Ekstrakcja jest operacją służącą do rozdzielenia mieszanin ciał stałych i ciekłych. Rozdział następuje przez rozpuszczenie niektórych składników mieszaniny w rozpuszczalnikach. Proces ekstrakcji może zachodzić zatem w układach dwufazowych: ciało stałe - ciecz lub ciecz - ciecz.
Procesem tym rządzi prawo podziału Nernsta, które mówi, że substancja rozpuszczona dzieli się pomiędzy dwa nie mieszające się rozpuszczalniki w ten sposób, że w stanie równowagi stosunek stężeń substancji rozpuszczonej w obu rozpuszczalnikach jest stały w danej temperaturze.
Przygotowanie materiału biologicznego do ekstrakcji.
Przed przystąpieniem do ekstrakcji, w zależności od rodzaju badanego materiału, należy usunąć białka, lipidy i inne ciała balastowe.
Niekiedy należy dodatkowo wykonać hydrolizę.
ODBIAŁCZANIE
metoda siarczanowo- amonowa
Odbiałczanie przeprowadzane w temperaturze wrzenia wody
Do 50 g próbki dodaje się siarczan amonowy i za pomocą 1 M H2SO4 doprowadza się do pH=4
Uzyskana mieszaninę ogrzewa się do wrzenia i utrzymuje w tej temp. przez 3 min, po czym sączy się na gorąco, a osad na sączku przemywa wrzącą wodą, aż do uzyskania ok. 500 ml przesączu.
ODBIAŁCZANIE
-metod wolframowa
Nadaje się szczególnie do odbiałczania materiału zawierającego trucizny kwaśne lub obojętne
1 cz. materiału homogenizuje się z 1cz. 25% roztworu wolframianu sodowego i 1cz. wody
Mieszaninę przenosi się do kolby, homogenizator przepłukuje 4 częściami wody
Po podaniu 1 cz. 50% roztworu disiarczanu sodowego ogrzewa się na łaźni wodnej ,aż przestanie ciemnieć, sączy lub wiruje
ODTŁUSZCZANIE
W przypadku nadmiernej ilości tłuszczów można je usunąć przez wymrażanie luk ekstrakcję lekka benzyną z wyraźnie kwaśnego środowiska
Hydroliza
Przeprowadza się w celu rozbicia połączeń z kwasem glukuronowym oraz siarkowym
Połączenia z kwasem siarkowym hydrolizowane są już w czasie kilkunastominutowego ogrzewania z rozcieńczonymi kwasami
Glukuroniany hydrolizują po ogrzaniu ze stężonymi kwasami w proporcji 1:1 w temperaturze powyżej 100°C
Glukuroniany mogą też ulec rozłożeniu pod wpływem glukuronidazy. Metodę tę stosuje się do oznaczania środków uzależniających, np.: morfiny, pochodnych benzodiazepiny, metakwalonu, trójpierścieniowych leków przeciwdepresyjnych, salicylanów
W stosunku do leków zasadowych, takich jak amitryptylina, chloropromazyna, pochodnych benzodiazepin, można używać też enzymu bakteryjnego - proteazy alkalicznej
Ekstrakcja
Pierwszą metodę ekstrakcji do celów analizy toksykologicznej opracował Stass w 1851 r. i było to wyizolowanie nikotyny z materiału sekcyjnego.
W kilka lat później w 1856 r. metodę tę zmodyfikował Otto.
Stosowana od lat metoda Stass-Otto stanowi obecnie klasyczny tok postępowania w przypadku analizy toksykologicznej trucizn organicznych z materiału biologicznego.
Ekstrakcja
Przed przystąpieniem do ekstrakcji materiał biologiczny rozdrabnia się, zakwasza kwasem winowym i zalewa podwójną ilością 96° etanolu, po czym ogrzewa na łaźni wodnej w temperaturze 50°C przez 24 godziny.
Po tym czasie wyciąg alkoholowy zlewa się przez sączek, a pozostałość ponownie wytrawia alkoholem. Proces ten powtarza się 3- 4-krotnie
Połączone wyciągi alkoholowe, po przesączeniu, odparowuje się w temp. 40-50°C, uwalniając od alkoholu, a następnie rozcieńcza wodą.
