141

WYKRYWANIE MINIMALNEJ CHOROBY RESZTKOWEJ W OSTREJ BIA£ACZCE...

WYKRYWANIE MINIMALNEJ CHOROBY

RESZTKOWEJ W OSTREJ BIA£ACZCE

LIMFOBLASTYCZNEJ U DZIECI

DETECTION OF MINIMAL RESIDUAL DISEASE

IN ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA IN CHILDREN

Tomasz SZCZEPAÑSKI

1

, Anna PITUCH-NOWOROLSKA

2

, Bogdan MAZUR

3

1

Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii Dzieciêcej Œl¹skiego

Uniwersytetu Medycznego,

2

Zak³ad Immunologii Klinicznej, Polsko-Amerykañski

Instytut Pediatrii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagielloñskiego,

3

Katedra i

Zak³ad Mikrobiologii i Immunologii Œl¹skiego Uniwersytetu Medycznego

Streszczenie: Wykrywanie choroby resztkowej metod¹ cytometrii przep³ywowej jest oparte o okreœlenie

immunofenotypu komórek bia³aczkowych w okresie diagnostycznym ze szczególnym uwzglêdnieniem

zaburzeñ iloœciowych i jakoœciowych ekspresji determinant. Najwiêksze znaczenie ma wykrywanie

choroby resztkowej w okresie uzyskania pierwszej remisji. Omówiono o równie¿ szczegó³owo proble-

my z ocen¹ choroby resztkowej i interpretacj¹ uzyskanych wyników w ostrej bia³aczce limfoblastycznej

z linii limfocytu B i T.
Summary: Detection of minimal residual disease (MRD) in acute lymphoblastic leukemia with flow

cytometry is based on precise description of leukemia cell at diagnosis including aberrant expression of

determinants. The important clinical significance of MRD is in time of obtaining the first remission of

acute leukemia. The problems with MRD assay and interpretation of results in acute lymphoblastic B and

T leukemia are discussed.

Okreœlenie minimalna choroba resztkowa – MRD (ang. minimal residual

disease) dotyczy komórek bia³aczkowych, które w iloœci œladowej przetrwa³y stoso-

wane leczenie przeciwnowotworowe. Do wykrywania ich obecnoœci w ostrej bia³acz-

ce limfoblastycznej – ALL (ang. acute lymphoblastic leukemia) stosuje siê dwie

metodyki – molekularn¹ i cytometryczn¹. W cytometrii przep³ywowej poszukiwanie

MRD wymaga technik zwanych technikami populacji œladowych (rare events

technique), dziêki którym mo¿na wykrywaæ komórki bia³aczkowe z czu³oœci¹

1: 10000 – 1: 100000 (10

–4

do 10

–5

). Do wykazania obecnoœci komórek stanowi¹cych

œladow¹ populacjê potrzebne s¹ odpowiednie techniki u³atwiaj¹ce poszukiwania

POSTÊPY BIOLOGII KOMÓRKI

TOM 35 2008 SUPLEMENT NR 24 (141–146)

142

T. SZCZEPAÑSKI, A. PITUCH-NOWOROLSKA, B. MAZUR

pojedynczych komórek. Istniej¹ mo¿liwoœci „zagêszczenia” tych populacji komórko-

wych, które potencjalnie zawieraj¹ w sobie poszukiwane komórki – jest to mo¿liwoœæ

„ograniczania” (bramkowania) okreœlonych populacji komputerowo po zbiorze

wysokiej liczby komórek (np. 500 000–1000 000) lub wstêpnego sortowania i analizy

wysortowanej populacji. Zalet¹ metody komputerowego ograniczania badanych

populacji lub ich selekcjonowania na podstawie ekspresji determinant restrykcyjnych

dla danej populacji komórek jest to, ¿e oceniamy ca³y materia³ przy okazji badaj¹c

