Wykład 5

1

Doskonalenie cech produkcyjnych

mikroorganizmów o znaczeniu przemysłowym

Mikrobiologia Przemysłowa

1

Doskonalenie cech produkcyjnych
mikroorganizmów

Izolaty A B C D

5 etapów selekcji
mikroorganizmu
producenckiego

Zysk w korelacji z wydajnością

bioproduktu

z litra hodowli

Koszty
na litr
hodowli

2

Wykład 5

2

Doskonalenie cech produkcyjnych
mikroorganizmów



Procesy biotechnologiczne z zastosowaniem mikroorganizmów wyizolowanych

bezpośrednio ze środowiska naturalnego na ogół przebiegają z wydajnością

niewystarczającą, aby ich użycie na skalę przemysłową było opłacalne

ekonomicznie



Aby wykorzystać potencjał biotechnologiczny tych mikroorganizmów, przeprowadza

się modyfikację ich genotypu prowadzącą do uzyskania szczepów

produkcyjnych mogących znaleźć zastosowanie w przemyśle

3

Doskonalenie cech

produkcyjnych mikroorganizmu

Dziki izolat wybrany na

drodze selekcji

Mikroorganizm

udoskonalony in vitro

TRENING

POTENCJAŁU

Kowalski przed

Kowalski po

Analogia

Założenie – natura nie wykorzystuje

pełnego potencjału biotechnologicznego

organizmu producenckiego tak jak przeciętny

„Kowalski”

nie wykorzystuje

pełnego

potencjału własnego organizmu

4

Wykład 5

3

Co ma przynieść doskonalenie?

Koszty
na litr
hodowli

Zysk w korelacji z wydajnością

bioproduktu

z litra hodowli

Szczep dziki

Szczep zmodyfikowany

5

Którędy wiedzie droga?

Doskonalenie cech

produkcyjnych mikroorganizmu

MODYFIKACJA INFORMACJI

GENETYCZNEJ ZAWARTEJ W DNA

Mutageneza

Szczep Dziki = Szczep Natywny

Mutant

6

Wykład 5

4

Doskonalenie cech produkcyjnych
mikroorganizmów – wybór metody



Metody klasyczne

• mutageneza indukowana in vivo,
• selekcja
• adaptacja
• hybrydyzacja naturalna
• fuzja protoplastów komórek szczepów pochodzących od genetycznie

różniących się przodków.



Metody wykorzystujące techniki inżynierii

genetycznej

METODY

MODYFIKACJI DNA

7

Mutageneza.

Wykład 5

5

Mutageneza

Mutageneza - proces prowadzący do powstania mutanta

Mutant – mikroorganizm różniący się genotypem od komórek szczepu

macierzystego



zmiany

genotypowe w komórkach mutanta muszą być

trwałe



dziedziczone

przez komórki potomne



ich obecność musi nadawać szczepowi mutanta właściwości fenotypowe

różniące

go od

szczepu macierzystego

Mutacja – trwała zmiana w sekwencji DNA, która jest przekazywana komórkom

potomnym

Zmiana premutacyjna – zmiana w sekwencji DNA, która może być usunięta w

procesie replikacji

9



Substytucje



Delecje



Insercje



Modyfikacje zasad azotowych

Typy mutacji

10

Wykład 5

6

Typy mutacji



Substytucja – zmiana jednej pary zasad na inną



tranzycja (A↔G; T↔C) – zmiana jednej puryny na inną purynę lub zmiana jednej

pirymidyny na inną pirymidynę



transwersja (A↔T; C↔G) – zmiana pirymidyny na purynę lub puryny na pirymidynę

5’ ACGTAACG 3’
3’ TGCATTGC 5’
5’ ACGTAACG 3’ 5’ ACGTAACG 3’
3’ TGCATTGC 5’ 3’ TGCAT

C

GC 5’

3’ TGCA

C

TGC 5’

5’ ACGT

G

ACG 3’

zmiana premutacyjna

mutacja

11

Typy mutacji



Delecja - usunięcie jednej lub większej liczby par zasad

5’ CCGAAAAACGC 3’

3’ GGCTTTTTGCG 5’

