1

LABORATORIUM IN

Ż

YNIERII BIOPROCESOWEJ

Kierunek: Biotechnologia

Specjalno

ść

: Agrobiotechnologia,

Biotechnologia w produkcji zwierz

ę

cej

(studia in

ż

ynierskie)

Ć

wiczenie nr 22

BADANIE WPŁYWU DEZINTEGRACJI

KOMÓREK DRO

Ż

D

Ż

Y SACCHAROMYCES

CEREVISIAE NA AKTYWNO

ŚĆ

KATALAZY

UNIWERSYTET TECHNOLOGICZNO – PRZYRODNICZY

WYDZIAŁ TECHNOLOGII I IN

Ż

YNIERII CHEMICZNEJ

Katedra In

ż

ynierii Chemicznej i Bioprocesowej

BYDGOSZCZ

2

1. Wprowadzenie

Produktami procesów biotechnologicznych mogą być substancje wydzielane do

ś

rodowiska hodowlanego lub zawarte w powstałej biomasie drobnoustrojów. Produkty

znajdujące się wewnątrz komórek można otrzymać po przeprowadzeniu dezintegracji

komórek, prowadzącej do wydzielenia zawartości komórki do roztworu.

Stosunkowo łatwo przeprowadzić dezintegrację komórek zwierzęcych, które są mało

odporne na naprężenia mechaniczne. Drobnoustroje są bardziej odporne na działanie sił od

komórek zwierzęcych, a ponadto mają mniejsze rozmiary.

2. Metody dezintegracji komórek

Metody dezintegracji komórek drobnousrojów można podzielić na dwie główne

grupy: mechaniczne i niemechaniczne.

Wśród metod mechanicznych można wyróżnić te, w których dezintegracja następuje w

wyniku sił działających w roztworze (dezintegracji ultradźwiękowej, ekspansji ciśnieniowej,

mieszania) lub na skutek działania sił w fazie stałej (rozcieranie komórek ze zmieloną

krzemionką).

Metody niemechaniczne polegają na odwadnianiu komórek lub lizie ścian komórkowych.

Odwadnianie można prowadzić przez suszenie powietrzem lub metodą próżniową. Stosuje się

również odwadnianie za pomocą rozpuszczalników. W lizie ścian komórkowych występują

następujące metody:

- fizyczna,

- chemiczna,

- enzymatyczna,

- biologiczna.

W skali przemysłowej wykorzystuje się dwie metody dezintegracji komórek: metodę

ciśnieniową i mielenie w młynach kulowych.

W homogenizatorach ciśnieniowych rozpad komórek następuje podczas ekspansji zawiesiny

komórek przy przepływie przez dyszę pod wysokim ciśnieniem (od 60 MPa do 120 MPa).

Młyny kulowe stosowane do niszczenia ścian komórkowych są podobne do używanych przy

rozcieraniu barwników. Zbudowane są z poziomych bębnów, wypełnionych kulkami

szklanymi o średnicy od 0.3 do 0.4 mm.

3

W skali laboratoryjnej stosuje się najczęściej następujące metody:

- dezintegratory ultradźwiękowe, w których dzięki dostarczeniu energii ultradźwięków

uzyskuje się efekt kawitacji płynu, oddziaływujący destrukcyjnie na komórki;

- dezintegratory wysokoobrotowe, w których niszczenie ścian komórek następuje w wyniku

wytworzenia przez mieszadło odpowiednio dużych naprężeń ścinających;

- zamrażanie i rozmrażanie zawiesiny komórek powodujące uwolnienie ich zawartości po

kilkukrotnym powtórzeniu tej operacji;

- metody enzymatyczne, w których rozkład ścian komórkowych uzyskuje się w wyniku

działania enzymami proteolitycznymi.

3. Jednostki aktywności enzymów

Aktywność enzymów jest mierzona w różnych jednostkach, które są zunifikowane przez

Międzynarodową Unię Biochemiczną (IUB). Najbardziej popularna jest jednostka

międzynarodowa (uniwersalna), definiowana jako aktywność enzymu, przy której wytwarza

się 1

µ

mol produktu w ciągu 1 min., w temperaturze 30

°

C i w optymalnych warunkach dla

enzymu. Aktywność enzymu wyrażoną w stosunku do 1 mg białka nazywa się aktywnością

właściwą. Obecnie IUB zaleca nową jednostkę – katal, który odpowiada aktywności enzymu

przy której jest on zdolny przekształcić 1 mol substratu w produkt w ciągu 1 [s] w temp. 30

°

C

i optymalnych pozostałych warunkach. Stąd 1 katal=6

∗

10

7

jednostek międzynarodowych.

4. Cel ćwiczenia

Badanie wpływu procesu dezintegracji komórek przez rozcieranie kulkami szklanymi

na aktywność katalazy.

