Wykład 4

1

POZYSKIWANIE SZCZEPÓW MIKROORGANIZMÓW O

ZNACZENIU PRZEMYSŁOWYM cz. 2

Mikrobiologia Przemysłowa

1

Proces pozyskiwania mikroorganizmów do zastosowań w
przemyśle obejmuje następujące po sobie etapy

1. Pobranie próby ze środowiska naturalnego

2. Hodowla wzbogacająca

3. Test selekcyjny

4. Testy fermentacyjne

5. Identyfikacja gatunkowa wybranego mikroorganizmu

2

Wykład 4

2

5. Identyfikacja taksonomiczna
mikroorganizmów

Identyfikacja taksonomiczna mikroorganizmu -

określenie

przynależności badanego organizmu do odpowiedniej

jednostki taksonomicznej,

najczęściej gatunku

3

Drzewo życia – czyli filogenetyczny podział organizmów
planety Ziemia

FILOGENETYKA -

dyscyplina biologii

zajmująca się odtwarzaniem dróg rozwoju

rodowego

poszczególnych grup organizmów, zarówno żyjących współcześnie, jak

i w epokach minionych

4

Wykład 4

3

Drzewo życia – czyli filogenetyczny podział
organizmów planety Ziemia



Drzewo filogenetyczne zbudowane jest w oparciu o taksony



Takson - grupa organizmów na tyle do siebie podobnych, że można ją wyróżnić i
zaklasyfikować do kategorii systematycznej np. klasy, rodziny, rodzaju, gatunku



Podstawową jednostką klasyfikacji biologicznej jest gatunek



System klasyfikacji musi być oparty na cechach występujących we wszystkich
żywych organizmach

5

Identyfikacja taksonomiczna
mikroorganizmów



Gatunek (w ujęciu mikrobiologicznym) - populacja mikroorganizmów wykazujących
wysoki stopień podobieństwa w ściśle określonym zakresie cech, a różniących się
od innych gatunków tego samego rodzaju;



Szczep – grupa drobnoustrojów potomnych jednej komórki



Szczep referencyjny – izolat danego gatunku opisany jako pierwszy i najlepiej

scharakteryzowany (wzorzec)

6

Wykład 4

4

Identyfikacja taksonomiczna bakterii



Gatunek



to grupa szczepów, w tym szczep referencyjny, wykazujących co najmniej 70%
homologii pełnego genomowego DNA (hybrydyzacja DNA-DNA)



grupa szczepów różniących się zawartością G+C w genomowym DNA nie więcej
niż o 3% molowe

nG + nC
% G+C = x 100%
nA + nT + nC + nG

przy czym tylko te cechy nie mogą decydować o przynależności do gatunku



W obrębie rodzaju różnice w %mol G+C nie mogą przekroczyć 10%

7

Cechy umożliwiające identyfikację mikroorganizmów

prokariotycznych - metody konwencjonalne



morfologia



skład chemiczny ściany komórkowej



obecność inkluzji komórkowych i substancji zapasowych



zdolność do tworzenia pigmentów



sposób odżywiania



wymagania pokarmowe



źródła C, N, S



skład jakościowy i ilościowy produktów fermentacji



wymagania tlenowe



zakres temperatur i pH wzrostu



wrażliwość na antybiotyki



patogenność



zależności symbiotyczne z innymi organizmami



środowisko występowania



obecność określonych antygenów (charakterystyka immunologiczna)

8

Wykład 4

5

Cechy umożliwiające identyfikację grzybów - metody

konwencjonalne

Sposób generatywnego rozmnażania się



W identyfikacji drożdży rozpatruje się ponadto:



Cechy morfologiczne komórki



Sposób rozmnażania wegetatywnego



Cechy hodowlane populacji na pożywkach płynnych i stałych



Pigmentację



Zdolność tworzenia wegetatywnych spor, pseudogrzybni i grzybni



Cechy biochemiczne (synteza ureazy, asymilacja i fermentacja różnych

źródeł węgla i azotu)



Osmotolerancyjność i osmofilność



Budowa ściany komórkowej, zawartość glukanów, mannanów i chityny



Ekologia



Patogenność



Podstawą identyfikacji grzybów strzępkowych jest:



Morfologia i cechy makroskopowe grzybni oraz cechy biochemiczne

9

Obserwacja komórek bakterii

•

Obserwacje mikroskopowe żywych bakterii nie pozwalają na rozpoznanie kształtów i

szczegółów struktur komórkowych. Kształt bakterii obserwuje się zwykle po ich

wybarwieniu.

