Zasady diagnostyki

chorób mitochondrialnych

Dorota Piekutowska-Abramczuk

Zakład Genetyki Medycznej IPCZD

Warszawa, 12.01.12

Chorobą mitochondrialną

nazywamy stan chorobowy wywołany

uwarunkowaną genetycznie zmianą budowy

białka, pierwotnie zaburzającą przebieg

procesu fosforylacji oksydacyjnej w komórce.

45

7

38

4

4

11

1

10

13

3

10

16

2

14

Podjednostki

mtDNA

nDNA

System fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS)

Dehydrogenaza
bursztynianowa

Dehydrogenaza

NADH

Kompleks

cytochromów bc1

Oksydaza

cytochromu c

Syntaza ATP

Zaburzenia aktywności kompleksów – izolowane lub złożone

najczęściej – KI i KIV

Choroby mitochondrialne

Częstość występowania 1:8500 - 1:5000

Prawdopodobnie wiele przypadków pozostaje nierozpoznanych

Heterogenność kliniczna, biochemiczna i genetyczna

Patomechanizm

obniżenie efektywności syntezy ATP

wzrost produkcji reaktywnych form tlenu

zaburzenia homeostazy wapnia

Choroby mitochondrialne

Uwarunkowane mutacjami w genach:

› mitochondrialnych

» strukturalne podjednostki OXPHOS

» tRNA

» rRNA

› jądrowych

» strukturalne podjednostki OXPHOS

» niestrukturalne

»› czynniki towarzyszące (

assembly factors

) (I-V)

»›

czynniki zaburzające replikację mtDNA

»› zaburzające transkrypcję i translację genów OXPHOS

»›

zaburzające import białek mitochondrialnych

»› biosynteza kofaktorów

»›

deficyt CoQ i in.

>50% wszystkich mutacji w mtDNA (gł.

MTTK, MTTL1, MTTI)

Dziedziczenie

matczyne

autosomalne recesywne

autosomalne dominujące

sprzężone z chromosomem X

Przypadki sporadyczne



Występuje w 10

3

– 10

5

kopii



Kolista cząsteczka o wielkości

16 569 kpz (nić H i L)



Zawiera 37 genów (13

strukturalnych podjednostek

systemu OXPHOS, 2 rRNA, 22

tRNA)



Małe lub brak przestrzeni

międzygenowych



Brak intronów



2 małe obszary niekodujące:

pętla D – zawiera miejsca

inicjacji transkrypcji i replikacji

nici H i miejsce startu replikacji

nici L



Odstępstwa od uniwersalnego

kodu genetycznego

(np. TGA (Stop) Trp)

Mitochondrialne DNA

Genetyka mitochondrialna



Dziedziczenie matczyne

Tylko kobieta przekazuje zmutowany gen swemu potomstwu, zarówno córce

jak i synowi (nieliczne mtDNA plemnika są aktywnie usuwane we wczesnych

podziałach zygoty).



Poliploidalność mitochondriów (setki mitochondriów, a w każdym do 10

cząsteczek mtDNA)



Szybkie tempo ewolucji (mała wydajność systemów naprawy, brak

histonów, brak zjawiska rekombinacji, nadprodukcja ROS)



Heteroplazmia i wartość progowa

Prezentacja objawów zależy od poziomu heteroplazmii i wartości progowej

(

treshold effect

).



Segregacja mitotyczna (efekt

bottleneck

) w oogenezie tłumaczy częste

zmiany poziomu mutacji w kolejnych pokoleniach i znaczne zróżnicowanie

fenotypowe.