Przez kilkakrotne dodawanie kroplami na zmianę 96° alkoholu etylowego i zimnej wody uwalniamy ekstrakt od ciał balastowych
Przezroczysty roztwór wodny o konsystencji syropu poddaje się kolejnym ekstrakcjom, rozdzielając substancje nielotne na grupy.
1. Pierwsza grupa obejmuje substancje ekstrahujące się eterem z roztworu kwaśnego (np. kwas salicylowy, aspiryna, fenacetynu, barbiturowce, pestycydy chloro- i fosforoorganiczne).
2. Druga grupa to substancje ekstrahujące się eterem ze środowiska alkalicznego (roztwór alkalizuje się 10% roztworem NaOH). W grupie tuj znajduje m.in;
większość alkaloidów i związków syntetycznych o charakterze zasadowym (np. strychnina, papaweryna, atropina, chinina, kokaina, pochodne fenotiazyny). Po wyekstrahowaniu substancji drugiej grupy wodny roztwór zakwaszony kwasem solnym alkalizujemy amoniakiem.
3. Grupę trzecią stanowią trucizny ekstrahujące się eterem ze środowiska amoniakalnego (apomorfina). Ten sam roztwór po odparowaniu eteru poddajemy ekstrakcji gorącym chloroformem
4. Czwarta grupa substancji dających się wyekstrahować chloroformem z roztworu amoniakalnego (morfina).
5. Piątą grupę stanowią substancje pozostałe w roztworze wodnym, nie ekstrahujące się wymienionymi rozpuszczalnikami organicznymi.
Typy ekstrakcji
Typy ekstrakcji
WADY EKSTRAKCJI
• długotrwały tok wyosabniania trucizny;
• mała wydajność uniemożliwiająca niekiedy ilościowo oznaczenie trucizny w badanym materiale;
• uzyskiwanie ekstraktów zanieczyszczonych ciałami balastowymi;
• konieczność użycia dużej ilości materiału;
• zużycie znacznych ilości odczynników do ekstrakcji;
• powstawanie emulsji w toku ekstrakcji;
• niewystarczająca wykrywalność.
Solid Phase Extraction - SPE
Polega na przeniesieniu analitów, dzięki wykorzystaniu zjawiska podziału, z próbki ciekłej do fazy stałej, którą stanowią sorbenty
Stosuje się obniżone ciśnienie w celu elucji małych porcji rozpuszczalników
Zaczyna z powodzeniem zastępować ekstrakcję ciecz-ciecz, ponieważ pozbawiona jest większości jej wad
SPE - zalety
Możliwość izolacji i wzbogacania zarówno analitów lotnych, jak i nielotnych
Możliwość zastosowania zarówno do ekstrakcji składników organicznych, jak i nieorganicznych, np. metali
Możliwość przechowywania analitów zatrzymanych w warstwie sorbentu przez długi czas
SPE - zalety
Drastyczne zmniejszenie ilości używanych rozpuszczalników
Wyeliminowanie problemów związanych z tworzeniem się emulsji w procesie ekstrakcji (ciecz-ciecz), czy tez pienienia się próbki (ciecz-gaz)
Możliwość wykorzystania nie tylko w procesie izolacji i wzbogacania, ale także w trakcie oczyszczania i frakcjonowania ekstraktów
SPE - zalety
Duży wybór stałych sorbentów umożliwia uzyskanie znacznej selektywności procesu wzbogacania, co poważnie zmniejsza ryzyko interferencji na dalszych etapach procesu analitycznego
Wysoka powtarzalność procesu
Łatwość automatyzacji procesu
Wypełnienia kolumn SPE
Wypełnienia kolumn SPE
Wypełnienia kolumn SPE
Dobór fazy stałej i eluentu zależny jest od rozpuszczalności, polarności, właściwości chemicznych izolowanych analitów, ich ilości, objętości próbki, stopnia zanieczyszczenia, złożoności matrycy, a także wpływu matrycy lub innych analitów.