•

Do celów diagnostycznych stosuje się barwienie różnicujące, metodę Grama,

która jest podstawą podziału bakterii na dwie grupy o odmiennych cechach

fizjologicznych i biochemicznych.

10

Wykład 4

6

Hans Christian Gram

(13.09.1853 – 14.11.1938)

Duński farmakolog i lekarz. W
roku 1884 opublikował autorską
metodę barwienia bakterii.

Dokonał przełomowego odkrycia
przyczyniającego się do rozwoju
mikrobiologii

11

Budowa ściany komórkowej bakterii G+ i G-

12

Wykład 4

7

13

Obserwacja przetrwalników bakteryjnych



Metoda Schaeffera-Fultona



Barwienie przetrwalników zielenią malachitową na gorąco



Dobarwianie komórek wegetatywnych fuksyną zasadową

Bacillus subtilis

14

Wykład 4

8

Metody identyfikacji mikroorganizmów

Podział metod identyfikacji mikroorganizmów:



biochemiczne



biofizyczne



biologii molekularnej



immunochemiczne

15

I. Metody biochemiczne

Polegają na określeniu zdolności mikroorganizmów do asymilacji, fermentacji

lub rozkładu określonych związków chemicznych



cechy biochemiczne określa się na podstawie reakcji chemicznych
zachodzących w odpowiednio skomponowanych pożywkach wzrostowych



wyniki testów biochemicznych odczytuje się makroskopowo



wzrost lub jego brak



zmiana zabarwienia pożywki



reakcja barwna po wprowadzeniu odczynnika reagującego z wytwarzanym metabolitem



wytworzenie gazu

16

Wykład 4

9

Metody biochemiczne



Poszczególne taksony

mikroorganizmów posiadają

charakterystyczne dla nich szlaki

enzymatyczne

17

Metody biochemiczne



Obecnie stosuje się zestawy miniprobówek lub płytek zawierających odwodnione

podłoża z ewentualnym indykatorem.



Czysta kultura o określonej gęstości jest zawieszana w rozcieńczalniku, a następnie

taka sama objętość mieszana jest z podłożem.

18

Wykład 4

10

Testy biochemiczne

INKUBACJA

(18 – 48 h)

Zawieszenie

Naniesienie

Interpretacja wyników w teście API (bioMerieux)

Identyfikacja ponad 550 gatunków bakterii (głównie
chorobotwórczych) oraz drożdży

19

Testy biochemiczne



Istnieją również wersje zautomatyzowane, gdzie wynik w postaci odczytu

densytometrycznego zawiesiny jest analizowany przez odpowiedni program.



Wynik testu może być również wprowadzany w postaci numerycznej do programu,

który analizuje dane i generuje listę możliwych gatunków wraz z %

prawdopodobieństwa identyfikacji.

20

Wykład 4

11

Testy biochemiczne



Przykładem takiego uniwersalnego testu biochemicznego do identyfikacji

mikroorganizmów (bakterii, drożdży i grzybów) jest system „Biolog" firmy „Biolog

Inc", który służy do identyfikacji ponad 2500 gatunków drobnoustrojów.



96 studzienek



Forma mikropłytki umożliwia uzyskanie charakterystycznego obrazu testu

unikatowego dla gatunku drobnoustroju

21

II. Metody biofizyczne

Umożliwiają identyfikację taksonomiczną mikroorganizmów poprzez oznaczanie

produktów ich metabolizmu lub wybranych związków wchodzących w skład

struktur komórkowych



Techniki elektroforetyczne



Techniki oparte na chromatografii gazowej

22

Wykład 4

12

Identyfikacja drobnoustrojów za pomocą
technik elektroforetycznych

Identyfikacja drobnoustrojów za pomocą technik elektroforetycznych oparta jest
na analizie profili białkowych



skład ilościowy i jakościowy wszystkich białek komórkowych, który jest
charakterystyczny dla danej jednostki taksonomicznej

