Metody stosowane w biologii molekularnej  badanie genomu
Diagnostyka molekularna
Dział medycyny molekularnej wykorzystującej analizę kwasów nukleinowych do:
·ð Rozpoznawania chorób
·ð Zrozumienia mechanizmu ich powstawania
·ð Prób zapobiegania chorób i ich leczenia
1985 rok  odkrycie techniki PCR
Wprowadzenie analizy DNA do rutynowych technik diagnostycznych.
Etapy postępowania z DNA:
·ð Pobranie materiaÅ‚u
·ð Izolacja DNA
·ð Ocena iloÅ›ci i czystoÅ›ci izolatu DNA
·ð Amplifikacja  powielanie fragmentu DNA
·ð Detekcja produktu amplifikacji  elektroforeza w żelu agarozowym
·ð Wykrywanie mutacji lub polimorfizmów
Analiza DNA
y
ródła DNA do badań molekularnych
·ð Limfocyty krwi obwodowej
·ð Hodowle fibroblastów skóry
·ð Komórki nabÅ‚onkowe
·ð Cebulki wÅ‚osowe
·ð Komórki szpiku kostnego
·ð Fragment dowolnej tkanki (guzy nowotworowe, bioptaty, wycinki)
·ð Dowolny materiaÅ‚ biologiczny (surowica, mocz, kaÅ‚, pÅ‚yny z jam ciaÅ‚a)
·ð 1 lub 2 blastomery pobrane z 8-komórkowego zarodka  badania preimplantacyjne
·ð Komórki pÅ‚ynu owodniowego, komórki trofoblastu, erytroblasty pÅ‚odu obecne we krwi matki
 badania prenatalne
Erytroblasty
·ð PojawiajÄ… siÄ™ w krwi obwodowej matki ok. 6 tyg. ciąży
·ð Ok. 1 na 103-107 jÄ…drzastych komórek w matczynej krwi jest pochodzenia pÅ‚odowego
·ð W celu  wyÅ‚apania erytroblastów pÅ‚odu wykorzystuje siÄ™ sortery komórek  rozpoznajÄ…ce
antygeny erytroblastów (CD71)
o W technice MACS (Magnetic Assisted Cell Sorting) używa się kuleczek magnetycznych
opłaszczonych specyficznych przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi
przeciwko antygenom komórkowym erytroblastów (anty-CD71).
1
Zasady pobierania materiału do badań
Krew do badań molekularnych:
·ð min. 1 ml krwi peÅ‚nej pobranej w sposób jaÅ‚owy
·ð antykoagulant  EDTA (stęż. KoÅ„cowe 0,1%) lub cytrynian sodu
·ð nie należy używać heparyny, która hamuje aktywność polimerazy DNA już w stężeniu 0,05 IU
/ mieszaninę reakcyjną oraz inhibuje niektóre enzymy restrykcyjne
·ð izolacja DNA  w dniu pobrania materiaÅ‚u lub po zabezpieczeniu
·ð przechowywanie: do 48 h w temp. +4oC
> 48 h w temp.  20oC lub -80oC
Szpik kostny:
·ð 1-5 ml szpiku pobranego na EDTA lub cytrynianu sodu
·ð Transport do laboratorium w temp 4oC w ciÄ…gu 24 h
Guzy nowotworowe, bioptaty, wycinki:
·ð Pobranie do sterylnych probówek i zamrożenie natychmiast po pobraniu (-20oC lub -80oC)
·ð Natychmiastowa homogenizacja i izolacja
·ð Umieszczenie Å›wieżo pobranych tkanek w buforze do lizy i zamrożenie
Materiał suchy (plamy, wysuszone wymazy):
·ð Przechowywany w kopertach w temp. Pokojowej
Materiał biologiczny do badań molekularnych można przechowywać jako:
·ð ZamrożonÄ… tkankÄ™
·ð Lizat umieszczony w buforze (bufor do lizy: 100 mM Tris-HCL, 40 mM EDTA, 0,2% SDS, pH
8.0)
·ð Wyizolowany preparat DNA
Wydajność izolacji oraz jakości DNA obniżają się wraz z czasem przechowywania materiału.