SPE - zastosowanie
SPE stosowana jest do prób osocza, surowicy, śliny, potu, włosów
Stosowanie jej do prób krwi pełnej, tkanek i narządów musi być poprzedzone izolowaniem wstępnym
W zależności od rodzaju badanego materiału, należy usunąć białka, lipidy i inne ciała balastowe. Niekiedy należy dodatkowo wykonać hydrolizę
Odbiałczanie
Można stosować rożne substancje: kwas wolframowy, nadchlorowy, trichlorooctowy, alkohol etylowy, mieszaninę alkoholu etylowego i kwasu winowego, siarczan amonowy, czy alkaliczny r-r siarczanu cynku
Proces prowadzi się w temp 60-100 şC, co jest czynnikiem przyśpieszającym, a także zwiększa rozpuszczalność w wodzie związków trudno rozpuszczalnych
Odbiałczanie
Najczęściej stosuje się metody:
Siarczanowo-amonową
Wolframową
Metoda wolframowa nadaje się szczególnie do materiału biologicznego zawierającego trucizny o charakterze kwaśnym i obojętnym. Mniej przydatna dla związków zasadowych.
Metoda siarczanowo-amonowa
Do 50 g próbki dodaje się siarczan amonowy i 1M kwas siarkowy do pH 4. Mieszaninę ogrzewa się do wrzenia i w tej temperaturze utrzymuje się przez 3 minuty, po czym sączy się na gorąco, a osad na sączku przemywa wrząca woda, aż do uzyskania 500ml przesączu.
Metoda wolframowa
1cz. materiału homogenizuje się z 1cz. 25% r-r wolframianu sodowego i 1cz. wody. Mieszaninę przenosi się do kolby, homogenizator przepłukuje 4cz. wody. Po podaniu 1cz. 50% r-r disiarczanu sodowego, mieszaninę ogrzewa się na łaźni wodnej, aż przestanie ciemnieć, sączy się lub wiruje. Przesącz ekstrahuje rozp. organicznymi tj.: chloroform, eter, octan etylu.
SPE - schemat kolumny
SPE - tok postępowania
Kondycjonowanie kolumienek
Podanie próbki
Przemywanie
Elucja
SPE - kondycjonowanie kolumn
Proces polega na aktywacji materiału wypełniającego przed naniesieniem próbek. Rodzaj rozpuszczalnika zależy od materiału wypełniającego kolumienkę i rodzaju analizowanego związku.
SPE - podanie próbki (adsorpcja)
Objętość próbki: od kilku mikronów do litrów. Dla maksymalnej wydolności systemu nie powinna przekraczać 250ml w odwróconym układzie polarności. Szybkość prowadzenia procesu jest czynnikiem decydującym o retencji wielu składników.
SPE - przemywanie
W celu oczyszczenia pozostających w materiale wypełniającym kolumienkę - przemyć roztworem, w którym próbka była rozpuszczona, lub innym, nie wypłukującym interesujących nas związków.
SPE - elucja
Przemycie kolumienek małymi porcjami (200mcl do 2ml) r-rów mających zdolność wyrugowania oznaczanych związków.
Większa wydajność procesu zachodzi przy stosowaniu mniejszych objętości eluentu.
Rzadziej: ekstrakcja nadkrytyczna, czy desorpcja termiczna.
Użycie dwóch lub więcej kolumienek z rożnymi adsorbentami umożliwia wstępne rozdzielenie analitu na grupy związków, co podnosi czułość i selektywność metody.
SPE - ograniczenia/wady
Rurki sorpcyjne i kolumienki ekstrakcyjne:
Stosunkowo łatwo następuje mechaniczne zatkanie porów materiału adsorbującego, zwłaszcza jeśli próbka nie była uprzednio filtrowana
Strumień próbki można przepuszczając przez złoże sorbentu w ograniczonym zakresie natężeń przepływu, co może istotnie przedłużyć czas ekstrakcji
SPE - ograniczenia/wady
Dlatego też, coraz powszechniejsze staja się krążki ekstrakcyjne
SPE - zalety krążków ekstrakcyjnych
Przyspieszenie wzbogacania dzięki możliwości zwiększania przepływu przez urządzenie ekstrakcyjne
Brak efektu `kanalikowania' złoża
Mała objętość martwa
Łatwość suszenia krążka przed elucją zatrzymanych analitów
Jednym z kierunków badan mających doprowadzić do wytworzenia tzw. szybkich krążków ekstrakcyjnych, które mogą znacznie skrócić czas ekstrakcji, są prace nad wykorzystaniem krążków na matrycy z włókna szklanego.