Wykład 3

1

POZYSKIWANIE SZCZEPÓW MIKROORGANIZMÓW O

ZNACZENIU PRZEMYSŁOWYM (cz. 1)

Mikrobiologia Przemysłowa

1

Drobnoustroje w przemyśle



Nowoczesne technologie

wymagają często użycia szczepów

produkcyjnych o

ściśle określonych właściwościach metabolicznych



Spośród drobnoustrojów dzikich, występujących w środowisku,

można wyselekcjonować szczepy wyróżniające się przydatnością do

określonych celów biotechnologicznych

2

Wykład 3

2

Źródła szczepów mikroorganizmów

o znaczeniu przemysłowym

Źródło

szczepu

Środowisko

naturalne

Środowisko

przekształcone

przez człowieka

Kolekcje

szczepów

Inne źródła

Zwykle wymagają udoskonalenia określonych cech produkcyjnych

Dobór środowiska często decyduje o właściwościach mikroorganizmów, które izolujemy

3

Mikroorganizmy hodowalne

ok. 1%

Mikroorganizmy

niehodowalne

ok. 99%

Biblioteka

genomnowa

(źródło genów)

Testy

selekcyjne

(skrining)

Szczep przemysłowy

Biblioteka

metagenomowa

(źródło genów)

eDNA

Kolekcja szczepów

DNA

4

Wykład 3

3

Środowisko naturalne

Park Yellowstone

Pustynia Danakilska

Kominy hydrotermalne

Lodowiec

Jaskinia Demianowska

Antarktyda



Poszukiwanie nowego, dotąd nieopisanego szczepu o pożądanych przez nas
właściwościach



Wody powierzchniowe, gruntowe, gorące źródła, gleby, lodowce itp.

5

Środowisko przekształcone przez człowieka



Środowisko wzbogacone związkami / czynnikami,
które naturalnie nie są powszechne w środowisku



Obecność mikroorganizmów o specyficznych
właściwościach i wymaganiach pokarmowych



Np. tereny uprzemysłowione, po katastrofach
ekologicznych

6

Wykład 3

4

Kolekcje przechowalnicze szczepów



Komercyjne i przemysłowe:



Zapewnienie dostępności odpowiednich kultur starterowych mikroorganizmów o
już ustalonych cechach

np. kolekcje piwowarskie, winiarskie, jogurtowe



Badawcze



Przechowywane są szczepy dobrze poznane

i wstępnie zaklasyfikowane mikroorganizmy

Szczepy z kolekcji można poddawać
screeningowi pod kątem wielu aktywności

7

Inne źródła



Modyfikacja scharakteryzowanych już szczepów



Szczepy (dobrze scharakteryzowane) z kolekcji mikroorganizmów mogą być gospodarzem dla

genów heterologicznych, pochodzących z innych organizmów



Źródłem genów może być DNA mikroorganizmów wyizolowanych i/lub

przechowywanych w kolekcjach przechowalniczych, poddanych skreeningowi lub

DNA metagenomowe (środowiskowe).

8

Wykład 3

5

Proces pozyskiwania mikroorganizmów do zastosowań w
przemyśle obejmuje następujące po sobie etapy

1. Pobranie próby ze środowiska naturalnego

2. Hodowla wzbogacająca

3. Test selekcyjny

4. Testy fermentacyjne

5. Identyfikacja gatunkowa wybranego mikroorganizmu

9

Pozyskiwanie szczepów mikroorganizmów

o znaczeniu przemysłowym

Izolacja nowych

mikroorganizmów

o pożądanych cechach

Badanie znanych szczepów

• nowe sposoby hodowli

• bardziej czułe metody analityczne

• modyfikacje

10

Wykład 3

6

Pozyskiwanie szczepów mikroorganizmów
o znaczeniu przemysłowym

11

1. Pobranie próby ze środowiska



Środowisko (naturalne lub przekształcone przez człowieka), to wybrane przez nas na
drodze racjonalnego wyboru

źródło

mikroorganizmów, z którego spodziewamy się

wyizolować, z zastosowaniem klasycznych technik mikrobiologicznych, mikroorganizmy o
właściwościach, które stanowią o ich atrakcyjności biotechnologicznej

Kryterium wyboru miejsca pobrania próby

założenia projektowe

12

Wykład 3

7



Metody stosowane przy pobieraniu i przechowywaniu próbek z

określonych

środowisk

naturalnych

zdeterminowane

są

właściwościami fizyko-chemicznymi mikroorganizmów w nim

występujących, na których nam zależy.