szpik w danej fazie leczenia chorego. Wad¹ jest koniecznoœæ opracowywania

zbiorów du¿ych, co mo¿e spowolniæ pracê komputera. Ze wzglêdu na specyfikê

metodyki cytometrii przep³ywowej, dla pewnoœci wykrycia MRD konieczna jest

obecnoœæ zgrupowania co najmniej 10–20 komórek o immunofenotypie bia³aczkowo-

swoistym. St¹d nawet przy wprowadzeniu do cytometru miliona komórek, maksy-

malna czu³oœæ metody nie przekroczy 10

–5

, a najczêœciej oscyluje wokó³ 10

–4

. Metoda

komputerowego ograniczania badanych populacji jest w chwili obecnej najczêœciej

stosowan¹ technik¹ wykrywania MRD w ALL z zastosowaniem cytometrii przep³y-

wowej. Zalet¹ metody wstêpnego sortowania jest zmniejszenie iloœci badanego

materia³u do populacji zawieraj¹cej poszukiwane komórki. Wad¹ metod wykorzystu-

j¹cych sortowanie jest czasoch³onnoœæ, koniecznoœæ posiadania sortera (i zwi¹zany

z tym du¿y koszt badania) i co najwa¿niejsze mo¿liwoœæ „zgubienia”, uszkodzenia

poszukiwanych komórek, co w efekcie prowadzi do fa³szywie negatywnego wyniku

badania. Dlatego metoda ta nie znalaz³a do tej pory powszechniejszego zastosowania

w prospektywnych badaniach nad MRD w ALL.

Obowi¹zuj¹ca klasyfikacja immunologiczna ALL wyró¿nia dwie g³ówne jednostki

chorobowe, tj. ALL z komórek prekursorowych limfocytów B (BCP-ALL) i ALL

z komórek prekursorowych limfocytów T (T-ALL), a w ich obrêbie szereg podtypów

(tab. 1 i 2). Okreœlenia immunofenotypów dokonuje siê na podstawie standardowych

zestawów przeciwcia³ z wykorzystaniem wielokolorowej cytometrii przep³ywowej.

B

w

ó

t

y

c

o

f

m

il

h

c

y

w

o

r

o

s

r

u

k

e

r

p

k

e

r

ó

m

o

k

z

L

L

A

a

w

o

p

y

t

o

n

e

f

o

n

u

m

m

i

a

k

y

t

s

y

r

e

t

k

a

r

a

h

C

.

1

A

L

E

B

A

T

y

r

e

k

r

a

M

L

L

A

-

B

-

o

r

p

L

L

A

n

o

m

m

o

c

L

L

A

-

B

-

e

r

p

L

L

A

-

B

-

e

r

p

-l

a

n

o

it

i

s

n

a

rt

a

T

d

T

0

1

D

C

9

1

D

C

0

2

D

C

2

2

D

C

9

7

D

C

y

C

g

I

y

C

B

-

e

r

P

µ

/

B

-

e

r

p

V

m

S

λ

5

9

7

D

C

-

g

I

m

S

4

3

D

C

R

D

-

A

L

H

+

+

–

+

+

–

+

+

+

+

–

–

–

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

–

–

–

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

–

–

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

;

ê

j

s

e

r

p

s

k

e

e

j

u

z

a

k

y

w

k

e

z

c

a³

ai

b

%

5

7

–

5

2

+

;

ê

j

s

e

r

p

s

k

e

e

j

u

z

a

k

y

w

k

e

z

c

a³

ai

b

%

0

1

<

–

:

el

o

b

m

y

S

,

ê

j

s

e

r

p

s

k

e

e

j

u

z

a

k

y

w

k

e

z

c

a³

ai

b

%

5

7

>

+

+

a

"

a

m

L

L

A

-

B

-

e

r

p

z

w

ó

t

n

e

j

c

a

p

%

5

~

.