Izolacja DNA
Cel: uzyskanie DNA o wysokiej jakości i czystości
Znanych jest wiele procedur izolacji DNA , w wyniku, których otrzymuje się DNA:
·ð biologicznie aktywne, chemicznie stabilne oraz wolne od RNA i biaÅ‚ek.
Ze względu na wielkość i wrażliwość chromosomalnego DNA praktycznie niemożliwa jest jego izolacja
w formie niezmienionej. Część DNA ulega mechanicznym uszkodzeniom (fragmentacja).
Metoda izolacji z użyciem zestawów kolumienkowych.
2
Komercyjne zestawy do oczyszczania kwasów nukleinowych  tzw. Izolacja na kolumnach
·ð kolumny do izolacji oczyszczania DNA i RNA  systemy oparte na zdolnoÅ›ci złóż
krzemionkowych do wiązania kwasów nukleinowych w obecności wysokich stężeń soli
chaotropowych ( chlorowodorek guanidyny, izotiocjanian guanidyny)
·ð sole chaotropowe ( chaotropes   czyniÄ…ce chaos ) w roztworach wodnych wprowadzajÄ…
silne zaburzenia w sieci wiązań wodorowych; powodują rozpad błon komórkowych i
denaturację białek, co sprzyja izolacji kwasów nukleinowych.
Izolacja DNA na kolumnach
1) wstępne przygotowanie
homogenizacja tkanek w buforze zawierającym stężone sole chaotropowe.
2) nałożenie preparatu na kolumny
minikolumny  przepływ roztworu przez membranę zawierającą złoża krzemionkowe uzyskuje
się w wyniku wirowania całej kolumny w mikrowirówce.
większe kolumny  roztwór przepływa grawitacyjnie. Złoża, przez które przechodzi roztwór,
wychwytują specyficzne dla nich kwasy nukleinowe (DNA lub RNA), pozostałe składniki roztworu,
stanowiące zanieczyszczenie, zostają zebrane w probówce znajdującej się poniżej filtra.
3) PÅ‚ukanie preparatu
Roztworami zawierajÄ…cymi sole chaotropowe lub buforami zawierajÄ…cymi etanol w celu
dokładnego odpłukania resztek zanieczyszczeń związanych z filtrem.
4) Wymywanie kwasów nukleinowych z kolumny
Po osuszeniu membrany, ze złoża odpłukuje się oczyszczone kwasy nukleinowe, nakładając
na kolumnę odpowiednią ilość wody lub buforu TE (Tris  EDTA)
Bufor Te ( Tris-EDTA)
·ð Tris (trihydroksyaminometan)  odpowiada za utrzyanie staÅ‚ego pH roztworu.
·ð EDTA  wiąże jony Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+ (kofaktory wielu enzymów nukleolitycznych
stanowiących zagrożenie dla przechowywanego DNA)
DNA należy przechowywać w +4 lub -20oC.
Zebrane z kolumny preparaty oczyszczonego DNA sÄ… wykorzystywane do dalszych analiz.
Zalety standaryzowanych systemów do oczyszczania kwasów nukleinowych
·ð Skrócenie czasu trwania eksperymentu
·ð Wyższa wydajność i czystość oczyszczonych prób
·ð Wyeliminowanie koniecznoÅ›ci pracy z substancjami szkodliwymi np. fenolem,
chloroformem
·ð Wysoka powtarzalność uzyskiwanych wyników
Metoda izolacji DNA fenolowo-chloroformowa
3
Wstępne przygotowanie materiału biologicznego
1. Oczyszczenie (od pozostałości innych komórek, resztek pożywki itp.)  przemywanie
buforami stabilizujÄ…cymi
2. Dezintegracja i liza komórek
·ð Homogenizacja (miÄ™kkie tkanki zwierzÄ™ce)
·ð Sonifikacja (zawiesina komórek)
·ð Rozcieranie (komórki roÅ›linne, bakteryjne)
·ð Liza detergentami (komórki z hodowli komórkowej)
·ð Liza enzymatyczna (komórki bakterii i drożdży)
3. Uwolnienie DNA i innych komponentów wewnątrzkomórkowych do roztworu, w którym
jest on rozpuszczalny i zabezpieczony przed degradacją  zawieszenie masy komórkowej w
odpowiednim buforze.