A

5’ CCGA

A

AAACGC 3’ 5’ CCGA AAACGC 3’

3’ GGCTTTTTGCG 5’ 3’ GGCT TTTGCG 5’
3’ GGCTTTTGCG 5’
5’ CCGAAAACGC 3’

zmiana premutacyjna

mutacja

12

Wykład 5

7

Typy mutacji



Insercja – wstawienie jednej lub większej liczby par zasad

5’ CCGAAAAACGC 3’
3’ GGCTTTTTGCG 5’
5’ CCGAAAAACGC 3’ 5’ CCGAA AAACGC 3’
3’ GGCTTTTTGCG 5’ 3’ GGCTT TTTGCG 5’

T

3’ GGCTT

T

TTTGCG 5’

5’ CCGAAAAAACGC 3’

zmiana premutacyjna

mutacja

13

Modyfikacje zasad azotowych w DNA:



Deaminacja cytozyny – powoduje

powstanie uracylu

, nie zwiększa poziomu

mutacji spontanicznych



Metylacja cytozyny – powoduje

powstanie 5-metylocytozyny

, nie zwiększa

poziomu mutacji spontanicznych



Deaminacja 5-metylocytozyny – powoduje

powstanie tyminy

i po replikacji

mutację GC → AT

Typy mutacji

14

Wykład 5

8

Skutki mutacji

Mutacje punktowe



zmiana pojedynczego aminokwasu w sekwencji

białka



brak zmian sekwencji aminokwasowej białka



przedwczesna terminacja translacji

Delecje lub insercje



przesunięcie ramki odczytu



wstawienie

lub

usunięcie

pojedynczego

aminokwasu w sekwencji białka

15

Mutageneza



Mutageneza spontaniczna (samorzutna) –

proces powstawania mutacji

zachodzący niezależnie od określonych czynników zewnętrznych



błędy popełniane w czasie replikacji DNA



błędy powstające w wyniku samorzutnych modyfikacji chemicznych zasad DNA

Błędy takie nie są częste ze względu na zdolności korekcyjne polimeraz, jak również

dzięki działającemu po replikacji systemowi naprawy niedopasowanych
nukleotydów (MMR – mismatch repair).

Częstość mutagenezy spontanicznej



bakteriofag T4 – 10

-7



Escherichia coli – 10

-9



Drosophila melanogaster – 10

-10

16

Wykład 5

9



W praktyce częstość mutagenezy spontanicznej jest zbyt mała
żeby wykorzystywać to zjawisko do kreowania mutantów in vitro



Stąd w laboratorium przeprowadzamy tak zwaną mutagenezę
indukowaną

Mutageneza indukowana

17

Mutageneza indukowana



Mutageneza indukowana – proces powstawania mutacji na skutek
działania zewnętrznych czynników fizycznych lub chemicznych
(mutagenów)



Typy mutacji indukowanych



mutacje punktowe (substytucje, modyfikacje zasad azotowych)



delecje



insercje

Powstałe komórki mutantów różnią się genotypowo i fenotypowo

od komórek szczepu macierzystego oraz wzajemnie od siebie

18

Wykład 5

10

Mutageneza indukowana

CZYNNIKI MUTAGENNE

Fizyczne

Chemiczne

19

Czyniki chemiczne i fizyczne wykorzystywane w
doskonaleniu mikroorganizmów na drodze mutagenezy

Czynnik mutagenny

Sposób działania

Promieniowanie UV

powstanie dimerów pirymidynowych

Promieniowanie X

pęknięcia jedno- i dwuniciowego DNA

5-bromouracyl

analog tyminy, tworzy pary z guaniną – tranzycje pary AT↔GC

2-aminopuryna

analog adeniny, tworzy pary z cytozyną

Hydroksyloamina

hydroksylacja cytozyny, pochodna tworzy pary z adeniną

N-metylo-N’-nitro-N-nitrozoguanidyna synteza metyloguaniny podczas replikacji, powoduje tranzycje i

inne typy mutacji

Metanosulfonian metylowy
Metanosulfonian etylowy

alkilacja puryn i pirymidyn

Oranż akrydyny

interkalacja pomiędzy zasady w DNA, powoduje błędy replikacji i

mutacje typu insercja lub delecja

Kwas azotowy (III)

deaminacja adeniny, hipoksantyna tworzy pary z cytozyną
deaminacja guaniny, ksantyna tworzy pary z cytozyną
deaminacja cytozyny, uracyl tworzy pary z adeniną

