Tytuł:

Ćwiczenie nr 2 "Mikrobiologiczna analiza jakości wód"

2. Data odbycia ćwiczenia 21 marca, 28 marca 2007

Cel ćwiczenia :

Celem ćwiczenia jest określenie klasy czystości wód jak również stwierdzenie jakie bakterie występują w badanej próbce wody ze zwróceniem szczególnej uwagi na bakterie grupy Escherichia coli typu kałowego.

Wstęp teoretyczny:

Wstęp teoretyczny obejmuje podstawowy zbiór informacji na temat bakterii, których obecność potwierdzamy lub wykluczamy w toku przeprowadzanych analiz, oraz podział klas czystości wód ze względu na obecność w nich bakterii Escherichia coli typu kałowego.

Pałeczki rodzaju Escherichia fakultatywnie tlenowe, Gram-ujemne, należące do Enterobacteriaceae, są bardzo rozpowszechnione w przyrodzie. Spotyka się je powszechnie w roślinach, glebie, wodzie, ściekach. U człowieka i zwierząt żyją w przewodzie pokarmowym jako symbionty, lecz w pewnych warunkach mogą wywołać różne, nierzadko śmiertelne schorzenia. Do tej grupy należy m.in. gatunek Pałeczka okrężnicy - Escherichia coli . Bakterie te nie wytwarzają przetrwalników. Spotyka się je w ziemi, w jelicie człowieka i zwierząt. Powszechnie występują w ściekach, gdzie trafiają wraz z wydzielinami i z kałem. Ich obecność w wodzie świadczy o zanieczyszczeniu jej kałem. Mogą być przyczyną durów lub czerwonki. U człowieka pałeczka okrężnicy może wywołać stany zapalne dróg moczowych (miedniczek nerkowych i pęcherza), dróg żółciowych (woreczka żółciowego i przewodów żółciowych), zapalenie opon mózgowych, posocznice, otrzewnej, opon mózgowo - rdzeniowych uważa się ją także za przyczynę biegunek u dzieci (odmiana neapolitańska. Escherichia coli wytwarza jady działające m.in. na układ nerwowy (neurotropowy), błonę śluzową przewodu pokarmowego (enterotropowy) i hemolizynę Virella).

Bakterie psychrofilne i mezofilne.

W skład bakterii występujących w powietrzu wchodzą różne rodzaje i gatunki tych mikroorganizmów. Biorąc pod uwagę ich wymagania temperaturowe dzielimy je na mezofilne i psychrofilne. Optimum wzrostu dla bakterii psychrofilnych wynosi około 20°C. Ich temperatura minimalna zbliża się do temperatury zamarzania środowiska, co mechanicznie hamuje rozwój bakterii. Temperatura maksymalna waha się od 25 do 30°C. Do grupy bakterii mezofilnych zaliczamy większość saprofitow i wszystkie drobnoustroje pasożytnicze. W zależności od gatunku bakterii optimum wzrostu waha się od 20 do 40°C; dla większości bakterii chorobotwórczych dla człowieka i zwierząt stałocieplnych zbliża się do temperatury organizmu, tj. około 37°C. Temperatura minimalna waha się zwykle od 10 do 25°C, a maksymalna od 40 do 45°C.

Podział na klasy czystości ze względu na miano coli (najmniejsza objętość w której jeszcze znajdujemy bakterie Escherichia, w naszym przypadku najmniejsze rozcieńczenie dla którego reakcja będzie pozytywna):

• I 1,0 i powyżej

• II 0.1 i powyżej,

• III 0.01 i powyżej

Miejsce poboru wody do badania: Kłodnica

Przebieg Ćwiczenia

Początkowo wykonano posiew do sześciu probówek uzyskując tym samym sześć stężeń badanej próbki wody (
). Posiew ten wykonano na podłożu Ejkmana (podłoże laktozowe z barwnikiem) z ułożoną do góry dnem rurką Durham. Wykonano także wgłębny posiew na sterylne płytki agarowe celem określenia czy w badanej próbie wody występują psychro i mezofile. Kolejnym krokiem było wykonanie badania potwierdzającego (posiew na podłoże laktozowe z fuksyną tzw. Endo) oraz wykonanie rozcieńczenia i zainfekowanie probówek z żółcią wołową (tj. z rurkami Durhama), która imituje warunki panujące w jelitach. Po 24. godzinach określono miano (najmniejsze rozcieńczenie, dla którego reakcja jeszcze jest pozytywna). W przypadku naszej sekcji było to rozcieńczenie
. Z tej probówki wykonano posiew sektorowy (redukcyjny) na Endo i do zieleni brylantowej oraz odczytano wynik badania mezofili. Następnie wykonano posiew rysowy z Endo na skosy agarowe (pobrano pojedynczą kolonię). Kolejnym krokiem wykonano posiew na szereg biochemiczny (dwa razy podłoże Clarka, raz woda peptynowa z tryptofanem i skos agarowy). Po wykonaniu tych czynności wykonano odczyt z szeregu biochemicznego tzn. wykonano odpowiednie reakcje oraz barwiono przygotowany przez sekcję preparat metodą Grama.