Rozpuszczenie DNA i liza komórek  roztwór soli (NaCl) zawierający Tris-HCL i EDTA:
·ð Tris-HCL  utrzymuje staÅ‚e, lekko zasadowe pH roztworu, co zmniejsza oddziaÅ‚ywania
elektrostatyczne pomiędzy DNA a zasadowymi białkami.
·ð EDTA wiąże jony metali (Cd2+, Mg2+, Mn2+), które mogÅ‚yby tworzyć sole z anionowymi
grupami fosforanowymi DNA oraz hamuje działanie deoksyrybonukleaz.
Inaktywacja enzymów nukleolitycznych  proteinaza K
4. Oddzielenie kwasu nukleinowego od pozostałych komponentów komórkowych
·ð Dysocjacja kompleksów DNA  biaÅ‚ko
·ð Sól sodowa siarczanu dodecylu (SDS):
Wiąże się z białkami i nadaje im silnie anionowy charakter, denaturuje
deoksyrybonukleazy i inne białka
·ð Sole w wysokich stężeniach (NaCl, NaClO4):
Zapewniają całkowitą dysocjację kompleksów DNA  białko
·ð Oddzielenie DNA od innych rozpuszczalnych komponentów komórkowych
Całkowite odbiałczanie roztworu  ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi, np.
mieszaninÄ… fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego.
Po odwirowaniu uzyskujemy 3 warstwy:
o Górna faza wodna  kwasy nukleinowe
o Dolna faza  organiczna
o Wąskie pasmo zdenaturowanego białka na granicy faz
5. Zagęszczenie preparatu DNA i usunięcie zanieczyszczeń małocząsteczkowych
·ð Dodanie etanolu lub izopropanolu:
Zmniejszenie rozpuszczalności DNA  tworzy on nitkowate osady, które można
zebrać przez odwirowanie.
·ð DNA po wytrÄ…ceniu i przemyciu 70% etanolem, pozostawia siÄ™ do wyschniÄ™cia.
·ð NastÄ™pnie zwiesza w maÅ‚ej objÄ™toÅ›ci wody lub buforu TE (Tris-EDTA):
·ð DNA należy przechowywać w +4 lub -20oC.
4
Co dalej z izolatem DNA?
Ocena czystości DNA metodą spektrofotometryczną
Spektrofotometria absorpcyjna
Wykorzystuje zjawisko pochłaniania (selektywnej absorpcji) promieniowania przez badane substancje
w celu ich wykrycia, identyfikacji lub ilościowego oznaczenia.
Cechą charakterystyczną każdej substancji chemicznej jest zdolność do absorpcji ściśle określonych
kwantów promieniowania z zakresu widma elektromagnetycznego.
W celu oceny czystości DNA mierzymy absorbancję światła o określonej długości fali (260nm i
280nm) przez roztwór DNA.
Dla kwasów nukleinowych maksymalna długość fali  260nm.
Dla białek maksymalna długość fali  280nm.
Stosunek A260/A280 dla czystego DNA powinien wynosić 1.8  2.0.
Wartość < 1.8 oznacza zanieczyszczenie białkami.
·ð Stężenie dwuniciowego DNA (źg/ml):
C = (A260-A320) x 50 x rozcieńczenie r-ru*
·ð Stężenie jednoniciowego DNA (np. starterów)
C = (A260-A320) x 33 x rozcieńczenie r-ru*
·ð Stężenie RNA:
C = (A260-A320) x 40 x rozcieńczenie r-ru*
*Najczęściej 100-krotne (wodą lub buforem TE)
Dostępne są spektrofotometry mierzące stężenie DNA w 1 źl roztworu np. NanoDrop.
Jakościowa ocena izolatów DNA
Elektroforeza w żelu agarozowym
·ð Wybarwienie bromkiem etydyny
·ð Ocena iloÅ›ciowa: porównanie fluorescencji (dÅ‚. Fali 312 nm) z preparatem o znanym
stężeniu.
·ð Ocena jakoÅ›ciowa: jeden wyraz
nie świecący i nierozmyty prążek  DNA dobrej jakości
(niepofragmentowane).