20

Wykład 5

11



Długość fali ok. 260 nm – najbardziej absorbowane przez kwasy nukleinowe



powstawanie dimerów pirymidynowych tj. głównie TT, ale też TC i CC, w
jednoniciowym DNA oraz w RNA dochodzi też do hydratacji cytozyny i uracylu.



wysokie dawki (tysiące ergów na milimetr kwadratowy) prowadzą do powstania
wiązań - krzyżowych połączeń (cross-links) między dwiema nićmi DNA.



przy naświetlaniu promieniami o nieco dłuższej fali (280 nm), pochłanianymi głównie
przez białka, dochodzi do tworzenia wiązań pomiędzy tymi ostatnimi a DNA.

Promieniowanie UV

21



powstanie dimerów uniemożliwia replikację i transkrypcję mRNA



zmiany te powodują mutacje typu transwersje i tranzycje



powstają w podłożu duże zmiany, w wyniku których pojawiają się wolne rodniki (np.
[OH] itd.) oraz związki niestałe o charakterze nadtlenków. Związki te działają
utleniająco na inne składniki zawarte w środowisku, a ponadto i przede wszystkim,
podobnie jak wszelkie substancje utleniające, wywierają wpływ toksyczny na
komórki.

Promieniowanie UV

22

Wykład 5

12



naprawie podlegają tylko pewne typy uszkodzeń, np. dimery pirymidyn. Ponieważ
są one jednak odpowiedzialne za większość śmiertelnych efektów promieniowania,
te mechanizmy naprawy uszkodzeń odgrywają dużą rolę.



fotoreaktywacja usuwa u Escherichia coli najwyżej 50-80% uszkodzeń. Pozostałe,
nie usuwane przez fotoreaktywację, są przypuszczalnie związane z innymi
zmianami w komórce niż dimeryzacja pirymidyn.



promienie UV wykazują właściwości bójcze w stosunku do mikroorganizmów,
które nie są zdolne do usuwania uszkodzeń, bądź ilość zmian jest zbyt duża.

Promieniowanie UV

23



Promieniowanie X lub gamma



Wysoka energia powodująca jonizację cząsteczek przez wybicie elektronów



Powstające wolne rodniki reagują z zasadami azotowymi prowadząc do rozerwania
nici DNA jednej (uszkodzenia możliwe do naprawienia) lub obu (uszkodzenia
letalne)

Promieniowanie jonizujące

24

Wykład 5

13



Antymetabolity przypominające puryny i pirymidyny



Po włączeniu do łańcucha wykazują skłonność do tworzenia pary z błędnie
dobraną zasadą purynową lub pirymidynową



5-bromouracyl, 5-bromodeoksyurydyna, 2-aminopuryna

Analogi zasad

25

Czynniki chemiczne



Modyfikują zasady azotowe w DNA



Powstają błędy podczas replikacji w wyniku błędnego parowania zasad



Mutacje punktowe

26

Wykład 5

14

Związki alkilujące



Alkilacja zasad azotowych wywołana obecnością grup metylowych, etylowych i
innych występujących w tych związkach



Podstawienie właściwej zasady inną, opuszczenie lub dodanie nukleotydu



Metylo- i etylometanosulfonian (MMS i EMS)



Dietylo i dimetylosiarczan (DES i DMS)



Iperyt



N-metylo-N’-nitro-N-nitrozoguanidyna (MNNG)

27

Barwniki akrydynowe



Interkalacja pomiędzy sąsiednie pary zasad w dwuniciowym DNA



Podczas replikacji następuje wstawienie lub utrata dodatkowego nukleotydu



Oranż akrydyny

28

Wykład 5

15

Etapy mutagenizacji



Dodanie mutagenu do hodowli i jego penetracja do komórki



Oddziaływanie na DNA (niestabilne zmiany pierwotne)



Procesy naprawcze (rewersja mutacji lub zmiany wtórne)