Test na wykrywanie indolu

Do probówki z wodą peptonowej z tryptofnem delikatnie dodawane są odczynniki Ehrlicha. Gdy po pewnym czasie pojawi się czerwona lub malinowa obrączka na granicy płynów świadczy to o tym, iż w próbce znajduje się indol. Określa się to jako wynik dodatni.

Reakcja z czerwienią metylenową

Po 3-4 dniach hodowli na podłożu Clarka dodajemy czerwień metylenową, następnie wstrząsamy probówkę. Jeżeli jej zawartość zabarwi się na czerwono znaczy to o zakwaszeniu podłoża. Określa się to jako pozytywny wynik próby. Barwa żółta to wynik negatywny.

Test na zdolności wykorzystywania cytrynianu jako źródła węgla.

W tym teście wykorzystywane jest podłoże Simmonsa.. Wynikiem dodatnim jest zmiana koloru z zielonego na niebieski.

Reakcja Voges-Proskauera

Stwierdza ona zdolność wytwarzania przez bakterie acetoiny. Do podłoża Clarka dodajemy 0,6 cm³ roztworu
- naftolu oraz 0,4 cm³ roztworu wodorotlenku potasu. Zawartość próbki mieszamy i wstawiamy do łaźni wodnej do temperatury
na 30-40 min. Występowanie po tym czasie intensywnego koloru czerwonego świadczy o tym, iż badany szczep to Escherichia coli.

Test na obecność oksydazy cytochromowej (skos agarowy)

Wyniki analiz

Pożywka i badanie	Czas inkubacji	Temperatura inkubacji [w stopniach Celsiusza]	Obserwacje lub reakcje charakterystyczne	Odczyt (wynik)
Badanie wstępne na podłożu Ejkmana	24h	37	Zmiana barwy z zielonej na żółtą	Zakwaszenie będące przyczyną zmiany barwy wskazuje na występowanie bakterii
Psychrofile	Sprawdzane za każdym pobytem w laboratorium	Pokojowa, ok. 20	Przerośnięta biomasa	Pozytywny, w próbie wody występowały psychrofile
Mezofile	Sprawdzane za każdym pobytem w laboratorium	37	Przerośnięta biomasa	Pozytywny, w próbie wody występowały mezofile
Badanie potwierdzające na podłożu Endo	24h	44	podłoże zmieniło kolor na różowy a w miejscach zainfekowanych ezą wyrosły kolonie bakterii o metalicznym kolorze	pozytywny
Zieleń brylantowa	24h	37	Zmętnienie, brak gazu w rurce	Próba wątpliwa
Posiew rysowy na skosy agarowe	Po 4 dniach (siane w piątek odczyt w poniedziałek)		Wzrost na pożywce	pozytywny
Zieleń brylantowa	Po 4 dniach	37	Zmętnienie, nadal brak gazu w rurce	Próba wątpliwa
Posiew na Endo metodą izolacji czystych kultur	Po tygodniu	44	podłoże zmieniło kolor na różowy a w miejscach zainfekowanych ezą wyrosły kolonie bakterii o metalicznym kolorze	pozytywny
Szereg biochemiczny
test na zakwaszenie, odczyn MR, Podłoże Clarka	Po tygodniu	37	Czerwona barwa	pozytywny
Test na wytwarzanie indolu, podłoże z tryptofanem	po tygodniu	37	Nie pojawia się malinowa obrączka	negatywny
Podłoże Clarka, Reakcja VP	Po tygodniu	37	Bark czerwonej obwódki	negatywny
Skosy agarowe (zdolność do wykorzystywania cytrynianu)	Po tygodniu	37	Skosy nie odbarwiły się (nie powstała oksydaza cytochromowa)	negatywny

Barwienie metodą Grama. Wynik: Bakterie Gram (-)

Wnioski:

Według przeprowadzonych przez nas testów w badanej próbie wody nie występuje szczep Escherichia coli typu kałowego świadczą o tym negatywne wyniki testu na wytwarzanie indolu oraz reakcji Voges-Proskauera. Nie można jednak wykluczyć występowania tych szczepów w Kłodnicy ponieważ pozytywne wyniki z podłoża Endo oraz wątpliwa próba w przypadku zieleni brylantowej wskazują, iż szczep ten prawdopodobnie występował, lecz był wyjątkowo nieliczny. Być może jest to wynikiem tego iż pobrana przez nas próbka była uboga w ten typ organizmów. Może to być spowodowane także faktem istniejącej między organizmami konkurencji, która także wpłynęła na obniżenie liczebności bakterii typu kałowego.

W badanej próbie wody zdecydowanie największą liczebność wykazywały bakterie psychro i mezofilne na co wskazuje wynik posiewu na płytki Petriego (przerośnięta biomasa).

Porównując uzyskany przez nas wynik miana (
) z normami zanieczyszczenia biologicznego wody załączonymi we wstępie teoretycznym stwierdzamy, iż w Kłodnicy występuje III klasa czystości wód co oznacza, iż jest ona niezdatna do spożycia, kąpieli, jest także nieużyteczna w przemyśle spożywczym oraz hodowli zwierząt.

Na podstawie uzyskanych wyników można przypuszczać, iż do Kłodnicy dostają się ścieki komunalne częściowo zawierające Escherichia coli typu kałowego, oraz prawdopodobnie wiele innych organizmów w tym także chorobotwórczych.

---