-

B

-

e

r

p

l

a

n

o

it

i

s

n

a

r

t

"

L

L

A

g

I

y

C

B

-

e

r

p

ij

s

e

r

p

s

k

e

j

e

n

s

e

z

c

o

n

d

e

j

ij

c

a

u

t

y

s

w

êi

s

e

j

u

i

n

if

e

d

¹

r

ó

t

k

,

µ

j

e

w

o

i

n

h

c

z

r

ei

w

o

p

i

g

I

m

S

B

-

e

r

p

(

B

-

e

r

p

u

s

k

el

p

m

o

k

j

e

w

o

k

r

ó

m

o

k

ei

n

o

³

b

a

n

ij

s

e

r

p

s

k

e

µ

h

c

y

³

a

z

rj

o

d

ij

s

e

r

p

s

k

e

z

e

b

)

9

7

D

-

h

ci

k

k

el

w

ó

h

c

u

c

ñ

a³

κ

b

u

l

λ

143

WYKRYWANIE MINIMALNEJ CHOROBY RESZTKOWEJ W OSTREJ BIA£ACZCE...

Poszukiwanie komórek bia³aczkowych wœród populacji prawid³owych komórek

hematopoetycznych ró¿ni siê dla dwóch g³ównych podtypów. Do elektronicznego

bramkowania poszukiwanych populacji wykorzystuje siê ekspresjê determinant

restrykcyjnych dla danej linii limfoidalnej. Ich obecnoœæ mo¿na wykazaæ zarówno

w cytoplazmie (CD3 dla T-ALL i CD79a, CD22 dla BCP-ALL), jak i na

powierzchni komórek (odpowiednio CD3 i/lub CD7 dla T-ALL lub CD19, CD22

dla BCP-ALL). Dobór przeciwcia³ zale¿y od podstawowego immunofenotypu ko-

mórek bia³aczkowych okreœlonego przy rozpoznaniu choroby. Wykrywanie choroby

resztkowej jest mo¿liwe dziêki temu, ¿e w porównaniu do prawid³owych komórek

prekursorowych limfocytów, limfoblasty bia³aczkowe wykazuj¹ zaburzenia ekspresji

determinant na powierzchni komórek (brak lub dodatkowa ekspresja), co okreœla

siê mianem immunofenotypu bia³aczkowo-swoistego b¹dŸ nietypowego. Podzia³

immuno-fenotypów nietypowych obejmuje immunofenotypy niepe³ne, ko-ekspresjê,

asynchroniê i fenotypy ektopowe.

W BCP-ALL wystêpuj¹ nastêpuj¹ce immunofenotypy atypowe:

– niepe³ny – najczêstsz¹ form¹ tego zaburzenia immunofenotypu jest brak

ekspresji CD45 (zw³aszcza izoformy CD45RA) czy HLA-DR, ale mo¿na równie¿

czasami stwierdziæ ni¿sz¹ ekspresjê CD19 (zmiany iloœciowe);

– nadmierna ekspresja antygenu, np. hiperekspresja CD10 lub CD58;

– ko-ekspresje – ekspresja determinant dodatkowych z innych linii (np. deter-

minant mieloidalnych na co najmniej 20% komórek bia³aczkowych); ten typ zaburzeñ

immunofenotypu jest najczêstszy;

– immunofenotyp asynchroniczny – równoczesne wystêpowanie determinant

typowych dla wczesnych etapów ontogenezy komórek danej linii i determinant

T

w

ó

t

y

c

o

f

m

il

h

c

y

w

o

r

o

s

r

u

k

e

r

p

k

e

r

ó

m

o

k

z

L

L

A

a

w

o

p

y

t

o

n

e

f

o

n

u

m

m

i

a

k

y

t

s

y

r

e

t

k

a

r

a

h

C

.

2

A

L

E

B

A

T

s

r

e

k

r

a

M

L

L

A

-

T

e

r

u

t

a

m

m

i

L

L

A

-

T

ci

t

y

c

o

m

y

h

t

n

o

m

m

o

c

L

L

A

-

T

e

r

u

t

a

m

ci

t

y

c

o

m

y

h

t

o

r

p

)

