Ćwiczenie 3
Analiza wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA)
metodÄ… wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detektorem
spektrofotometrycznym UV
1. Wprowadzenie
Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA, w literaturze ang. PAH)
powstają z materiału organicznego podczas pirolizy lub niepełnego spalania. Najczęściej
z
ródłem zanieczyszczeń środowiska związkami WWA są: rafinerie ropy naftowej, przemysł
koksowniczy, elektrownie i elektrociepłownie, przemysł materiałów plastycznych i
farbiarskich oraz spalanie odpadków. Węglowodory znajdują się równie\
w spalinach
samochodowych i w dymie papierosowym.
Analizę WWA metodą HPLC prowadzi się w układzie faz odwróconych, tzn. na
niepolarnej fazie stacjonarnej. Ten typ chromatografii jest najbardziej odpowiedni do
rozdzielania mieszaniny związków niepolarnych lub słabo polarnych na pojedyncze związki.
Jako fazy ruchome u\
ywane sÄ… woda, acetonitryl i metanol oraz ich mieszaniny. Detektorem
stosowanym do analizy WWA mo\
e być detektor spektrofotometryczny UV. Działa na
zasadzie pomiaru absorpcji promieniowania UV. Miarą sygnału z detektora jest wysokość
(lub powierzchnia) piku chromatograficznego.
Celem ćwiczenia jest dokonanie analizy ilościowej mieszaniny węglowodorów:
naftalenu i fenantrenu metodÄ… dodatku wzorca. W metodzie dodatku wzorca wzorcem jest
substancja oznaczana. W metodzie wykorzystuje siÄ™ liniowÄ… zale\
ność wielkości mierzonej
(czyli w naszym przypadku wysokości lub powierzchni piku chromatograficznego) od
stÄ™\
enia analitu. Równanie przedstawiające liniową zale\
ność wielkości mierzonej jako
funkcjÄ™ stÄ™\
enia analitu mo\
na przedstawić w postaci:
Y = m × c (1)
gdzie:
Y - wielkość mierzona, c - stę\
enie analitu, m - współczynnik.
1
 Analiza ilościowa metodą dodatku wzorca składa się z dwu etapów (rys. 1):
- przygotowanie próbki analizowanej i wykonanie pomiaru. Mierzymy wysokość (lub
powierzchniÄ™) piku chromatograficznego dla analitu.
- do tej samej próbki dodajemy znaną objętość roztworu wzorca o znanym stę\
eniu. Roztwór
mieszamy i powtórnie mierzymy wysokość piku chromatograficznego. Wysokość piku
chromatograficznego analitu wzrasta a wzrost jest proporcjonalny do ilości dodanego wzorca.
MetodÄ™ dodatku wzorca stosujemy, je\
eli równanie (1) ma przebieg prostoliniowy.
Ponadto, objętość próbki wprowadzanej na kolumnę chromatograficzną musi być stała.
Warunek ten jest spełniony w przypadku stosowania dozowników typu zaworu z pętlą.
a) b)
Analit + wzorzec
Analit
Rysunek 1. Analiza HPLC próbki (a) oraz analiza próbki po dodaniu wzorca (b).
StÄ™\
enie analitu mo\
na policzyć na podstawie równań:
Y0 = m × c (2)
Y1 = m × (c + cp) (3)
gdzie: Y0 - wysokość (lub powierzchnia) piku chromatograficznego zmierzona dla
próbki bez dodatku wzorca, Y1 - wysokość (lub powierzchnia) piku
chromatograficznego zmierzona dla próbki po dodaniu wzorca, m  współczynnik, c -
stÄ™\
enie analitu w próbce, cp - stę\
enie dodanego wzorca w próbce.
2
StÄ™\
enie dodanego wzorca w próbce (cp) obliczmy ze wzoru:
cp ×Vp = cs × Vs (4),
gdzie: Vp  objętość próbki, cs  stę\
enie roztworu wzorca, który dodajemy do próbki,
Vs - objętość roztworu wzorca, który dodajemy do próbki.
Wynikiem dodania wzorca jest zmiana objętości roztworu próbki badanej próbki.
Je\
eli do roztworu próbki o du\
ej objętości (10 - 100 ml), dodajemy roztwór wzorca za
pomocą mikrostrzykawki, która umo\
liwia dozowanie maÅ‚ych objÄ™toÅ›ci (10 - 100 µl), to
zmiana objętości roztworu próbki po dodaniu roztworu wzorca jest nieznaczna i nie zachodzi
konieczność wprowadzania korekty objętości.
2. Wykonanie ćwiczenia
2.1. Warunki analizy chromatograficznej
Chromatograf cieczowy HPLC składa się z pompy o pojedynczym tłoku, detektora
spektrofotometrycznego UV z filtrem 254 nm oraz dozownika typu zaworu z pętlą. Do
analizy zostanie wykorzystana szklana kolumna analityczna o wymiarach 150 x 3 mm w
pancerzu stalowym. Wypełnienie (RP 18) stanowi \
el krzemionkowy z chemicznie
zwiÄ…zanymi grupami oktadecylowymi czyli tzw. odwrócone fazy; Å›rednica ziaren 7 µm. FazÄ…
ruchomą jest mieszanina metanol/woda w stosunku 85 : 15, warunki rozdziału izokratyczne.
2.2. Analiza chromatograficzna
Celem ćwiczenia jest analiza ilościowa naftalenu i fenantrenu w wodzie. Nale\
y wykonać
analizę chromatograficzną roztworu próbki. Do próbki nale\
y dodać określoną objętość
roztworu wzorca a następnie powtórnie wykonać analizę próbki. Po ka\
dej analizie
koniecznie nale\
y umyć kilkakrotnie strzykawkę a tak\
e pętlę dozownika metanolem.
2.3. Opracowanie wyników
Nale\
y zmierzyć wysokości (lub powierzchnie) pików naftalenu i fenantrenu na otrzymanych
chromatogramach. Na podstawie uzyskanych danych określa się stę\
enia naftalenu i
fenantrenu w analizowanym roztworze. W opracowaniu nale\
y podać wszystkie wykonane
obliczenia.
3
3. Zakres wymaganych wiadomości
- podstawowe pojęcia i definicje dotyczące procesu chromatograficznego min. czas i objętość
retencji, czas martwy (zerowy), zredukowany czas retencji, współczynnik podziału K,
współczynnik retencji (współczynnik pojemności) k, współczynnik selektywności ą, zdolność
rozdzielcza kolumny Rs, sprawność kolumn chromatograficznych (WRPT, N),
- analiza ilościowa: metoda dodatku wzorca,
- wysokosprawna chromatografia cieczowa,
- schemat blokowy HPLC ze szczególnym uwzględnieniem dozownika typu zaworu z pętlą
oraz detektora spektrofotometrycznego UV,
- fazy stacjonarne i ruchome stosowane w chromatografii adsorpcyjnej i podziałowej HPLC a
zwłaszcza: \
el krzemionkowy i fazy odwrócone, nośniki, fazy związane chemicznie, szereg
eluotropowy,
- rozdział w warunkach izokratycznych i w gradiencie,
- budowa i zasada działania detektora spektrofotometrycznego UV, prawa absorpcji
promieniowania.
Literatura:
W. Szczepaniak, Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN, W-wa, 1996.
Ewentualnie:
J. Minczewski, Z. Marczewski, Chemia analityczna, tom III, Analiza instrumentalna,
PWN, W-wa.
G. W. Ewing, Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN, W-wa.
4