Uzyskany w wyniku izolacji DNA możemy powielić (amplifikować).
Powielamy fragment genu, który nas interesuje:
·ð W celu potwierdzenia jego obecnoÅ›ci (np. izolacji bakteryjnego DNA, znalezienie fragmentu
genomu bakterii = potwierdzenie infekcji).
·ð W celu wykrycia zmian w obrÄ™bie genu (prawidÅ‚owy/zmutowany).
5
Amplifikacja  powielenie wybranego fragmentu DNA
·ð 1983  Kary Mullis (ur. 1944) opracowaÅ‚ technikÄ™, którÄ… nazwaÅ‚ reakcjÄ… Å‚aÅ„cuchowÄ…
plimerazy.
·ð 1993  Nagroda Nobla w dziedzinie chemii.
Reakcja łańcuchowa polimerazy (Polymerase Chain Reaction)
·ð Enzymatyczna amplifikacja wybranych sekwencji DNA (replikacja DNA in vitro).
·ð Umożliwia powielenie w ciÄ…gu 2-3 godzin okreÅ›lonego odcinka DNA (fragmentu genu) w
milionowych ilościach kopii.
Aby powielić fragment DNA techniką PCR należy:
·ð Znać sekwencje nukleotydów obu koÅ„ców powielanego fragmentu (by dobrać parÄ™
starterów).
·ð Dysponować odpowiedniÄ… polimerazÄ… DNA i zestawem odczynników.
·ð Dysponować urzÄ…dzeniem do powielania DNA tzw. termocyklem (amplifikatorem).
Substraty reakcji PCR:
·ð Matrycowy DNA
·ð Enzym (polimeraza DNA)
·ð Startery
·ð dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP)
·ð Mg2+
·ð Bufor
·ð Wzmacniacz reakcji
·ð Woda
Matryca DNA
Otrzymywana przez denaturacjÄ™ termicznÄ… (topnienie=melting) dwuniciowego DNA w temp. 95oC 
powstają dwie cząsteczki jednoniciowe, z których każda służy jako matryca.
Polimerazy DNA
·ð Dawniej  termostabilna polimeraza DNA z E.coli.
·ð Dzisiaj  termostabilna polimeraza Taq z bakterii Thermophilus aquaticus.
·ð Optymalnie: 1-2 IU/20 źl mieszaniny reakcyjnej.
Startery (primers)
Kilkunasto- lub kilkudziesięciozasadowe (18-28 nt) oligonukleotydy otrzymywane na drodze syntezy
chemicznej.
Sekwencja jednego startera jest komplementarna do początku, a drugiego do końca powielanego
fragmentu.
6
Startery, przyłączają się do komplementarnych odcinków DNA, określają wielkość powielanego
fragmentu (końce 5` ograniczają wielkość amplifikowanego fragmentu).
Od starterów rozpoczyna się reakcja syntezy nowych nici, dokonywana przez odpowiednią
polimerazÄ™ DNA.
Polimeraza DNA katalizuje przyłączanie monofosforanów deoksyrybonukleozydów (dNMP) do wolnej
grupy 3`-OH na końcu łańcucha DNA.
Pomiędzy grupą 3`-OH jednego nukleotydu a grupą 5`-fosforanową drugiego powstaje wiązanie
fosfodiestrowe.
Kierunek polimeryzacji: 5` -> 3`.
7
Co mamy w probówce?
20 źl mieszaniny reakcyjnej zawiera:
·ð 10  100 ng matrycy
·ð 15 pmoli starterów
·ð 7,5 nmoli dNTPs
·ð MgCl2 w stęż. 1,5  2,5 mM
·ð 1  2 jednostki polimerazy
·ð WodÄ™ (do 20 źl)
Etapy reakcji PCR
·ð Termiczna denaturacja dwuniciowego DNA
·ð Hybrydyzacja czyli Å‚Ä…czenie starterów z matrycÄ…
·ð Elongacja (wydÅ‚użanie) Å‚aÅ„cucha DNA
Po ostatnim cyklu przeprowadza się inkubację w temp. 72oC przez 5-10 minut w celu dokończenia
niekompletnych syntez i pełnej hybrydyzacji jednoniciowych komplementarnych produktów.
