Dezintegracja komórek mikroorganizmów

1. Sporządzenie krzywej standardowej

1. Sporządzono 5ml roztworu albuminy o stężeniu 0,2mg/ml.

2. Z tego roztworu sporządzono roztwory, o obj. 1ml każdy, o stężeniach [mg/ml]: 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,10, 0,12, 0,14.

3. W kolejnych probówkach sporządzono roztwory 1ml odczynnika Bradforda i 0,1ml każdego ze stężeń.

4. Odczekano 5 minut i mierzono absorbancję przy 595nm względem próby kontrolnej.

5. Wyniki krzywej standardowej przedstawiono w tabeli poniżej.

Ls.	Stężenie białka [mg/ml]	Absorbancja
1.	0,02	0,118
2.	0,04	0,194
3.	0,06	0,277
4.	0,08	0,361
5.	0,10	0,473
6.	0,12	0,535
7.	0,14	0,621

1. Otrzymywanie ekstraktów komórkowych metodą mechaniczną z wykorzystaniem dezintegratora:

1. Porcję 10g drożdży zawieszoną w buforze Tris 50mM pH 7.0 dezintegrowano ze szklanymi kulkami w aparacie przez 3 minuty.

2. Zmierzono objętość ekstraktu w cylindrze miarowym – 19 ml.

3. Fragmenty odwirowano w dwóch probówkach po 5ml przez 5min w 6000rmp.

4. Ekstrakt do pomiaru rozcieńczono 4krotnie – 76ml.

5. Do 1ml odczynnika Bradforda dodawano po 0,1 ml ekstraktu i mierzono absorbancję.

Wyniki: dla pierwszej próby 0,531, dla drugiej próby 0,602. Wyniki umieszczono na krzywej standardowej.

y=4,2625x+0,0274

4,2625x=y-0,0274

• 4,2625x=0,531-0,0274

4,2625x=0,5036

X=0,118mg/ml

• 4,2625x=0,602-0,0274

4,2625x=0,5746

X=0,135mg/ml

• Uśredniając: (0,118+0,135)/2=0,1265mg/ml

Na podstawie wykresu, uzyskanych wyników i obliczeń można sądzić iż w 1ml naszej próby stężenie białka wynosi około 0,1265mg/ml, a że było 4krotnie rozcieńczone, to pierwotna wartość stężenia wynosiła 0,5024mg/ml, a w 76 ml (19ml pierwotnego) mamy go około 9,55mg białka, po uwzględnieniu strat takich jak pozostałość w piasku dezintegratora.

1. Wykonanie ćwiczenia z wykorzystaniem metody fizycznej – zamrażania i rozmrażania:

1. Przygotowane już drożdże o masie 10g zawieszono w 10 ml buforu Tris 50mM pH 7.0 w plastikowym pojemniku.

2. Następnie otrzymaną zawiesinę wstawiono do zamrażarki na około 15 minut.

3. Po 15 minutach rozmrożono ją w łaźni wodnej w 50^oC.

4. Po całkowitym rozmrożeniu ponownie wstawiono ją do zamrażarki na 15 minut.

5. Rozmrożono ją ponownie w łaźni wodnej w 50^oC.

6. Rozmrożoną zawiesinę rozlano do dwóch probówek wirowych po 5 ml do każdej, a następnie poddano odwirowaniu przez 5 minut w 6000 rpm.

7. Ekstrakty komórkowe z dwóch probówek wirówkowych zmieszano razem w jednej probówce wirowej, aby otrzymać roztwór o średnim stężeniu białka.

8. Otrzymany roztwór poddano rozcieńczeniu dwu-, cztero- i pięciokrotnym.

9. Następnie z każdego rozcieńczenia i nierozcieńczonej próbki pobrano 0,1 ml i umieszczono w 1 ml odczynnika Bradford. Dla każdego rozcieńczenia sporządzono dwie próby.

10. Tak przygotowane próby podano badaniu absorbancji.

Wyniki zbadanej absorbancji były następujące:

- dla nierozcieńczonego roztworu absorbancja wynosiła 1,528 i 1,508

- dla rozcieńczenia dwukrotnego absorbancja wynosiła 1,092 i 1,127

- dla rozcieńczenia czterokrotnego absorbancja wynosiła 0,522 i 0,557

- da rozcieńczenia pięciokrotnego absorbancja wynosiła 0,439 i 0,430

• 4,2625x=0,522-0,0274

4,2625x=0,4946

X=0,116mg/ml

• 4,2625x=0,557-0,0274

4,2625x=0,5296

X=0,124mg/ml

• Uśredniając: (0,116+0,124)/2=0,120mg/ml dla rozcieńczenia 4krotnego

• 4,2625x=0,439-0,0274

4,2625x=0,4116

X=0,0966mg/ml

• 4,2625x=0,430-0,0274

4,2625x=0,4026

X=0,0945mg/ml

• Uśredniając: (0,0966+0,0945)/2=0,0955mg/ml dla rozcieńczenia 5krotnego

• Zatem stężenie przed rozcieńczeniem wynosiło

- pierwszej próby: 0,120*4=0,48mg/ml

- drugiej próby: 0,0955*5=0,48mg/ml

Jeżeli pierwotnie mieliśmy 10ml zawiesiny, to cała dezintegracja 10g drożdży dała nam 4,8mg białka.

Dezintegracja mechaniczna okazała się skuteczniejsza od fizycznej.