L

L

A

-

T

-

e

r

p

(

e

r

u

t

a

m

m

i

ci

t

y

c

o

m

y

h

t

3

D

C

m

S

–

3

D

C

m

S

+

T

d

T

1

D

C

2

D

C

3

D

C

y

C

3

D

C

m

S

+

+

–

+

+

+

–

+

+

–

+

+

+

+

–

+

+

+

+

+

+

+

+

–

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

–

+

+

+

+

+

+

4

D

C

–

8

D

C

/

–

4

D

C

+

8

D

C

/

–

4

D

C

–

8

D

C

/

+

4

D

C

+

8

D

C

/

+

+

+

–

–

–

+

±

±

–

–

±

±

+

–

±

±

+

–

+

±

±

5

D

C

7

D

C

R

C

T

b

a

R

C

T

d

g

R

D

-

A

L

H

–

+

+

–

–

+

+

+

+

+

–

–

–

+

+

+

+

–

–

–

+

+

+

+

%

0

7

–

%

0

6

%

0

4

–

%

0

3

–

+

+

+

+

–

;

ê

j

s

e

r

p

s

k

e

e

j

u

z

a

k

y

w

k

e

z

c

a³

ai

b

%

5

2

–

0

1

±

;

ê

j

s

e

r

p

s

k

e

e

j

u

z

a

k

y

w

k

e

z

c

a³

ai

b

%

0

1

<

–

:

el

o

b

m

y

S

ê

j

s

e

r

p

s

k

e

e

j

u

z

a

k

y

w

k

e

z

c

a³

ai

b

%

5

7

>

+

+

;

ê

j

s

e

r

p

s

k

e

e

j

u

z

a

k

y

w

k

e

z

c

a³

ai

b

%

5

7

–

5

2

+

144

T. SZCZEPAÑSKI, A. PITUCH-NOWOROLSKA, B. MAZUR

typowych dla dojrza³ych etapów, np. dla limfocytu B bêdzie to stwierdzenie ekspresji

CD20 na komórkach CD45

–

, czy ekspresji CD34 i ³añcuchów immunoglobulin na

tych samych komórkach;

– immunofenotyp ektopowy – ekspresja bia³ka NG2 (normalnie niewystêpu-

j¹cego na komórkach hematopoetycznych) na komórkach BCP-ALL z rearan¿acj¹

genu MLL.

W dobie wieloparametrycznej cytometrii przep³ywowej do monitorowania MRD

w BCP-ALL wykorzystuje siê zaburzenia iloœciowe, tj. zmienion¹ ekspresjê

determinant typowych, np. CD19, CD20, CD22, CD10, CD38, TdT itd. Komórki

bia³aczkowe zajmuj¹ puste przestrzenie (empty space), pomiêdzy prawid³owymi

komórkami prekursorowymi limfocytów B. Tabela 3 zawiera przyk³adowe zestawie-

nia przeciwcia³ do monitorowania MRD z wykorzystaniem 4 fluorochromów.

W T-ALL wykrywanie MRD jest mo¿liwe u oko³o 90% pacjentów dziêki

zastosowaniu jednoczesnego monitorowania ekspresji TdT i antygenów T-komórkowych

(tab. 3). U zdrowych ludzi jednoczesn¹ ekspresjê TdT i markerów T-komórkowych

stwierdza siê wy³¹cznie na tymocytach w grasicy, komórki o takim fenotypie s¹

niezmiernie rzadkie w szpiku kostnym i krwi obwodowej. Jeœli ju¿ stwierdzi siê jednoczesn¹

ekspresjê TdT i markerów T-komórkowych, z regu³y dotyczy to CD2 i/lub CD7,

natomiast ekspresja TdT i CD3, CD4, CD5 czy CD8 jest bia³aczkowo-swoista. W T-

ALL mo¿liwe jest równie¿ monitorowanie MRD poprzez wykrywanie za pomoc¹

cytometrii przep³ywowej asynchronicznej ekspresji antygenów (np. CD34

+

/CD3

+

) czy

nadmiernej ekspresji antygenów (np.CD7

++

, CD99

++

). Podobnie jak w BCP-ALL

wieloparametryczna cytometria przep³ywowa wykazuje, ¿e blasty T-ALL zajmuj¹ puste

przestrzenie pomiêdzy normalnymi komórkami prekursorowymi limfocytów T. £¹czne

n

e

i

w

a

t

s

e

z

e

w

o

d

a

³

k

y

z

r

P

.