Stabilizacja mutacji umożliwiająca utrzymanie mutacji w kolejnych pokoleniach



Zmiany biochemiczne i ujawnienie się fenotypowe mutacji

29

1

– mutacje pierwotne

2

– mechanizm naprawczy;

odtworzenie stanu
pierwotnego
3

– mechanizm naprawczy;

mutacje wtórne
4

– śmierć komórki

5

– śmierć komórki

6

– namnażanie

zmutowanych komórek

Kierunki i skutki zmian genotypu w wyniku mutagenezy

Mutageneza indukowana

Dawka mutagenu



zbyt duża dawka czynnika mutagennego prowadzić może do śmierci wszystkich
komórek szczepu macierzystego poddanych jego działaniu



duże dawki czynnika mutagennego prowadzą do uszkodzenia DNA w wielu
miejscach genomu



mutacje pożądane mogą być maskowane przez mutacje niekorzystne

optymalna dawka mutagenu powoduje efekt letalny u max 90% komórek
poddawanych mutagenezie

Wielkość dawki czynnika mutagennego zależy od:



właściwości szczepu poddawanego mutagenezie



warunków hodowli



wieku hodowli

30

Wykład 5

16

Efekt letalny
- Dla każdego badanego szczepu mikroorganizmu dawkę czynnika mutagennego

należy wyznaczyć empirycznie

Mutageneza indukowana

Np. Seryjne rozcieńczenia czynnika

mutagennego

31

Mutageneza indukowana

Rewersja mutacji - proces usunięcia mutacji powstałych w niektórych

komórkach mikroorganizmu pod wpływem działania czynnika mutagennego

Rewersja mutacji zachodzi na drodze działania mechanizmów

naprawczych takich jak np.

fotoreaktywacja, reaktywacja rekombinacyjna

.

Efektem rewersji mutacji jest

przywrócenie wyjściowego genotypu

mikroorganizmu

Rewersja
mutacji

32

Wykład 5

17

Mutageneza indukowana

Mechanizmy naprawcze:



Niemutagenne



wolne od błędów poreperacyjnych



fotoreaktywacja, wycinanie uszkodzonych fragmentów, resynteza
DNA oraz rekombinacja



Mutagenne



pojawiają się wtórne, trwałe błędy w DNA



mechanizm SOS indukowany przy zatrzymaniu replikacji DNA



uszkodzenia poreperacyjne są głównym źródłem mutantów

33

Rewersja mutacji



Fotoreaktywacja - rozszczepienie dimerów poprzez

fotoliazę

– enzym aktywny w

świetle widzialnym (320 – 370 nm), efektem jest przywrócenie do stanu pierwotnego



Reaktywacja ciemna – przebiega bez udziału światła –

kompleks

specyficznych

nukleaz usuwa dimery

powstałe podczas naświetlania,

przerwa

w łańcuchu

wypełniana

jest przez

polimerazę DNA I

, a fragmenty są scalane przez

ligazę

34

Wykład 5

18

Rewersja mutacji



Reaktywacja rekombinacyjna lub poreplikacyjna – powstanie przerw w
miejscach wystąpienia dimerów podczas syntezy nowej nici, duża dawka
promieniowania doprowadza do powstania wielu przerw w nici DNA

W wyniku wielokrotnego procesu rekombinacji następuje usunięcie przerw, ale

reperacja DNA nie jest bezbłędna.

Uważa się, że naprawa rekombinacyjna jest głównym źródłem mutacji

indukowanych przez promieniowanie UV.

Najczęściej mutacje te są wynikiem podstawienia zasad lub delecji i

przesunięcia ramki odczytu.