Czynniki wpływające na efektywność PCR
·ð Temperatura i czas cyklu, liczba cykli
·ð Aktywność polimerazy DNA
·ð Jakość enzymu i buforu reakcyjnego
·ð Stężenie dNTPs
·ð Stężenie jonów Mg2+
·ð DÅ‚ugość starterów i ich stężenie
·ð ObjÄ™tość próbki reakcyjnej
·ð Ilość i czystość DNA (metoda izolacji)
·ð Typ termocyklera
8
W zoptymalizowanym systemie niewielka zmiana jednego lub kilku czynników będzie miała duży
wpływ na efektywność procesu.
Najbardziej czułymi na zmiany elementami reakcji PCR są:
·ð Stężenie jonów Mg2+
·ð Stężenie dNTPs
·ð Aktywność polimerazy Taq
·ð Zmiana profilu temperaturowego cyklu, a szczególnie zmiana temperatury doÅ‚Ä…czania
starterów
Gdy w przypadku zoptymalizowania parametrów reakcji PCR, wyniki są niesatysfakcjonujące, należy
rozważyć wpływ innych czynników mogących obniżać efektywność, takich jak np.:
·ð Natura natywnego materiaÅ‚u matrycy
·ð Stosowana metoda izolacji matrycowego DNA
·ð ZwiÄ…zki chemiczne użyte do izolacji DNA i w Å›ladowych iloÅ›ciach wprowadzone do próbki
reakcyjnej PCR
Specyficzność PCR
Temperatura hybrydyzacji starterów z matrycą:
·ð Czynnik krytyczny w optymalizacji specyficznoÅ›ci PCR
·ð Zależy od dÅ‚ugoÅ›ci starterów i skÅ‚adu zasad; zwykle dobierana empirycznie
·ð Zbyt niska temp.  niespecyficzne przyÅ‚Ä…czanie starterów
·ð Zbyt wysoka temp.  niemożliwe jest efektywne przyÅ‚Ä…czanie starterów
Diagnostyka mikrobiologiczna
a) Wykrywanie DNA lub RNA czynników zakaz
nych: wirusów, bakterii, pierwotniaków (PCR lub
RT-PCR)
·ð Drobnoustroje wolno rosnÄ…ce w hodowli np. M. tuberculosis lub nie rosnÄ…ce wcale
np. Treponema pallidum
·ð Helicobacter pylori  detekcja, okreÅ›lanie czynników wirulencji
·ð Borrelia burgdorferi  detekcja, okreÅ›lanie genogatunków
b) Wykrywanie genów oporności na antybiotyki
c) Ocena masywności zakażenia (stopnia wiremii lub liczby komórek bakteryjnych): RT-Q-PCR
Wewnętrzna lub gniazdowa PCR (nested PCR)
·ð Dwie pary starterów   zewnÄ™trzne i  wewnÄ™trzne
·ð W pierwszych cyklach zachodzi amplifikacja dÅ‚ugiego fragmentu DNA z udziaÅ‚em starterów
zewnętrznych
·ð Produkt reakcji ze starterami zewnÄ™trznymi staje siÄ™ matrycÄ… w drugiej PCR, która
wykorzystuje startery  wewnętrzne
·ð ZwiÄ™kszenie specyficznoÅ›ci
·ð Wzrost czuÅ‚oÅ›ci reakcji
9
·ð Zastosowanie: do celów diagnostycznych (eliminacja kontaminacji)
Multipleks PCR
·ð Jednoczesna amplifikacja kilku fragmentów DNA różniÄ…cych siÄ™ wielkoÅ›ciÄ…  użycie kilku par
starterów w jednej mieszaninie reakcyjnej
·ð Jednoczesna amplifikacja kilku regionów jednego lub kilku genów
·ð Fragmenty powinny różnić siÄ™ wielkoÅ›ciÄ… (detekcja!)