3

A

L

E

B

A

T

ei

y

b

o

r

o

h

c

i

c

œ

o

n

c

e

b

o

a

i

n

a

z

a

k

y

w

a

l

d

³

a

i

c

w

i

c

e

z

r

p

T

i

B

w

ó

t

y

c

o

f

m

il

h

c

y

w

o

r

o

s

r

u

k

e

r

p

k

e

r

ó

m

o

k

z

j

e

n

z

c

y

t

s

a

l

b

o

f

m

il

e

c

z

c

a

³

a

i

b

j

e

rt

s

o

w

j

e

w

o

k

t

z

s

e

r

w

ó

m

o

r

h

c

o

r

o

u

lf

4

m

e

i

n

a

t

s

y

z

r

o

k

y

w

z

p

y

t

o

n

e

f

o

n

u

m

m

I

j

e

w

o

k

t

z

s

e

r

y

b

o

r

o

h

c

e

i

n

a

w

i

k

u

z

s

o

P

h

c

y

w

o

r

o

s

r

u

k

e

r

p

k

e

r

ó

m

o

k

z

L

L

A

)

L

L

A

-

P

C

B

(

B

w

ó

t

y

c

o

f

m

il

8

5

D

C

/

0

1

D

C

/

4

3

D

C

/

9

1

D

C

T

d

T

/

0

1

D

C

/

4

3

D

C

/

9

1

D

C

8

3

D

C

/

0

1

D

C

/

4

3

D

C

/

9

1

D

C

5

4

D

C

/

0

1

D

C

/

4

3

D

C

/

9

1

D

C

2

2

D

C

/

0

1

D

C

/

4

3

D

C

/

9

1

D

C

0

1

D

C

/

4

3

D

C

/

0

2

D

C

/

9

1

D

C

)

5

1

D

C

,

3

3

D

C

b

u

l(

3

1

D

C

/

0

1

D

C

/

4

3

D

C

/

9

1

D

C

c

6

6

D

C

/

0

1

D

C

/

4

3

D

C

/

9

1

D

C

4

3

D

C

/

9

D

C

/

5

4

D

C

/

9

1

D

C

0

2

D

C

/

0

1

D

C

/

5

4

D

C

/

9

1

D

C

2

G

N

/

0

1

D

C

/

4

3

D

C

/

9

1

D

C

h

c

y

w

o

r

o

s

r

u

k

e

r

p

k

e

r

ó

m

o

k

z

L

L

A

)

L

L

A

-

T

(

T

w

ó

t

y

c

o

f

m

il

7

D

C

/

4

3

D

C

/

5

D

C

/

3

D

C

T

d

T

/

3

D

C

t

y

c

/

5

D

C

/

3

D

C

T

d

T

/

3

D

C

t

y

c

/

7

D

C

/

3

D

C

7

D

C

/

9

9

D

C

/

5

D

C

/

3

D

C

145

WYKRYWANIE MINIMALNEJ CHOROBY RESZTKOWEJ W OSTREJ BIA£ACZCE...

zastosowanie ró¿nych immunofenotypów bia³aczkowo-swoistych pozwala na wykrywanie

MRD praktycznie u wszystkich pacjentów z T-ALL.

Jednym z potencjalnych problemów monitorowania MRD u pacjentów z ALL metod¹

cytometrii przep³ywowej jest ewolucja fenotypu komórek bia³aczkowych w trakcie

leczenia. Dlatego aby zapobiec wynikom fa³szywie ujemnym, powinno siê monitorowaæ

u ka¿dego z pacjentów co najmniej dwa immunofenotypy bia³aczkowo-swoiste.

