1
LABORATORIUM IN
Ż
YNIERII BIOPROCESOWEJ
Kierunek: Biotechnologia
Specjalno
ść
: Agrobiotechnologia,
Biotechnologia w produkcji zwierz
ę
cej
(studia in
ż
ynierskie)
Ć
wiczenie nr 22
BADANIE WPŁYWU DEZINTEGRACJI
KOMÓREK DRO
Ż
D
Ż
Y SACCHAROMYCES
CEREVISIAE NA AKTYWNO
ŚĆ
KATALAZY
UNIWERSYTET TECHNOLOGICZNO – PRZYRODNICZY
WYDZIAŁ TECHNOLOGII I IN
Ż
YNIERII CHEMICZNEJ
Katedra In
ż
ynierii Chemicznej i Bioprocesowej
BYDGOSZCZ
2
1. Wprowadzenie
Produktami procesów biotechnologicznych mogą być substancje wydzielane do
ś
rodowiska hodowlanego lub zawarte w powstałej biomasie drobnoustrojów. Produkty
znajdujące się wewnątrz komórek można otrzymać po przeprowadzeniu dezintegracji
komórek, prowadzącej do wydzielenia zawartości komórki do roztworu.
Stosunkowo łatwo przeprowadzić dezintegrację komórek zwierzęcych, które są mało
odporne na naprężenia mechaniczne. Drobnoustroje są bardziej odporne na działanie sił od
komórek zwierzęcych, a ponadto mają mniejsze rozmiary.
2. Metody dezintegracji komórek
Metody dezintegracji komórek drobnousrojów można podzielić na dwie główne
grupy: mechaniczne i niemechaniczne.
Wśród metod mechanicznych można wyróżnić te, w których dezintegracja następuje w
wyniku sił działających w roztworze (dezintegracji ultradźwiękowej, ekspansji ciśnieniowej,
mieszania) lub na skutek działania sił w fazie stałej (rozcieranie komórek ze zmieloną
krzemionką).
Metody niemechaniczne polegają na odwadnianiu komórek lub lizie ścian komórkowych.
Odwadnianie można prowadzić przez suszenie powietrzem lub metodą próżniową. Stosuje się
również odwadnianie za pomocą rozpuszczalników. W lizie ścian komórkowych występują
następujące metody:
- fizyczna,
- chemiczna,
- enzymatyczna,
- biologiczna.
W skali przemysłowej wykorzystuje się dwie metody dezintegracji komórek: metodę
ciśnieniową i mielenie w młynach kulowych.
W homogenizatorach ciśnieniowych rozpad komórek następuje podczas ekspansji zawiesiny
komórek przy przepływie przez dyszę pod wysokim ciśnieniem (od 60 MPa do 120 MPa).
Młyny kulowe stosowane do niszczenia ścian komórkowych są podobne do używanych przy
rozcieraniu barwników. Zbudowane są z poziomych bębnów, wypełnionych kulkami
szklanymi o średnicy od 0.3 do 0.4 mm.
3
W skali laboratoryjnej stosuje się najczęściej następujące metody:
- dezintegratory ultradźwiękowe, w których dzięki dostarczeniu energii ultradźwięków
uzyskuje się efekt kawitacji płynu, oddziaływujący destrukcyjnie na komórki;
- dezintegratory wysokoobrotowe, w których niszczenie ścian komórek następuje w wyniku
wytworzenia przez mieszadło odpowiednio dużych naprężeń ścinających;
- zamrażanie i rozmrażanie zawiesiny komórek powodujące uwolnienie ich zawartości po
kilkukrotnym powtórzeniu tej operacji;
- metody enzymatyczne, w których rozkład ścian komórkowych uzyskuje się w wyniku
działania enzymami proteolitycznymi.
3. Jednostki aktywności enzymów
Aktywność enzymów jest mierzona w różnych jednostkach, które są zunifikowane przez
Międzynarodową Unię Biochemiczną (IUB). Najbardziej popularna jest jednostka
międzynarodowa (uniwersalna), definiowana jako aktywność enzymu, przy której wytwarza
się 1
µ
mol produktu w ciągu 1 min., w temperaturze 30
°
C i w optymalnych warunkach dla
enzymu. Aktywność enzymu wyrażoną w stosunku do 1 mg białka nazywa się aktywnością
właściwą. Obecnie IUB zaleca nową jednostkę – katal, który odpowiada aktywności enzymu
przy której jest on zdolny przekształcić 1 mol substratu w produkt w ciągu 1 [s] w temp. 30
°
C
i optymalnych pozostałych warunkach. Stąd 1 katal=6
∗
10
7
jednostek międzynarodowych.
4. Cel ćwiczenia
Badanie wpływu procesu dezintegracji komórek przez rozcieranie kulkami szklanymi
na aktywność katalazy.