·ð Produkty reakcji multipleks mogÄ… być poddawane dalszej analizie (np. wykrywanie mutacji
punktowych lub polimorfizmów)
Izolacja RNA
·ð Metoda ChomczyÅ„skiego i Sacchi (modyfikacje z użyciem TRIZOLu), metoda kolumienkowa
·ð NietrwaÅ‚ość RNA  konieczność ograniczenia aktywnoÅ›ci rybonukleaz:
o Odczynniki wysokiej jakości
o Osobny zestaw pipet
o Końcówki z filtrem
o Sterylny sprzęt
o 0,1% r-r dietylopirowęglanu (DEPC)  inaktywacja RNaz
Izolacja RNA  z
ródła materiału
·ð Krew obwodowa
·ð Szpik
·ð Tkanki (wycinki, bioptaty, fragmenty guzów nowotworowych)
·ð Komórki jednojÄ…drzaste krwi obwodowej/szpiku
·ð Komórki z hodowli zaÅ‚ożonej do badaÅ„ cytogenetycznych utrwalone mieszaninÄ… kwasu
octowego i metanolu
·ð 3  6 źg RNA  ilość niezbÄ™dna do przeprowadzenia badaÅ„ molekularnych
Potrzeba:
o 1-2 x 107 komórek
o 10-20 ml krwi obwodowej
o 2-5 ml szpiku kostnego
Pobranych do probówek z EDTA lub cytrynianem sodu. Nie stosujemy heparyny!
Krew/szpik
·ð należy dostarczyć do laboratorium w ciÄ…gu 24 godzin od pobrania, a w tym czasie
przechowywać je w temp. 4oC.
·ð Unikać zamrażania i rozmrażania materiaÅ‚u  możliwość uwolnienia wewnÄ…trzkomórkowych
RNaz
·ð Przed ekstrakcjÄ… RNA z krwi  izolacja komórek jednojÄ…drzastych lub liza erytrocytów
Tkanki
·ð Przechowywanie i transport w temp. 4oC do 24 h od pobrania w jaÅ‚owym pojemniku
10
·ð Najlepiej na suchym lodzie lub w parach ciekÅ‚ego azotu
·ð RNAlater  stabilizuje RNA i chroni przez dziaÅ‚aniem rybonukleaz (odpowiednia proporcja
objętości odczynnika do tkanki)
·ð Homogenizacja i izolacja wg protokoÅ‚u producenta zestawu
Dostępne są zestawy do pobrania krwi obwodowej/szpiku, zawierające związki stabilizujące RNA w
komórkach i pozwalające na dłuższe przechowywanie próbek przed izolacją RNA.
Sposób dostarczenia i przechowywania materiału powinien być wcześniej ustalonej z laboratorium ze
względu na różne procedury izolacji RNA.
Postępowanie po izolacji RNA
·ð Ocena iloÅ›ci i jakoÅ›ci RNA (elektroforeza i analiza spektrofotometyczna)
·ð Przechowywanie RNA po izolacji:
o Rozpuszczone w odpowiednim buforze w temp. -80oC, unikać rozmrażania i
zamrażania.
Zamiast RNA można przechowywać cDNA uzyskane w procesie odwrotnej transkrypcji
(mniej podatne na degradacjÄ™)  w buforze TE w temp.  80oC (stabilne przez kilka
miesięcy).
Odwrotna transkrypcja (RT)
·ð Uzyskanie nici DNA komplementarnej do RNA (cDNA) z użyciem odwrotnej transkryptazy
·ð cDNA  matryca w reakcji PCR
·ð RT i PCR można wykonać w jednej probówce  gdy w RT użyjemy starterów specyficznych dla
badanego genu (gene specific primers, GSP):
o cDNA może być użyte do jednego tekstu genetycznego
o większa powtarzalność wyników
o mniejsze ryzyko kontaminacji
·ð aplikacje bardzo czuÅ‚e na niewielkie iloÅ›ci genomowego DNA (np. RT-Q-PCR dla genów o
niskiej ekspresji)  konieczność usunięcia genomowego DNA (trawienie DNazą bezpośrednio
po izolacji RNA lub przed wykonaniem RT).
·ð RT należy przeprowadzać w obecnoÅ›ci inhibitora RNaz oraz ditiotreitolu (DDT)  stabilizatora
odwrotnej transkryptazy.