Monitorowanie MRD na wczesnym etapie leczenia ALL dostarcza znamiennej

informacji prognostycznej, nadrzêdnej w stosunku do wszystkich klasycznych czyn-

ników prognostycznych, takich jak: wiek przy rozpoznaniu choroby, liczba blastów

we krwi, immunofenotyp, obecnoϾ aberracji chromosomowych, odpowied٠na profa-

zê sterydow¹. Prospektywne badania w dzieciêcej ALL wykaza³y, ¿e najistotniejsz¹

informacjê dostarcza wykrywanie MRD w szpiku kostnym przy zakoñczeniu leczenia

indukuj¹cego remisjê. Rokowanie u dzieci, u których nie stwierdza siê MRD przy

zakoñczeniu indukcji, jest bardzo dobre i obecnie rozwa¿a siê u nich zmniejszenie

intensywnoœci leczenia. Natomiast dzieci z wysokimi poziomami MRD przy zakoñ-

czeniu indukcji wymagaj¹ intensyfikacji leczenia czy nawet eksperymentalnego

zastosowania nowych leków, zw³aszcza jeœli wysokie poziomy MRD utrzymuj¹ siê

w trakcie leczenia konsoliduj¹cego remisjê. Równie istotne znaczenie prognostyczne

ma monitorowanie MRD u dzieci z ALL wysokiego ryzyka poddawanych

allogenicznemu HSCT i u pacjentów po wznowie ALL. Ponadto wykazano, ¿e

poprzez monitorowanie MRD mo¿na uzyskaæ znamienn¹ informacjê prognostyczn¹

u doros³ych pacjentów z ALL standardowego ryzyka.

Ci¹g³y pomiar MRD u pacjentów z ALL wykazuje, ¿e sta³e obni¿anie wartoœci

MRD do zera zwi¹zane jest z pomyœlnym rokowaniem, natomiast utrzymywanie siê

wysokich wartoœci MRD z regu³y prowadzi do wznowy choroby. Ci¹g³e monitoro-

wanie MRD z regu³y wykazuje wzrost jej wartoœci przed klinicznymi objawami

wznowy choroby. Jednak¿e, czasokres pomiêdzy ponownym pojawieniem siê lub

wzrostem wartoœci MRD i wznow¹ choroby mo¿e byæ zbyt krótki na zastosowanie

skutecznego leczenia re-indukuj¹cego remisjê. Nale¿y podkreœliæ, ¿e brak MRD przy

zakoñczeniu leczenia nie jest równoznaczny z pe³nym wyleczeniem pacjenta. Pomimo

wysokiej czu³oœci technik do wykrywania MRD, brak MRD nie jest równoznaczny

z pe³n¹ eliminacj¹ klonu bia³aczkowego, poniewa¿ ka¿da z analiz bada tylko niewielk¹

frakcjê komórek szpiku kostnego. Wyniki badañ prospektywnych opartych na du¿ych

grupach pacjentów wykaza³y utrzymywanie siê MRD przy zakoñczeniu leczenia u

oko³o 10% pacjentów; u wiêkszoœci pacjentów z MRD dosz³o w póŸniejszym okresie

do wznowy ALL. Tak wiêc, ci¹g³e monitorowanie MRD w ALL ma mniejsze

znaczenie i mo¿e mieæ wartoœæ kliniczn¹ jedynie dla pacjentów wykazuj¹cych

wzglêdnie opóŸnion¹ odpowiedŸ na leczenie.

Poniewa¿ szereg analiz potwierdzi³o znamiennoœæ prognostyczn¹ MRD przy

zakoñczeniu leczenia indukuj¹cego remisjê, rozpoczêto szereg prospektywnych

programów leczenia ALL, g³ównie u dzieci, których podstawowym elementem jest

modyfikacja leczenia w zale¿noœci od wielkoœci MRD. To dopiero pozwoli odpowie-

dzieæ na pytanie, czy poprzez czulsze monitorowanie leczenia z zastosowaniem

wiedzy o MRD mo¿na bêdzie poprawiæ wyniki leczenia ALL.

146

T. SZCZEPAÑSKI, A. PITUCH-NOWOROLSKA, B. MAZUR

LITERATURA

[1] BENE MC, CASTOLDI G, KNAPP W, LUDWIG WD, MATUTES E, ORFAO A, VAN'T VEER MB.

Proposals for the immunological classification of acute leukemias. European Group for the Immunolo-

gical Characterization of Leukemias (EGIL). Leukemia 1995; 9: 1783–1786.