Pobranie próby ze środowiska

13



pobranie materiału zawierającego jak najwięcej mikroorganizmów o

poszukiwanych cechach przy jednoczesnej eliminacji / ograniczeniu

występowania drobnoustrojów niepożądanych.

Pobranie próby ze środowiska

Dominant

Szczep bakterii o poszukiwanych
właściwościach

14

Wykład 3

8

Pobranie próby ze środowiska



Założenie projektowe:

wydajna enzymatyczna hydroliza laktozy w mleku w temperaturze 10-15

o

C



Miejsce pobrania próby:

„środowiska naturalne” obfitujące w gatunki mikroorganizmów

psychrofilnych i psychrotrofowych

•

gleba regionów polarnych

•

gleby wysokogórskie

•

wody jezior polarnych i wysokogórskich

•

wody mórz i oceanów

•

przewody pokarmowe ryb i skorupiaków

stale żyjących w strefie polarnej

15

Pobranie próby ze środowiska



Założenie projektowe:

przetwórstwo skrobi – wytwarzanie syropów glukozowych



Miejsce pobrania próby:

„środowiska naturalne” obfitujące w gatunki mikroorganizmów

termofilnych i hipertermofilnych

• gorące źródła

• solfatary



Założenie projektowe:

nowe antybiotyki



Miejsce pobrania próby:

„środowiska naturalne” obfitujące w gatunki promieniowców

• gleba

• rozkładająca się masa roślinna

• torfowiska

16

Wykład 3

9



Założenie projektowe:

bioremediacja gleby skażonej produktami ropopochodnymi


Miejsce pobrania próby:

środowiska obfitujące w gatunki mikroorganizmów

zdolnych do biodegradacji węglowodorów

•

gleba okolic lotnisk

•

gleba okolic stacji paliw

•

gleba okolic torowisk kolejowych



Założenie projektowe:

bioremediacja gleby skażonej pierwiastkami radioaktywnymi


Miejsce pobrania próby:

środowiska obfitujące w gatunki mikroorganizmów

odpornych na promieniowanie jonizujące

Pobranie próby ze środowiska

17

Pobranie próby ze środowiska

Miejsce pobrania próbki

Udział bakterii rozkładających paliwa w ogólnej

liczbie drobnoustrojów glebowych [%]

Lotnisko

0,2 – 2,2

Stacja paliw

0,01 – 0,29

Torowisko kolejowe

0,03 – 1,09

Izolacja gatunków mikroorganizmów dominujących w populacj drobnoustrojów

w danym środowisku nie stanowi problemu

Problem:

mikroorganizmy potencjalnie przydatne w procesach przemysłowych

to tylko niewielki odsetek całej populacji

18

Wykład 3

10

2. Sposoby zwiększania liczebności
poszukiwanych drobnoustrojów



Oddziaływanie na środowisko przed pobraniem próby



Wprowadzenie do środowiska wabików – pułapek



Wstępna obróbka fizyczna lub mechaniczna próbki



Hodowla wzbogacająca

19

Oddziaływanie na środowisko przed

pobraniem próby

1. Wprowadzenie środka
selekcyjnego (Atrazyna)

2. Inkubacja

Gleba

3. Pobranie

próby

4. Posiew

Zwiększenie liczby promieniowców

20

Wykład 3

11

Stosowanie wabików

1. Wprowadzenie wabika

(elementy na których rozwijają się pożądane

mikroorganizmy)

2. Inkubacja

Gleba

3. Pobranie próby

4. Posiew

Pałeczki powlekane parafiną – Streptomyces
Pyłek kwiatowy drzew iglastych – Actinoplanaceae

21

Wstępna obróbka fizyczna lub mechaniczna

3. Inkubacja

Gleba

1. Pobranie próby

4. Posiew

2. Wstępna obróbka

- Zmieszanie próby z kredą – zwiększenie liczby
promieniowców i redukcja grzybów

- Odwirowywanie spor promieniowców

- Inkubacja próbki w odpowiednio niskiej/wysokiej
temperaturze

22

Wykład 3

12

Hodowla wzbogacająca

Hodowla wzbogacająca

- metoda ta opiera się na wprowadzeniu do

próbki pobranej ze środowiska związków chemicznych mogących

pełnić rolę czynnika selekcyjnego, pozwalającego na zmiany

liczebności

mikroorganizmów

tworzących

populację

drobnoustrojów zawartych w badanej próbce, podczas jej inkubacji w

określonych warunkach fizykochemicznych, tj. temperatura, czas

inkubacji.