35

Promieniowanie UV (254-265 nm)

Zalety



Wysoka częstotliwość powstawania mutacji w stosunku do efektu letalnego



Dostępność i łatwość użycia źródła promieniowania



Łatwość dozowania dawek



moc lampy



odległość od zawiesiny komórek



czas działania



Łatwość odtwarzania warunków mutagenezy



Możliwość wywołania mutacji w rosnących komórkach wegetatywnych i
sporach

36

Wykład 5

19

Promieniowanie UV (254-265 nm)

Sposób postępowania



przygotować zawiesinę komórek w soli fizjologicznej lub pożywce wzrostowej (10

5

–

10

6

komórek /ml); wysokość warstwy zawiesiny nie powinna przekraczać kilku mm



lampę UV umieścić kilkadziesiąt cm nad zawiesiną komórek



prowadzić mutagenezę przez kilka minut



wysiać zawiesinę w postaci murawy na szalki Petriego z podłożem wzrostowym



inkubować w ciemności

37

Selekcja mutantów

Szczep dziki z

aktywnością

proteolityczną

Płytki z agarem

mlecznym

Mutageneza indukowana

38

Wykład 5

20

Typy mutantów



Opornościowe



Auksotroficzne



Kataboliczne



Temperaturozależne



Regulatorowe

39

Selekcja mutantów



Mutanty opornościowe



oporne na inhibitory, antybiotyki lub bakteriofagi



bezpośredni posiew na podłoże zawierające czynnik toksyczny



metoda replik



metoda płytek gradientowych



Mutanty auksotroficzne



Niezdolne do syntezy witamin, aminokwasów, kwasów nukleinowych lub innych
składników budulcowych komórki



bezpośredni posiew na podłoże zawierające śladowe ilości składników, których
komórki nie potrafią syntetyzować



metoda pośrednia – metoda replik

40

Wykład 5

21

Selekcja mutantów auksotroficznych
- metoda replik

1, 3 – podłoże kompleksowe; 2 – podłoże minimalne

41

Selekcja mutantów



Mutanty kataboliczne



defekt w enzymatycznych szlakach metabolicznych



bezpośredni posiew na podłoże z dodatkiem wskaźnika



Mutanty temperaturozależne



Temperaturooporne i temperaturowrażliwe



Inkubacja w odpowiedniej temperaturze



Mutanty regulatorowe



Zmienna szybkość syntezy jednego lub kilku enzymów metabolicznych



Hodowla ciągłą w warunkach ograniczania wzrostu z małym stężeniem
substratu, selekcja w obecności antymetabolitów hamujących wzrost komórek
niezmienionych

42

Wykład 5

22

Mutageneza indukowana = „Genetycy
strzelają Pan Bóg kule nosi”

CEL

Efekt uboczny nalotu

Efekt uboczny nalotu

CEL NALOTU

43

Mutageneza indukowana = „Genetycy
strzelają Pan Bóg kule nosi”

DNA

Produkcja

energii

komórkowej

Produkcja

białek

Mechanizmy

naprawcze

DNA

MUTACJE

44

Wykład 5

23

Selekcja mutantów dla zawansowanych

Proteaza [aktywność]

Mutant Szczep Dziki

Testy produkcyjne w bioreaktorze na podłożu hodowlanym wskazują na

sukces

.

Tyle czy na pewno?

Hodowla

45

Wzrost hodowli [liczba komórek]

Mutant Szczep Dziki

Niekoniecznie

sukces

- mutant adaptuje się trudniej niż szczep dziki na podłożu

wzrostowym

Czas

Hodowla

Selekcja mutantów dla zawansowanych

46

Wykład 5

24

Wniosek 

Zysk = Strata

47

Mutageneza indukowana dla zawansowanych

Płytki z agarem

mlecznym

Mutageneza

indukowana 1

cykl

Mutageneza

indukowana 2

cykl

Testy

Produkcyjne

• Z reguły wykonuje się 3 cykle MI i TP

• Więcej nie ma sensu bo występuje nasilenie efektu letalnego wskutek
gromadzenia się w genomie „szkodliwych mutacji”

48

Wykład 5

25

Selekcja mutantów dla zawansowanych

Wzrost hodowli [liczba komórek]

Czas

Mutant 1

generacja

Hodowla

Szczep

dziki

Mutant 2

generacja

49

Wzrost hodowli [liczba komórek]

Czas

No dobrze ale jak uzyskać
szczep który z jednej
strony produkuje więcej
proteazy niż szczep dziki
ale zachowuje jego
parametry wzrostowe na
pożywce hodowlanej?

Selekcja mutantów dla zawansowanych

50

Mutant 1

generacja

Szczep

dziki

Mutant 2

generacja