Rodzaje starterów w reakcji RT
·ð GSP  selektywne przepisanie mRNA badanego genu na cDNA
·ð Oligo(dT)  hybrydyzujÄ… do fragmentu poli(A) mRNA; pozwalajÄ… na wybiórcze przepisanie
mRNA
·ð Krótkie i niespecyficzne startery losowe (tzw. Random heksamery, oktamery, nonamery) 
pozwalają na przepisanie na cDNA całej puli RNA obecnego w komórce (rRNA, tRNA oraz
mRNA)
·ð Random heksamery to 6-nukleotydowe odcinki jednoniciowego DNA o każdej możliwej
sekwencji (46 możliwych kombinacji, a więc 4096 różnych oligomerów).
11
cDNA  wykorzystanie
·ð matryca w jakoÅ›ciowej PCR  ujawnienie transkryptu badanego genu.
·ð Matryca w iloÅ›ciowej PCR w czasie rzeczywistym (RT-Q-PCR)  ocena bezwzglÄ™dnej iloÅ›ci
matrycy oraz określenie poziomu ekspresji genu (ilościowa analiza ekspresji genu).
Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym RT-Q-PCR (Real-Time Quantitative
PCR)
·ð SÅ‚uży do iloÅ›ciowej analizy ekspresji genu na poziomie mRNA
·ð Polega na amplifikacji cDNA i monitorowaniu jego iloÅ›ci w każdym kolejnym cyklu reakcji
·ð Jest to możliwe dziÄ™ki obecnoÅ›ci w mieszaninie reakcyjnej odpowiednich barwników lub sond
znakowanych fluorescencyjnie
·ð Emitowany sygnaÅ‚ fluorescencyjny jest proporcjonalny do iloÅ›ci powstajÄ…cych czÄ…steczek DNA
·ð Wykonywana m.in. w technologii TaqMan.
RT-Q-PCR w technologii TaqMan
·ð Metoda ta oparta jest na pomiarze zmian fluorescencji w czasie rzeczywistym, w kolejnych
cyklach reakcji PCR
·ð Jest to możliwe dziÄ™ki dodaniu do reakcji specjalnie znakowanej sondy molekularnej TaqMan
komplementarnej do fragmentu DNA zlokalizowanego pomiędzy starterami
·ð Użycie specyficznych starterów i sond daje pewność, że amplifikowana jest wyÅ‚Ä…cznie żądana
sekwencja. Umożliwia to specyficzną detekcję i analizę ilościową amplifikowanego produktu.
Schemat reakcji RT-Q-PCR
1. Przyłączenie startera F oraz sondy
komplementarnej do fragmentu cDNA
zlokalizowanego pomiędzy starterami R-
reporter dołączony do końca 5` sondy W-
wygaszacz na końcu 3`.
2.3. W czasie wydłużania łańcucha cDNA
polimeraza powoduje degradacjÄ™ sondy
oraz przestrzenne rozdzielenie wygaszacza
i barwnika reporterowego co prowadzi do
wzrostu fluorescencji.
4.5. Sekwencja zdarzeń jest powtarzana w
każdym cyklu reakcji PCR
Intensywność fluorescencji odpowiada
ilości powstającego produktu PCR i jest
proporcjonalna do początkowej ilości
matrycy w badanym materiale.
12
Wykres amplifikacji w reakcji RT-Q-PCR
Przykładowy wykres przedstawiający wzrost fluorescencji dla kilku badanych prób.
·ð OÅ› x  kolejne cykle reakcji PCR
·ð OÅ› y  intensywność fluorescencji
RT-Q-PCR w diagnostyce wirusologicznej
(HBV, HCV, HIV, EBV, CMV, HPV, HSV, enterowirusy, parvovirus B 19)
Badania molekularne:
·ð CzuÅ‚e i swoiste
·ð PozwalajÄ… wykryć wirusa już w kilka dni po zakażeniu
·ð Możliwość poszukiwania wirusa w ognisku zakażenia  wykorzystanie do badania zarówno
płynów ustrojowych jak i wycinków tkanek
·ð Rozróżnienie stanu latencji od stanu aktywnej replikacji  badanie liczby kopii wirusa
powstajÄ…cych w trakcie replikacji
·ð Åšledzenie zmian poziomu wiremii w trakcie trwania zakażenia  pomocne w ustaleniu
wskazania do leczenia i monitorowania jego skuteczności
Polimorfizm genetyczny
·ð WystÄ™powanie w populacji dwóch lub wiÄ™cej alleli danego genu z czÄ™stoÅ›ciÄ… wiÄ™kszÄ… niż
oczekiwana, wynikająca z ogólnej częstości mutacji w danej populacji
·ð CzÄ™stość mutacji w danej populacji jest trudna do sprecyzowania  przyjÄ™to, że o
polimorfizmie można mówić wtedy, gdy najrzadszy wariant alleliczny w danym locus
występuje z częstością większą niż 1%.
