅, UDP-glukuronylotransferaza, S-transferaza glutationowa, syntetaza ∆-ALA.

Inhibitory: - zmniejszają aktywnośc CYP450

1. tlenek węgla (łączy się ze zredukowanym cytochromem P-450)

2. metyrapon (hamuje prawdopodobnie inkorporację „aktywnego atomu tlenu” do cząsteczki substratu

3. inhibitory metaboliczne - związki, które łącząc się z cytochromem P-450 ulegają przekształceniu do intermediatów wykazujących silne powinowactwo do cytochromu P-450. Powstają tak stabilne kompleksy, że uniemożliwiają dalszy udział cytochromu P-450 w reakcjach utleniania innych substratów. Kompleksy te tworzą się w obecności NADPH, O₂, są to m.in. pochodne amfetaminy, sulfanilamidu, pochodne nitrozowe.

Represory: CCl₄, CS₂ - obniżają poziom cytochromu P-450

-obniżenie zawartości cytochromu P-450 wywołują także związki przyspieszajace degradację hemu, np. allobarbital. Za efekt działania tej grupy związków odpowiedzialne są ich aktywne metabolity - epoksydy.

- inaktywacja do cytochromu P-420 (detergenty,czynniki reagujące z grupami SH)

Do czynników obniżających szybkość metabolizowania leków zalicza się również czynniki działające niszcząco na układ NADP i NADPH+H⁺ oraz inhibitory oksydoreduktazy NADPH:cytochrom P-450 (chloramfenikol, morfina) oraz wit.C, która obniża szybkość metabolizowania leków.

Zestaw 84

1. Cytochromy P-450 i b₅ - lokalizacja, udział w metabolizmie związków endogennych.

Udział cytochromu P-450 w metabolizmie związków endogennych

. enzymy układu monooksygenaz (oksydazy o mieszanej funkcji) biorące udział w metabolizmie leków

a) zlokalizowane w błonach siateczki śródplazmatycznej (przede wszystkim komórek wątroby)

b) biorą udział w utlenianiu związków endogennych (sterydów, aminokw., kw. tłuszcz., prostaglandyn, kw. żółciowych, poch. wit. D₃) oraz egzogennych (ksenobiotyków)

c) katalizuje reakcję: NADPH + H⁺ + O₂ + RH
NADP⁺ + H₂O + ROH

RH - substrat utleniany ; ROH - hydroksylowany metabolit substratu

7. wykorzystuje 2 systemy transportu elektronów:

• I - system transportu elektronów zależny od NADPH + H⁺ jako dawcy elektronów

• II - system transportu elektronów zależny od NADH + H⁺ jako dawcy elektronów







NADPH + H⁺ - - - - -> Oksydoreduktaza - - - - - --> Cytochrom P-450 RH



NADPH: Cyt.P-450 ↑ O₂+2H⁺

| ROH




Fosfolipidy | Kw. nas.





NADH + H⁺
- - - - - -> Oksydoreduktaza - - - - - - -> Cyt.b₅ - - - - - -> Desaturaza



NADH:cyt. b₅ kwasów tłuszcz. Kw nienas.

• 
  
  
  I system transportu elektronów składa się z oksydoreduktazy NADPH:cytochrom P-450 i cytochromu P-450. Białka te są zanurzone w fosfolipidach błonowych (głównie w fosfatydylocholinie - tworzy ona hydrofobowe środowisko, umożliwiające utworzenie funkcjonalnego kompleksu oksydoreduktazy z cytochromem P-450 oraz ułatwia dotarcie i przyłączenie litofilnych substratów do cyt.P-450).

• Cytochrom P-450

- końcowa oksydaza systemu transportu elektronów zależnego od NADPH

- bierze bezpośredni udział w wiązaniu substratu, wiązaniu cząsteczki O₂ oraz w inkorporacji atomu tlenu do substratu. Drugi atom tlenu jest zużywany o tworzenia wody. Energia uzyskana podczas syntezy wody umożliwia wprowadzenie atomu tlenu do cząsteczki substratu.

- w specyficznych warunkach katalizuje tworzenie anionów nadtlenkowych oraz wolnych rodników tlenowych, będących inicjatorami peroksydacji lipidów lub oksydacyjnej degradacji hemu.

- może wykazywać właściwości:

a) monooksygenazy: RH + NADPH + H⁺ + O₂ - - - -> ROH + NADP⁺ + H₂O

b) oksydazy : NADPH + H⁺ + O₂ - - - -> NADP⁺ + H₂O₂, np. przy niedoborze substratu, na skutek mutacji punktowej, która zmienia 1 aminokw. W centrum aktywnym cytochromu.

c) peroksydazy: RH + XOOH - - - -> ROH + XOH XOOH - cykliczny nadtlenek

przy nieobecności tlenu, reduktazy i NADPH

- Mechanizm działania :

I. Utl. forma cytochromu P-450 ( Fe³⁺) reaguje odwracalnie z cząsteczką substratu, tworząc kompleks cytochrom P-450 - substrat.