[2] BOROWITZ MJ, PULLEN DJ, SHUSTER JJ, VISWANATHA D, MONTGOMERY K, WILLMAN CL,

CAMITTA B. Minimal residual disease detection in childhood precursor B-cell acute lymphoblastic

leukemia. Leukemia 2003; 17: 1566–1572.

[3] CAMPANA D. Determination of minimal residual disease in leukaemia patients. Review. Brit J Haematol

2003; 121: 823–838.

[4] CAMPANA D, COUSTAN-SMITH E. Minimal residual disease studies by flow cytometry in acute leuke-

mia. Acta Haematol 2004; 112: 8–15.

[5] COUSTAN-SMITH E, BEHM FG, SANCHEZ J, BOYETT JM, HANCOCK ML, RAIMONDI SC, RUB-

NITZ JE, RIVERA GK, SANDLUND JT, PUI CH-H, CAMPANA D. Immunological detection of mini-

mal residual disease in children with acute lymphoblastic leukaemia. Lancet 1998; 351: 550–554.

[6] DWORZAK MN, FRITISCH G, FLEISCHER C, PRINTZ D, FROSCHL G, BUCHINGER P, MANN G,

GADNER H. Multiparameter phenotype mapping of normal and post-chemotherapy B lymphopoiesis

in pediatric bone marrow. Leukemia 1997; 11: 1266–1273.

[7] GAIPA G. BASSO G, MAGLIA O, LEONI V, CAZZANIGA G, BUGARIN C, VELTRONI M, MICHELOT-

TO B, RATEI R, COLIVA T, VALSECCHI MG, BIONDI MN. Drug-induced immunophenotypic modu-

lation in childhood ALL. Leukemia 2005; 19: 49–56.

[8] LUCIO P, PARREIRA A, VAN DEN BEEMD MW, VAN LOCHEM EG, VAN WERING ER, BAARS E,

PORWIT-MACDONALD A, BJORKLUND E, GAIPA G, BIONDI A, ORFAO A, JANOSSY G, VAN DON-

GEN JJM, SAN MIGUEL JF. Flow cytometric analysis of normal B cell differentiation: a frame of reference

for the detection of minimal residual disease in precursor-B-ALL. Leukemia 1999; 13: 419–427.

[9] PORWIT-MACDONALD A, BJORKLUND E, LUCIO P, VAN LOCHEM EG, MAZUR J, PARREIRA A,

VAN DEN BEEMD MW, VAN WERING ER, BAARS E, GAIPA G, BIONDI A, CIUDAD J, VAN

DONGEN JJM, SAN MIGUEL JF, ORFAO A. BIOMED-1 concerted action report: flow cytometric

characterization of CD7+ cell subsets in normal bone marrow as a basis for the diagnosis and follow-up of

T cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). Leukemia 2000; 14: 816–825.

[10] SZCZEPAÑSKI T. Why and how to quantify minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia?

Leukemia 2007; 21: 622–626.

[11] SZCZEPAÑSKI T, VAN DER VELDEN VH, VAN DONGEN JJM. Flow-cytometric immunophenotyping

of normal and malignant lymphocytes. Clin Chem Lab Med 2006; 44: 775–796.

[12] VAN WERING ER, BEISHUIZEN A, ROEFFEN ET, VAN DER LINDEN-SCHREVER BE, VERHO-

EVEN MA, HAHLEN K, HOOIJKAAS H, VAN DONGEN JJM. Immunophenotypic changes between

diagnosis and relapse in childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 1995; 9: 1523–1533.

Tomasz Szczepañski

Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii Dzieciêcej Œl¹skiego Uniwersytetu

Medycznego, ul. 3 Maja 13/15, 41-800 Zabrze

E-mail: [e-mail]

Anna Pituch-Noworolska

Zak³ad Immunologii Klinicznej, Polsko-Amerykañski Instytut Pediatrii

Collegium Medicum Uniwersytetu Jagielloñskiego

Ul. Wielicka 265, 30-663 Kraków

E-mail: [e-mail]

Bogdan Mazur

Katedra i Zak³ad Mikrobiologii i Immunologii Œl¹skiego Uniwersytetu Medycznego

ul. Jordana 19, 41-808 Zabrze

E-mail: [e-mail]