23

H. wzbogacająca z zastosowaniem podłoży
wzbogacających

Gleba

1. Pobranie próbki
środowiskowej

2. Inkubacja w pożywce zawierającej
czynnik selekcyjny

Np. glicerol lub laktoza jako źródło węgla

cykloheksamid lub nystatyna - hamowanie wzrostu
grzybów

Tetracykliny – hamowanie wzrostu bakterii

3. Posiew

24

Wykład 3

13

Metody izolacji czystych kultur



Aby móc wyizolować konkretny
szczep mikroorganizmu i go
zidentyfikować

w

pierwszej

kolejności należy wyodrębnić go w
postaci czystej kultury



Najczęściej izolowane w postaci
kolonii z podłóż zestalonych

25

Posiew – izolacja czystych kultur



Technika seryjnych (wielokrotnych) rozcieńczeń (Józef Lister)



Metoda płytkowa (Robert Koch)



metoda rozsiewu (posiew redukcyjny, metoda suchych rozcieńczeń)



metoda płytek lanych



metoda wysiewu powierzchniowego

26

Wykład 3

14



Posiew techniką seryjnych (wielokrotnych) rozcieńczeń pozwala

bardzo dokładnie określić ilość bakterii w wyjściowej zawiesinie.



Podstawą metod ilościowych jest prawo mówiące, że z jednej

bakterii w roztworze wyjściowym powstaje na drodze podziałów

jedna kolonia.

Posiew – izolacja czystych kultur

27

Technika

seryjnych

(wielokrotnych)

rozcieńczeń

Oznaczanie najbardziej prawdopodobnej liczby drobnoustrojów (NPL).










Z kolejnych rozcieńczeń wykonuje się posiewy na podłoże płynne (min. 2 powtórzenia) i inkubuje
w odpowiedniej temperaturze.

Odczytuje się próby dodatnie (wzrost w podłożu) i korzystając z tablic McCrady’ego wylicza się
NPL.

W końcowych rozcieńczeniach nie powinno być już mikroorganizmów.

28

Wykład 3

15

Metoda płytkowa



Stosowana do



Określania liczby mikroorganizmów



Izolowania czystych kultur



Obserwacji morfologii kolonii

29

Metoda płytkowa



Posiew odpowiednio rozcieńczonej próbki na

podłoże stałe – w 1 cm

3

powinno znajdować się od

30 do 300 komórek.



Posiew można wykonać metodą



wgłębną (komórki mieszane z podłożem i

wylewane)



powierzchniową

(komórki

wysiewane

na

powierzchnię)

30

Wykład 3

16

Metoda wysiewu powierzchniowego

Zliczanie jednostek tworzących kolonię (jtk lub cfu – colony forming units)
Wysianie odpowiednich rozcieńczeń w kilku powtórzeniach.
Jeżeli ilość kolonii w powtórzeniach nie różni się więcej niż 10%, to obliczamy średnią wartość
arytmetyczną podstawiając do odpowiedniego wzoru.

31

Posiew redukcyjny

Tzw. metoda suchych
rozcieńczeń

32

Wykład 3

17

Typy posiewów redukcyjnych

33

3. Test selekcyjny



Podstawowa metoda identyfikacji mikroorganizmów wykorzystywanych w przemyśle



W konstrukcji tego rodzaju testów poszukuje się cechy biochemicznej powiązanej

bezpośrednio lub pośrednio ze zdolnością mikroorganizmu do produkcji

wybranego bioproduktu



Obecnie dąży się do opracowania testów selekcyjnych umożliwiających prostą i

szybką identyfikację mikroorganizmów o poszukiwanych właściwościach

biochemicznych

34

Wykład 3

18

Test selekcyjny – poszukiwanie mikroorganizmu
produkującego β-D-galaktozydazę

Podłoże selekcyjne zawiera substrat

X-gal

(5-bromo-4-chloro-3-indolylo-β-D-galaktopiranozyd)

i induktor IPTG (izopropylo-β-D-galaktopiranozyd)

Klony posiadające aktywność
β-D-galaktozydazy

Selekcja z wykorzystaniem wskaźników

35

Test selekcyjny – poszukiwanie mikroorganizmu
wytwarzającego kwasy organiczne

Selekcja z wykorzystaniem wskaźników

Zastosowanie wskaźnika pH np. błękitu bromofenolowego, czerwieni obojętnej lub fenolowej

Podłoże Chapmana z dodatkiem mannitolu

i wysokim stężeniem NaCl do identyfikacji

gronkowców.