5. Część doświadczalna
Należy przygotować roztwór nadtlenku wodoru o stężeniu 0,05mol/dm
3
i zawiesinę
komórek drożdży piekarskich (2
÷
2.5 g) w 100ml buforu fosforanowego o pH = 7. Najpierw
oznaczana jest aktywność enzymu katalazy w całych komórkach drożdży. W tym celu
200ml roztworu reakcyjnego H
2
O
2
o stężeniu 0,05mol/dm
3
, umieszczamy w zlewce na
mieszadle magnetycznym i wprowadzamy 5ml zawiesiny komórek drożdży. W momencie
dodania zawiesiny komórek włączamy stoper i w odstępach czasu co 5 min pobieramy
kolejno 4 próbki po 10ml roztworu reakcyjnego w celu oznaczenia stężenia
H
2
O
2
. Próbki
wprowadzamy do ok. 10ml kwasu siarkowego H
2
SO
4
(5N), aby poddać dezaktywacji katalazę
i zahamować dalszy rozkład H
2
O
2.
Stężenie H
2
O
2
w próbce oznacza się metodą
4
manganametryczną (zał. 1). Do przeprowadzenia dezintegracji komórek drożdży należy użyć
20g ich zawiesiny i taką samą masę kulek szklanych, które wprowadzamy do kolby
Erlenmajera o objętości 200ml. Kolbę wraz z zawiesiną wytrząsa się na wstrząsarce przez
okres 20min, stosując amplitudę 9 i częstotliwość 200min
-1
. Po przeprowadzonej
dezintegracji kulki szklane należy oddzielić na sicie, przepłukać wodą i wysuszyć.
Oddzielona zawiesina stosowana jest do pomiaru aktywności katalazy w dezintegrowanych
komórkach drożdży. Pomiary przebiegają podobnie jak dla całych komórek, ale stosuje się
jedynie 1ml roztworu uzyskanego po dezintegracji.
6. Opracowanie wyników pomiarów
Wyniki pomiarów i obliczeń umieścić w tabeli 1.
Tabela 1. Wyniki pomiarów i obliczeń.
t
[min]
4
KMnO
V
[
3
dcm
]
C
2
H
2
O
[
3
/ dm
mol
]
C
C
o
ln
1
2
.
.
Katalaza przyspiesza rozkład H
2
O
2
, który przebiega według następującego równania:
H
2
O
2
→
katalaza
H
2
O
2
+
2
1
O
2
Szybkość rozkładu H
2
O
2
można opisać następującą zależnością:
C
k
dt
dC
⋅
−
=
gdzie:
C – stężenie H
2
O
2
[mol/dm
3
],
t – czas [min],
k – stała szybkości zależna od aktywności katalazy [min
-1
]
5
Po scałkowaniu równania dla warunku początkowego C (t = 0) = C
0
otrzymamy
kt
C
C
=
0
ln
Należy sporządzić wykresy zależności ln(C
0
/C) od t i wyznaczyć stałe k metodą
najmniejszych kwadratów. Ich wartość należy odnieść do tej samej ilości materiału
biologicznego. Przy obliczaniu stężenia C
o
należy uwzględnić rozcieńczenie roztworu
nadtlenku wodoru próbką materiału biologicznego.
Obliczyć aktywność :
a =
m
t
V
C
r
•
∆
•
∆
=
]
[
[min]
]
[
g
mol
•
gdzie;
∆
C =
o
C - C
o
C - stężenie początkowe
C – stężenie po czasie (t)
r
V
- objętość reakcyjna [dm
3
]
m – masa biokatalizatora [g]
6. Literatura
1. A.S. Cyperowicz: Enzymy. Podstawy chemii i technologii. WNT, Warszawa 1974.
2. K.W. Szewczyk: Technologia biochemiczna. OWPW, Warszawa 1995.
3. J. Minczewski, Z. Marczenko: Chemia analityczna t. II. Analiza ilościowa. PWN,
Warszawa 1973.
6
Złącznik 1
Nadtlenek wodoru ma właściwości zarówno utleniające jak i redukujące. Nadtlenek wodoru
utlenia w środowisku kwaśnym wiele jonów o właściwościach redukcyjnych jak Fe
2+
, Sn
2+
,
I
-
. Na tej właściwości nadtlenku wodoru opiera się jego jodometryczne oznaczenie. Jeszcze
silniejsze właściwości utleniające wykazuje nadtlenek wodoru w roztworze alkalicznym,
utleniając np. mangan (II) do MnO
2.
W stosunku do silniejszych utleniaczy (MnO
4
, MnO
2
, PbO
2
, sole cerowe) nadtlenek
wodoru zachowuje się w środowisku kwaśnym jak reduktor. Aby reakcja przebiegała szybko,
musi być dość znaczne stężenie kwasu siarkowego w miareczkowanym roztworze.
Reakcję nadtlenku wodoru z nadmanganianem w której wydziela się wolny tlen
przedstawia równanie
2KMnO
4
+ 5H
2
O
2
+ 4H
2
SO
4
→
2MnSO
4
+ 5O
2
+ 8H
2
O + 2KHSO
4
z którego wynika, że
1000 cm
3
– 1 mol KMnO
4
–
2
5
mol H
2
O
2
Należy obliczyć:
a)
ilość gramów H
2
O
2
odpowiadającą ilości zużytego do miareczkowania roztworu KMnO
4
,
b)
stężenie H
2
O
2
w badanej próbie.