II. Powstały kompleks ulega jednoelektrodowej redukcji przy udziale oksydoreduktazy NADPH: cytochrom P-450.

III Do zredukowanego kompleksu przyłącza się cząsteczka tlenu, tworząc potrójny kompleks „oksytocytochrom” P-450 - lek.

IV.Następuje przeniesienie elektronu z Fe²⁺ na cząsteczkę tlenu przekształcając ją w rodnik ponadtlenkowy (rodnik ten może oddysocjować od kompleksu i w wyniku dysmutacji przekształcić się w H₂O₂ - przy niedostatecznym wysyceniu układu tlenem).

V. Powstały w ten sposób kompleks ulega powtórnej redukcji. Elektron może pochodzić z oksydoreduktazy NADPH:cytochrom P-450 lub z cytochromu b₅. Z powstałego „peroksycytochromu” może uwolnić się jon nadtlenkowy, który po protonacji przekształca się w nadtlenek wodoru.

VI. Jon nadtlenkowy ulega dysocjacji na tlen atomowy oraz jon tlenkowy, który po protonacji tworzy cząsteczkę wody. Drugi atom tlenu tzw. „aktywny tlen” zostaje połaczony z cytochromem P-450.

VII. Powstaje wolny rodnik substratu i reaktywna forma tlenu.

VIII. „Aktywny atom tlenu” zostaje przeniesiony na cząsteczkę substratu (między C a H)

IX. Kompleks utlenionej formy cytochromu P-450 z utlenionym substratem ulega spontanicznemu rozpadowi a utleniona forma cytochromu P-450 może wejść do następnego cyklu reakcji.

CYP450 11A,B, 17,19,21 biorą udział w syntezie hormonów steroidowych w nadnerczach i gonadach

Oprócz różnorodnych funkcji katabolicznych bierze udział w syntezie sterydów w nadnerczach, w

biosyntezie kwasów żółciowych i wit. D₃ w wątrobie oraz w degradacji hemu. W nadnerczach cytochrom P-450 występuje w błonie mitochondrialnej. Bezpośrednim donorem elektronów dla mitochondrialnego cytochromu P-450 jest białko żelazosiarkowe - adrenodoksyna, która ulega redukcji przez reduktazę NADPH:adrenodoksyna. Reduktaza NADPH: adrenodoksyna jest flawoproteiną zawierającą FAD. Transport odbywa się następująco:

NADPH + H⁺ ---->reduktaza NADPH:adrenodoksyna -----> adrenodoksyna ---->cytochrom P-450

Adrenodoksyna przekazuje na cyt. P-450 obydwa elektrony (w 2 etapach).

Układ mitochondrialnej monooksygenazy współdziała z 2 hydroksylazami. Pierwsza atakuje specyficznie cholesterol i odszczepia jego łańcuch boczny, natomiast druga hydroksyluje pozycję 11β w pierścieniu.

W błonie jądrowej zawarty jest także układ monooksygenazy analogiczny do zawartego w błonach siateczki śródplazmatycznej, co stwarza niebezpieczeństwo interakcji pomiędzy kwasami nukleinowymi a powstającymi aktywnymi metabolitrami, np. epoksydami i może prowadzić do efektów toksycznych i genotoksycznych (może powodować mutacje)

• Ogromna różnorodność substratów i typów reakcji katalizowanych przez cytochrom P-450 możliwa jest

dzięki występowaniu wielu form molekularnych cytochromu P-450 o różnych, chociaż nakładających się specyficznościach substratowych. U człowieka wyizolowano ponad 100 różnych izoenzymów cytochromu P-450. Kazda forma molekularna cytochromu P-450 jest produktem innego genu.

Udział cytochromu b₅ w biosyntezie kwasów tłuszczowych nienasyconych

Synteza nienasyconych kw. tłuszcz.:

- następuje z odpowiednich nasyconych kwasów tłuszcz.

- pierwsze wiązanie podwójne jest wprowadzane prawie zawsze w poz. ∆⁹

- jest katalizowana przez układ enzymatyczny ∆⁹-desaturaza, z udziałem NADH:

1. Oksydoreduktaza NADH:cytochrom b₅ :

- flawoproteina zawierająca FAD jako grupę prostetyczną

- jej zadaniem jest przenoszenie elektronów z NADH na cytochrom b₅

B) Cytochrom b₅:

- białko zawierające jako grupę prostetyczną żelazoporfirynę III

- przenosi elektrony na desaturazę kw. tłuszcz.

- może być też donorem elektronów dla cyklicznych reakcji z udziałem cytochromu P-450

C) Desaturaza kw. tłuszczowych

- białko zawierające niehemowo związane Fe, które ma zdolność pobierania elektronów ze zredukowanego cytochromu b₅

- katalizuje desaturację kw. tłuszcz.

- jest wrażliwa na jony cyjankowe

- zredukowana forma Fe (Fe²⁺) pozwala na interakcje z tlenem i nasyconymi łańcuchami acylo-CoA, stanowiącymi substraty reakcji. Podczas tworzenia wiązania podwójnego uwalniane są 2 cząsteczki wody. 2 elektrony pochodzą z NADH, 2 z pojedynczego wiązania substratu.