5. Część doświadczalna

Należy przygotować roztwór nadtlenku wodoru o stężeniu 0,05mol/dm

3

i zawiesinę

komórek drożdży piekarskich (2

÷

2.5 g) w 100ml buforu fosforanowego o pH = 7. Najpierw

oznaczana jest aktywność enzymu katalazy w całych komórkach drożdży. W tym celu

200ml roztworu reakcyjnego H

2

O

2

o stężeniu 0,05mol/dm

3

, umieszczamy w zlewce na

mieszadle magnetycznym i wprowadzamy 5ml zawiesiny komórek drożdży. W momencie

dodania zawiesiny komórek włączamy stoper i w odstępach czasu co 5 min pobieramy

kolejno 4 próbki po 10ml roztworu reakcyjnego w celu oznaczenia stężenia

H

2

O

2

. Próbki

wprowadzamy do ok. 10ml kwasu siarkowego H

2

SO

4

(5N), aby poddać dezaktywacji katalazę

i zahamować dalszy rozkład H

2

O

2.

Stężenie H

2

O

2

w próbce oznacza się metodą

4

manganametryczną (zał. 1). Do przeprowadzenia dezintegracji komórek drożdży należy użyć

20g ich zawiesiny i taką samą masę kulek szklanych, które wprowadzamy do kolby

Erlenmajera o objętości 200ml. Kolbę wraz z zawiesiną wytrząsa się na wstrząsarce przez

okres 20min, stosując amplitudę 9 i częstotliwość 200min

-1

. Po przeprowadzonej

dezintegracji kulki szklane należy oddzielić na sicie, przepłukać wodą i wysuszyć.

Oddzielona zawiesina stosowana jest do pomiaru aktywności katalazy w dezintegrowanych

komórkach drożdży. Pomiary przebiegają podobnie jak dla całych komórek, ale stosuje się

jedynie 1ml roztworu uzyskanego po dezintegracji.

6. Opracowanie wyników pomiarów

Wyniki pomiarów i obliczeń umieścić w tabeli 1.

Tabela 1. Wyniki pomiarów i obliczeń.

t

[min]

4

KMnO

V

[

3

dcm

]

C

2

H

2

O

[

3

/ dm

mol

]

C

C

o

ln

1

2

.

.

Katalaza przyspiesza rozkład H

2

O

2

, który przebiega według następującego równania:

H

2

O

2



 →



katalaza

H

2

O

2

+

2

1

O

2

Szybkość rozkładu H

2

O

2

można opisać następującą zależnością:

C

k

dt

dC

⋅

−

=

gdzie:

C – stężenie H

2

O

2

[mol/dm

3

],

t – czas [min],

k – stała szybkości zależna od aktywności katalazy [min

-1

]

5

Po scałkowaniu równania dla warunku początkowego C (t = 0) = C

0

otrzymamy

kt

C

C

=

0

ln

Należy sporządzić wykresy zależności ln(C

0

/C) od t i wyznaczyć stałe k metodą

najmniejszych kwadratów. Ich wartość należy odnieść do tej samej ilości materiału

biologicznego. Przy obliczaniu stężenia C

o

należy uwzględnić rozcieńczenie roztworu

nadtlenku wodoru próbką materiału biologicznego.

Obliczyć aktywność :

a =

m

t

V

C

r

•

∆

•

∆

=

]

[

[min]

]

[

g

mol

•

gdzie;

∆

C =

o

C - C

o

C - stężenie początkowe

C – stężenie po czasie (t)

r

V

- objętość reakcyjna [dm

3

]

m – masa biokatalizatora [g]

6. Literatura

1. A.S. Cyperowicz: Enzymy. Podstawy chemii i technologii. WNT, Warszawa 1974.

2. K.W. Szewczyk: Technologia biochemiczna. OWPW, Warszawa 1995.

3. J. Minczewski, Z. Marczenko: Chemia analityczna t. II. Analiza ilościowa. PWN,

Warszawa 1973.

6

Złącznik 1

Nadtlenek wodoru ma właściwości zarówno utleniające jak i redukujące. Nadtlenek wodoru

utlenia w środowisku kwaśnym wiele jonów o właściwościach redukcyjnych jak Fe

2+

, Sn

2+

,

I

-

. Na tej właściwości nadtlenku wodoru opiera się jego jodometryczne oznaczenie. Jeszcze

silniejsze właściwości utleniające wykazuje nadtlenek wodoru w roztworze alkalicznym,

utleniając np. mangan (II) do MnO

2.

W stosunku do silniejszych utleniaczy (MnO

4

, MnO

2

, PbO

2

, sole cerowe) nadtlenek

wodoru zachowuje się w środowisku kwaśnym jak reduktor. Aby reakcja przebiegała szybko,

musi być dość znaczne stężenie kwasu siarkowego w miareczkowanym roztworze.

Reakcję nadtlenku wodoru z nadmanganianem w której wydziela się wolny tlen

przedstawia równanie

2KMnO

4

+ 5H

2

O

2

+ 4H

2

SO

4

→

2MnSO

4

+ 5O

2

+ 8H

2

O + 2KHSO

4

z którego wynika, że

1000 cm

3

– 1 mol KMnO

4

–

2

5

mol H

2

O

2

Należy obliczyć:

a)

ilość gramów H

2

O

2

odpowiadającą ilości zużytego do miareczkowania roztworu KMnO

4

,

b)

stężenie H

2

O

2

w badanej próbie.