TECHNIKI MOLEKULARNE wykład nr 8 30.10.2010

Każdy genom prokariotyczny bądź eukariotyczny musi ulegać replikacji podczas każdego podziału
komórkowego, a powstałe cząsteczki DNA muszą być rozdzielone i przekazane do powstałych nowych
komórek potomnych ta, aby każda z nich otrzymała kompletną kopię macierzystego genomu.
W budowie cząsteczki DNA zawarty jest prosty sposób jej powielania. Z komplementarnego parowania
zasad wynika bowiem, że do odtworzenia dwuniciowej cząsteczki wystarczy tylko pojedyncza nić, która
służy jako matryca do odtworzenia drugiej nici. Taki sposób powielania cząsteczek DNA nazywamy
replikacją semikonserwatywną.

Zasada semikonserwatywnej replikacji została wielokrotnie udowodniona, po raz pierwszy przez Meselsona
i Stahla. Mechanizm procesu musi zapewniać stabilność genetyczną organizmów i wiernie przekazywanie
informacji genetycznej

Replikacja DNA polega na dołączaniu nukleotydów w kierunku 5’-3’ za pomocą wiązań fosfodiestrowych
pomiędzy trifosfonukleotydami przez polimerazy DNA. Szczególne cechy polimeraz DNA
- wydłużanie już istniejącego łańcucha, a nie rozpoczynanie syntezy od początku
- dołączanie nukleotydów zawsze w jednym kierunku 5’-3’

Wydłużanie istniejących już łańcuchów wymusza syntezę krótkich ok. 10nukl. odcinków RNA- starterów
przez specjalną polimerazę RNA. Do starterów polimeraza DNA dołącza kolejne nukleotydy. W
późniejszym etapie replikacji konieczne jest usunięcie starterów RNA i wypełnienie pustych miejsc DNA.

Konsekwencją syntezy DNA w jednym kierunku jest asymetria reakcji zachodzących w widełkach
replikacyjnych. Jedna nić (wiodąca) jest syntetyzowana w sposób ciągły- raz rozpoczęta trwa do końca.
Druga nić (opóźniona) powstaje w postaci krótkich fragmentów Okazaki, łączonych potem ze sobą w jedną
ciągłą nić.

W przypadku nici opóźnionej- problemem jest kierunek syntezy. Syntezę w tym samym kierunku co nić
wiodąca umożliwia wypętlenie nici opóźnionej.

Replikacja dzieli się na 3 podstawowe etapy
- inicjacja-> rozpoznanie miejsca lub miejsc początku syntezy (ori). Są to zawsze określone miejsca/miejsce
cząsteczki DNA
- elongacja-> proces syntezy nowych nici mający miejsce zazwyczaj w widełkach replikacyjnych. Widełki
przesuwają się wzdłuż replikowanej cząsteczki w przeciwnych kierunkach- dla większości genomów jest to
proces dwukierunkowy
- terminacja-> zakończenie syntezy i kompletowanie nowych nici

Inicjacja replikacji u Procaryota
Bakteryjne ori obejmuje region 100-200 pz (u E.coli- ori C 245pz). Analiza sekwencji tego regionu u E.coli
wykazała, ze zawiera on 2 rodzaje krótkich motywów powtórzonych wiele razy. Motyw 9nt rozrzucony na
całym obszarze w 5 powt. Są to miejsca rozpoznawane przez białko DnaA. Oraz położone blisko siebie 3
powtórzenia motywu 13nt. na końcu 3’ bogatego w pary AT. Dołączenie białek DnaA powoduje lokalne
rozplecenie (topnienie podwójnej helisy) DNA. Białko DnaA nie ma aktywności katalitycznej niezbędnej do
rozrywania wiązań wodorowych, dlatego też rozplecenie helisy jest efektem napięcia torsyjnego
powstającego w wyniku przyłączenia dużej liczby cząsteczek białka DnaA.

Rozplecenie helisy pozwala na budowę kompleksu prereplikacyjnego (preinicjacyjnego) na obu końcach
powstałego oczka. Kompleks taki zawiera 12 białek->6 cząst. Białka DnaB i 6 DnaC. DnaB to helikaza i
przyłącza się za pośrednictwem białka DnaC, które uwalniane jest z kompleksu zaraz po jego utworzeniu.
Dołączenie helikazy do miejsca inicjacji kończy powstawanie kompleksu preinicjacyjnego. Dalsze
rozplecenie DNA przez helikazę umożliwia dołączenie enzymów uczestniczących w elongacji.

Rozdzielone jednoniciowe łańcuchy DNA są od razu zabezpieczane przed reasocjacją i degradacją przez
nukleazy poprzez dołączenie białek wiążących ssDNA-SSB. Białko to u bakterii jest tetrametrem. U Euc.
odpowiednikiem SSB jest białko replikacyjne A (RPA). W usuwaniu białek SSB przed kompleksem
replikacyjnym uczestniczą białka RMP

U Archeonów występuje niekiedy jedno, a niekiedy wiele miejsc inicjacji replikacji. U niższych Euc.
kilkaset, u wyższych kilka tysięcy-> syntetyzowane z jednego ori odcinki są krótsze. Niektóre Euc. ori są
wykorzystywane w każdym cyklu kom., inne rzadziej. Ori zlokalizowane bliżej centromeru są uruchamiane
wcześniej, niż te w okolicach telomerów.

U Euc. replikacji ulega chromatyna. Niezbędne jest rozluźnienie chromatyny zarówno w celu utworzenia
kompleksu w ori, jak i późniejsze w trakcie przesuwania się widełek replikacyjnych wzdłuż nici. Poza tym
część informacji genetycznej zapisana jest w strukturze chromatyny (eu- i hetero-), we wzorze metylacji
DNA. Stanowi to tzw. informację epigenetyczną.

Inicjacja u Euc.
U drożdzy S. cerevisiae ori stanowią 4 sekwencje nukleotydowe o długości 10-15pz rozsiane w rejonie 100-
150pz . Nazywane są ARS. U innyc Euc. region ten może być większy- może obejmować nawet kilka tys.pz

Subdomeny A i B1 drożdży stanowią razem sekwencję rozpoznawaną przez białka inicjacyjne – ORC
(origin recognition complex), właściwie kompleks 6 białek OrcIp- Orc6p, które początkowo postrzegano
jako odpowiednik DnaA, ale okazało się, że białka te są obecne w całym cylku komórkowym i
najprawdopodobniej tylko uczestniczą w przekazywaniu do ori sygnałów koordynujących replikację z
cyklem komórkowym. U ssaków przynajmniej część białek ORC ulega czasowemu odłączeniu.
Kolejna subdomena B2 odpowiada sekwencjom 13 nt. z E. coli i jest ona miejscem, gdzie dochodzi do
rozplatania helisy w wyniku napięcia torsyjnego pojawiającego się po dołączeniu do domeny B3 białka
ABF1, czyli białka wiążącego się z ARS.
Rozszerzanie oczka replikacyjnego podobnie jak u Proc. następuje po dołączeniu helikazy oraz innych
białek formujących aktywne widełki replikacyjne.

W fazie G1 cyklu komórkowego tworzony jest kompleks prereplikacyjny w skład którego wchodzi kilka
sekwencyjnie dołączanych białek Cdc1, Cdc6 (odpowiedniki DnaC) oraz 6 białek Mcm 2-7 (odp. DnaB).