- zwierzęta nie mogą syntetyzować kwasu linolowego ani linolenowego, więc należy te kwasy dostarczać z pożywieniem. Służą one do syntezy innych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, należących do rodziny ω6 i ω3, np. kwasu arachidonowego.

2. Hormony działające przez cAMP

Większość hormonów peptydowych jest rozpuszczalna w wodzie, nie wiąże się z białkami nośnikowymi, zapoczątkowuje odpowiedź hormonalną wiążąc się z receptorem w błonie cytoplazmatycznej. W mechanizmie działania tych hormonów biorą udział śródkomórkowe przekaźniki. Wiele hormonów działa za pośrednictwem cAMP jako drugiego przekaźnika. Zaliczamy do nich: glukagon, hormon somatotropowy(STH), tyreotropowy(TSH), adrenokortykotropowy(ACTH), parathormon(PTH), wazopresyna (przez receptory V₂), adrenalina, noradrenalina, angiotensyna II, folitropina(FSH), kalcytonina, kortykoliberyna(CRH), lutropina(LH), melanotropina(MSH), somatostatyna.

- Mechanizm działania:

1. Połączenie z receptorem. Receptory te to białka integralne błon kom., a hormon jest dla nich aktywatorem allosterycznym. Związanie cząsteczki hormonu przez receptor indukuje zmiany konformacyjne w białku receptorowym. Zmiany te powodują pobudzenie tzw. białek G. Białka G należą do homologicznej rodziny białek wiążących nukleotydy guanylowe. Przy braku hormonalnego sygnału tworzą heterotrimer αβγ, związany z GDP. Oddziaływanie hormonu z receptorem stymuluje wypieranie GDP i przyłączanie GTP do białka G pod wpływem jonów magnezu. W następstwie tego procesu od kompleksu oddysocjowuje podjednostka α.

*Hormony mogą albo pobudzać , albo hamować powstawanie cAMP. 2 równoległe układy, jeden pobudzający (s) i jeden hamujący (i) umiejscowione są na pojedynczej cząsteczce katalitycznej. Każdy z nich składa się z receptora R_s lub R_i oraz z kompleksu regulatorowego G_s i G_i. Podjednostki β i γ białka G_s są identyczne z podjednostkami białka G_i­. Natomiast podjednostki α tych białek różnią się. Podjednostka α_s wykazuje aktywność GTP-azową, zaś jej aktywna postać α_s-GTP ulega inaktywacji przez hydrolizę GTP do GDP. Odnowieniu ulega trimeryczna postać kompleksu G_s.

Podjednostka α_i także wykazuje aktywność GTP-azową, ale GDP nie odszczepia się swobodnie od kompleksu α_i-GDP. Reaktywacja podjednostki α_i odbywa się na drodze wymiany GDP na GTP.

2. Oddysocjowanie podjednostki α wywołuje aktywację cyklazy adenylanowej. W następstwie aktywacji tego enzymu syntetyzowany jest cAMP z ATP(cyklaza katalizuję tą reakcję) i informacja hormonalna jest przekazywana do wnętrza komórki za pośrednictwem cAMP. cAMP jest syntetyzowany w drodze cyklizacji ATP, w której grupa 3'- OH jednostki rybozy atakuje α-fosforanową grupę ATP tworząc wiązanie fosfodiestrowe z równoczesnym uwolnieniem pirofosforanu. Energii do tej reakcji dostarcza hydroliza pirofosforanu, katalizowana przez pirofosfatazę.

3. cAMP aktywuje kinazę białkową A, łączy się z jej podjednostkami receptorowymi i umożliwia oddysocjowanie podjednostek katalitycznych, które katalizują fosforylację reszt serynowych lub treoninowych białek. Kinaza białek jest cząsteczką heterotetrameryczną , złożoną z 2 podjednostek regulatorowych (R) regulatorowych 2 katalitycznych(C). Kompleks R₂C₂ nie wykazuje aktywności enzymatycznej,ale po związaniu cAMP z R dochodzi do odłączenia R od C, przez co aktywacji ulega C.

4. W wyniku zadziałania kinaz białkowych A dochodzi m.in. do aktywacji fosforylazy glikogenowej i lipazy triacyloglicerolowej oraz inaktywacji syntezy glikogenowej, dehydrogenazy pirogronianowej i zmniejsza ruchliwość nośnika glukozy i aminokwasów w błonie kom.

5. Działanie hormonów powodujących zwiększenie stęż. cAMP w kom. może zostac zakończone kilkoma sposobami, w tym przez hydrolizę cAMP(do 5'-AMP) katalizowana przez fosfodiesterazę. Fosfodiesteraza podlega regulacji zarówno hormonalnej, jak i np. przez Ca²⁺.

Efekt działania hormonów jest zróżnicowany narządowo, np. działanie glukagonu dotyczy głównie wątroby, ponieważ nie ma on receptorów w mięśniach, natomiast działanie adrenaliny dotyczy obydwu narządów. Przy czym jest silniej wyrażone w mięśniach. Pozostałe receptory zlokalizowane są odpowiednio: PTH - w kościach i nerce, ACH - w nadnerczach, TSH - w tarczycy, wazopresyny w naczyniach krwionośnych.

---