13
Niektóre odmiany polimorficzne określonych genów predysponują do wystąpienia konkretnych
schorzeń.
Gen apolipoproteiny E (ApoE)
·ð ApoE kodowana jest przez trzy rodzaje alleli tworzÄ…cych 6 genotypów i trzy izoformy: E2, E3,
E4. Warianty polimorficzne genu wpływają istotnie na stężenie lipidów w surowicy. Uważa
się, że obecność wariantu E4 genu ApoE wiąże się z dużym ryzykiem przedwczesnego
wystąpienia choroby niedokrwiennej serca oraz zawału mięśnia sercowego u osób w młodym
wieku, a także z większym ryzykiem udaru mózgowego. Osoby będące nosicielami tego allelu
słabej reagują na leczenie statynami.
Wybrane metody przesiewowego wykrywania mutacji i polimorfizmów:
·ð SSCP (Single  Strand Conformation Polymorphism)  polimorfizm konformacji
jednoniciowego DNA
·ð RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)  polimorfizm dÅ‚ugoÅ›ci fragmentów
restrykcyjnych
SSCP  analiza polimorfizm konformacji jednoniciowego DNA
Technika ta oparta jest na analizie zmiany szybkości migracji w żelu jednoniciowych fragmentów
DNA.
Opiera się ona na założeniu, że ruchliwość elektroforetyczna cząstki w żelu zależna jest od rozmiaru,
ładunku i kształtu cząsteczki.
W SSCP dsDNA poddajemy denaturacji (formamid, wysoka temperatura -90/95oC) do ssDNA i
nanosimy na żel poliakrylamidowy (PAA).
Po rozdziale elektroforetycznym analizujemy szybkość migracji pojedynczych nici DNA.
Jednoniciowe cząsteczki DNA poruszają się wolniej niż cząsteczki dwuniciowe!
W wyniku wewnÄ…trzniciowego parowani zasad jednoniciowe DNA (ssDNA) zagina siÄ™ w
trójwymiarową strukturę.
Konformacja pojedynczej nici DNA zależy od sekwencji nukleotydów.
Różnica jednego nukleotydu pomiędzy dwiema podobnymi sekwencjami wystarcza do zmiany
konformacji zwiniętej jednej nici względem drugiej.
Zmiana konformacji wykrywana jest jako różnica w ruchliwości w żelu podczas elektroforezy.
Czułość metody pozwala na wykrycie większości różnic pojedynczych nukleotydów we fragmencie
DNA zbudowanym z kilkuset pz:
·ð Pozwala na wykrycie 70-90% mutacji w produktach PCR o dÅ‚ugoÅ›ci do 200 pz.
·ð CzuÅ‚ość metody zmniejsza siÄ™ w przypadku dÅ‚uższych produktów PCR  w DNA o dÅ‚ugoÅ›ci 400
pz wykrywa się mniej niż 50% mutacji.
14
Jedna z najczęściej stosowanych metod przesiewowego poszukiwania mutacji punktowych.
SSCP, RFLP, &
Pozwalają odróżnić prawidłowy fragment DNA od zmutowanego. Nie pozwalają jednak tej zmiany
scharakteryzować.
Dokładną charakterystykę mutacji/polimorfizmów umożliwia sekwencjonowanie próbek
wytypowanych metodami przesiewowymi.
Metody przesiewowe charakteryzują się względnie niskimi kosztami eksploatacyjnymi w porównaniu
z sekwencjonowaniem.
15