Ekspansja klonalna (preferencyjna amplifikacja mutacji mtDNA do

wysokiego poziomu w tkankach postmitotycznych)

Dziedziczenie w linii matczynej

Schemat mitochondrialnego efektu szyjki butelki

(bottleneck) w dojrzewających komórkach jajowych

Cechy mutacji mtDNA

Heteroplazmatyczne
Homoplazmatyczne

Stabilne
• silna korelacja genotyp-fenotyp
• mała/brak zmienność poziomu mutacji w różnych tkankach
• mała/brak zmienność poziomu w czasie (podczas rozwoju płodowego i
po urodzeniu)

m.8993T>G, m.8993T>C

Niestabilne
• bardzo zróżnicowany obraz kliniczny
• niejednorodne tkankowe rozmieszczenie mutacji
• duża zmienność poziomu mutacji w czasie
m.3243A>G

Choroby mitochondrialne u dzieci



Częściej wynikają z mutacji w jądrowym DNA



Cięższe od objawiających się w wieku późniejszym i częściej

wielonarządowe;



Dotyczą dysfunkcji wątroby (MDS), choroby nerek (MDS, deficyt

KIII) i zaburzeń hemopoezy (zespół Pearsona)



Opóźnienie rozwoju w połączeniu z kwasicą mleczanową



Postępujący regres rozwojowy, utrata posiadanych umiejętności

(zespół Leigha)



Niespecyficzne objawy zaburzenia w odżywianiu, wzrastania,

drgawki, częste infekcje



Rzadko obecne RRF

Rozpoznanie choroby mitochondrialnej



Zdefiniowane, wysoce prawdopodobne

analiza mutacji



Prawdopodobne

biopsja mięśnia



Możliwe

obserwacja, biopsja mięśnia, zabezpieczenie

materiału w wypadku zgonu

Materiał biologiczny



mięsień



krew obwodowa



wymaz z nabłonka jamy ustnej



mocz



wątroba



fibroblasty



włosy



płyn owodniowy



kosmki kosmówki

Oragene DNA

www.dnagenotek.com

Biopsja mięśnia

kompleksowe potwierdzenie rozpoznania



Ocena morfologiczna (włókna RRF)



Badanie histochemiczne (oksydaza cytochromu c mozaikowość,

dehydrogenaza bursztynianowa)



Badanie proteomiczne (obecność i aktywność kompleksów łańcucha

oddechowego i ich poszczególnych podjednostek)



Analiza enzymatyczna (aktywność kompleksów łańcucha oddechowego i

syntazy cytrynianowej)



Analiza molekularna

Przekrój poprzeczny przez mięsień szkieletowy.

Włókna RRF (A) wykazują dodatnią reakcję w kierunku dehydrogenazy bursztynianowej (B) i

brak aktywności oksydazy cytochromowej (C). Uszkodzone włókna wykazują niewielki wzrost

aktywności kwaśnej fosfatazy (D)

D

C

A

B

(A)

(B)

(C)

(D)

Zespół mitochondrialny IPCZD

Klinika Chorób Metabolicznych

Klinika Neurologii i Epileptologii

Klinika Gastroenterologii, Hepatologii i Immunologii

Zakład Biochemii i Medycyny Doświadczalnej

Zakład Patologii

Zakład Genetyki

Współpraca zewnętrzna

Diagnostyka molekularna chorób

mitochondrialnych w ZGM IPCZD

1. Identyfikacja powszechnych mutacji
• m.8993T>C/G (

MTATP6

) - NARP/MILS

• m.3243A>G (

MTTL1

) - MELAS

• m.8344A>G (

MTTK

) - MERRF

• delecja 4977pz (m.8470_13446del) KSS i in. zespoły delecyjne
• m.11778G>A (

MTND4

), m.3460G>A (

MTND1

), m.14484T>C (

MTND6

) - LHON

• g.1541G>A (

SCO2

) - deficyt białka SCO2

• c.845_846delCT, c.311_312insAT312_321del10(

SURF1

) – LS

2. Poszukiwanie mutacji w innych, znanych genach związanych z fenotypem
•

MTND1-MTND6 -

LS

•

DGUOK, MPV17

- HC-MDS

3. W przyszłości dalsza analiza molekularna obejmująca geny nie badane lub nowo

odkryte.

podstawowy

skrining mtDNA

 Izolacja DNA

 Amplifikacja, w tym L-PCR (delecje)



Sekwencjonowanie



MLPA (mutacje punktowe, delecje)



Real-Time PCR (poziom heteroplazmii, deplecji)



Analiza restrykcyjna (poziom heteroplazmii)

Schemat postępowania

Negatywny wynik badania molekularnego zwykle nie

wyklucza rozpoznania.