Zakwaszone środowisko

36

Wykład 3

19

Test selekcyjny – poszukiwanie mikroorganizmu o
aktywności proteolitycznej

Aktywność proteolityczna

Zastosowanie

podłoża

wzbogaconego

odtłuszczonym mlekiem jako wskaźnika dla

aktywności

enzymów

proteolitycznych

syntetyzowanych przez mikroorganizmy

37

Test selekcyjny – Metoda podwójnej hodowli na
płytkach Petriego

A – zastosowanie folii półprzepuszczalnej; B – zastosowanie podwójnych płytek z przegrodą
półprzepuszczalną; C – metoda bloczków agarowych

Do identyfikacji szczepów produkujących antybiotyki, witaminy i aminokwasy
zewnątrzkomórkowo.

Aby uniknąć

zanieczyszczenia

szczepu badanego

szczepem testowym

stosuje się cienką folię
celofanową lub płytki z

półprzepuszczalną

membraną

38

Wykład 3

20



Wokół kolonii wytwarzających antybiotyki powstają strefy zahamowania wzrostu

szczepu testowego, których wielkość zależy od ilości produkowanego antybiotyku

wydzielanego poza komórkę

Test selekcyjny – Metoda podwójnej hodowli na
płytkach Petriego

Strefa zahamowania wzrostu



W przypadku szczepów nadprodukujących aminokwasy lub witaminy stosuje się

szczepy testowe tzw. mutanty auksotroficzne (pokarmowe).

Strefy wzrostu wokół kolonii testowanych świadczą o wytwarzaniu i wydzielaniu

pozakomórkowym badanego metabolitu

39

Test selekcyjny – poszukiwanie mikroorganizmu
produkującego inhibitor enzymu rozkładającego antybiotyk

Metoda bloczków agarowych połączona z użyciem wskaźnika barwnego

Oporność mikroorganizmów na antybiotyki wiąże się m.in. z syntezą enzymów , które je inaktywują na
drodze degradacji lub blokowania grup reaktywnych.

Nitrocefina (chromogen) – substrat β-laktamazy (enzym rozkładający antybiotyki β-laktamowe),
półsyntetyczna cefalosporyna.

I.

Zalanie bloczków agarem z dodatkiem β-laktamazy i inkubacja

II. Pokrycie warstwą agaru z dodatkiem nitrocefiny

Wokół kolonii wytwarzających inhibitory β-laktamazy pozostaje niezmieniona

żółta strefa

(enzym

nie rozłożył analogu antybiotyku), zaś cała płytka w wyniku degradacji nitrocefiny, zmienia kolor
na

czerwony

.

40

Wykład 3

21

Test selekcyjny – poszukiwanie mikroorganizmu
odpornego na wysokie stężenie substancji toksycznej

Metoda płytek gradientowych

Ze zmianą stężenia związku toksycznego zmienia się ilość i wielkość kolonii badanego szczepu w
zależności od jego wrażliwości na dany związek.

Analogicznie można stosować zestaw płytek z różnymi stężeniami związku toksycznego.

41

Test selekcyjny - Metoda replik



Zastosowanie stempla, za pomocą którego kolonie z płytki wyjściowej są przenoszone

(replikowane) na płytki z podłożem selekcyjnym.



Kolonie wyrosłe na replikach służą do testowania syntezy metabolitów lub oporności na

związki toksyczne, podczas gdy płytka wyjściowa może posłużyć do izolacji wybranych

kolonii.

42

Wykład 3

22

Z kolonii, które przeszły testy selekcyjne z wynikiem

pozytywnym, za pomocą posiewu redukcyjnego zostają

wyprowadzone czyste kultury, które poddawane są następnie

testom fermentacyjnym

43

4. Testy fermentacyjne



Pozwalają na ocenę stopnia przydatności w przemyśle poszczególnych izolatów

mikroorganizmów wyselekcjonowanych w testach selekcyjnych



Ich celem jest wybór mikroorganizmu przeprowadzającego określony proces

biotechnologiczny z największą wydajnością po uwzględnieniu kosztów

ekonomicznych związanych z prowadzeniem procesu produkcji wybranego

bioproduktu na skalę przemysłową

44

Wykład 3

23

Testy fermentacyjne



Prowadzone są w niewielkich bioreaktorach o pojemności 5-20l



W testach tych ustala się optymalną metodę hodowli badanego mikroorganizmu



wybór określonego rozwiązania konstrukcyjnego bioreaktora



wybór sposobu hodowli (ciągła, dolewowa, okresowa)



warunki fizyko-chemiczne hodowli



skład pożywki hodowlanej

45

Wybrane, na podstawie testów fermentacyjnych mikroorganizmy,

zostają poddane badaniom mającym ustalić ich przynależność

gatunkową

46