Sposób postępowania:



izolacja białek komórkowych



rozdział elektroforetyczny w żelu poliakrylamidowym



barwienie rozdzielonych białek, co umożliwia uzyskanie obrazu profili
polipeptydowych charakterystycznych dla danego gatunku mikroorganizmu



porównanie z profilami białkowymi bazy danych

Metoda pozwalająca określić przynależność gatunkową mikroorganizmu

23

Identyfikacja drobnoustrojów za pomocą
technik elektroforetycznych

Elektroforeza dwukierunkowa

Przed identyfikacją białek często stosuje
się inkubację hodowli w pożywce
zawierającej marker metaboliczny, np.
znakowaną

radioaktywnie siarkę

, która

zostaje wbudowana do białek komórek
badanego szczepu.

Po rozdziale obraz żelu jest odczytywany
(skaner promieniowania β lub
densytometr), a następnie porównywany
przez odpowiedni program z bazą danych

.

24

Wykład 4

13

Identyfikacja mikroorganizmów w oparciu
o chromatografię gazową



Analiza profili kwasów tłuszczowych pochodzących z lipidów ściany
komórkowej



skład kwasów tłuszczowych jest unikalny i charakterystyczny dla każdego gatunku
mikroorganizmu przy zachowaniu kontrolowanych warunków hodowli



zarówno ilościowy, jak i jakościowy skład ściany komórkowej bakterii kodowany jest przez
DNA genomowe i nie ma na niego wpływu informacja genetyczna zawarta w plazmidach

Kwasy tłuszczowe ściany komórkowej mogą być analizowane:



jakościowo – obecność specyficznych kwasów tłuszczowych



ilościowo – określenie zawartości poszczególnych kwasów tłuszczowych

25

Identyfikacja mikroorganizmów w oparciu
o chromatografię gazową

Sposób postępowania:



Komórki czystej kultury identyfikowanych bakterii poddaje się saponifikacji (hydroliza

triglicerydów) i uwolnieniu kwasów tłuszczowych



Następnie prowadzi się metylowanie kwasów oraz ich ekstrakcję z fazy wodnej w celu

zwiększenia lotności, po czym przeprowadza rozdział metodą chromatografii gazowej



Wyniki są analizowane przez komputer i porównywane z bazą profili chromatograficznych

charakterystycznych dla poszczególnych gatunków drobnoustrojów

Metoda pozwalająca określić

przynależność gatunkową mikroorganizmu

26

Wykład 4

14

Identyfikacja mikroorganizmów w oparciu o
chromatografię gazową

Poszczególne piki są identyfikowane w oparciu o wzorce kwasów tłuszczowych.

27

Identyfikacja mikroorganizmów w oparciu o
FTIR



Spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR)



Uzyskuje się widma w podczerwieni komórek poddanych
dezintegracji, które są odzwierciedleniem ich składu chemicznego –
obraz zależny od:



rodzaju białek,



kwasów nukleinowych,



elementów błony plazmatycznej i ściany komórkowej



Unikatowy rozkład widma dla gatunku jest porównywany z bazą
szczepów wzorcowych o znanej przynależności systematycznej.

28

Wykład 4

15

III. Metody biologii molekularnej



Oparte na analizie kwasów nukleinowych



ilościowej (% molowy GC)



jakościowej (homologia)



Kariotypowanie elektroforetyczne



Analiza polimorfizmu miejsc restrykcyjnych RFLP



Techniki wykorzystujące łańcuchową reakcję polimerazy PCR



Analiza polimorfizmu fragmentów zamplifikowanych AFLP



Metody analizy porównawczej rRNA (16S i 18S)



Sekwencjonowanie fragmentów lub całych genomów

29

DNA – cel molekularny

Jako standardowy cel molekularny wykorzystywany w metodach biologii molekularnej,
które służą identyfikacji rodzajowej mikroorganizmów, wykorzystuje się geny
należące do tzw. rDNA:



16S rDNA

dla organizmów prokariotycznych



18S rDNA

dla organizmów eukariotycznych



Molekularna miara stopnia pokrewieństwa

– sekwencja DNA wspólnych

genów – genów kodujących rybosomalny RNA

(Carl Woese)

30

Wykład 4

16

Molekularna miara stopnia pokrewieństwa

Porównanie sekwencji genów rRNA z różnych organizmów

Organizm I ACTGCATTA

C

GCCTTAAGAGGCTCT

Organizm II ACTGCATTA

G

GCCTTAAGAGGCTCT

Organizm III ACTGCAT

A

A

T

GC

ACA

A

T

GAGGCTCT

Sekwencja

zmienna

Sekwencja

zakonserwowana

Sekwencja

zakonserwowana

Organizm I

Organizm II

Organizm III

31

Metody biologii molekularnej

Metody identyfikacji oparte na badaniu homologii fragmentów

kwasów nukleinowych

Ponieważ sekwencja nukleotydów w łańcuchu kwasu nukleinowego jest

specyficzna, charakterystyczna dla danego gatunku organizmu, określenie
stopnia podobieństwa fragmentu DNA lub RNA badanego mikroorganizmu, w
odniesieniu do wzorca wiadomego pochodzenia, umożliwia jego identyfikację
taksonomiczną



Metody hybrydyzacyjne



Metody oparte o technikę PCR i jej modyfikacje

32

Wykład 4

17

Metody hybrydyzacyjne

Polegają na zastosowaniu tzw. sond genetycznych



sondy są to krótkie jednoniciowe fragmenty DNA, zawierające sekwencje unikalne
dla danego organizmu



kwas nukleinowy pełniący rolę sondy genetycznej jest znakowany



radioaktywnym fosforem [32P] lub wodorem [3H]



barwnikiem fluorescencyjnym



Enzymem (peroksydaza)



Pozwala to na określenie stopnia hybrydyzacji sondy z badanym DNA lub RNA

33

Metody hybrydyzacyjne



Najpopularniejsze systemy detekcji wykorzystują sondy DNA komplementarne do
charakterystycznych dla identyfikowanego mikroorganizmu sekwencji rybosomalnego
RNA (rRNA)



Wykorzystanie rRNA zwiększa czułość oznaczenia, gdyż występuje on w komórce
bakteryjnej w dużej liczbie kopii (od 1 000 do 10 000)



Inną zaletą tego rozwiązania jest dostępność informacji odnośnie sekwencji rRNA
pochodzących od różnych, często bardzo blisko genetycznie spokrewnionych
mikroorganizmów, dzięki czemu możliwe jest otrzymywanie sond o bardzo wysokiej
specyficzności

34

Wykład 4

18

Metody hybrydyzacyjne

Dot blot

35

Metody hybrydyzacyjne

Southern blotting

36

Wykład 4

19

Metody hybrydyzacyjne



homologia kwasów nukleinowych powyżej 70% świadczy o przynależności

organizmu do określonego gatunku



stopień hybrydyzacji powyżej 20% wskazuje na zgodność identyfikowanego

drobnoustroju z danym rodzajem



hybrydyzacja od 1 do 5% może zachodzić między DNA lub RNA organizmów

niespokrewnionych

37

FISH – hybrydyzacja fluorescencyjna in situ

Umożliwia identyfikację mikroorganizmów widzianych pod mikroskopem

38

Wykład 4

20

FISH – hybrydyzacja fluorescencyjna in situ

Wynik FISH dla

mieszaniny wybranych

bakterii z rodzaju

Bacillus, Escherichia,

Pseudomanas, Shigella

Wyznaczone bakterie (

żółte/pomarańczowe

) i

mikroorganizmy nie będące bakteriami (

zielone

)

pobrane z powierzchni glonów Ulva sp.

Wynik FISH dla mikroorganizmów z

domen Archaea (

czerwone

) i

Bacteria (

zielone

)

39

Metody wykorzystujące technikę PCR

Technika PCR (Polymerase Chain Reaction) - enzymatyczna amplifikacja

(zwielokrotnienie) in vitro specyficznej sekwencji nukleotydów

Sposób postępowania:



amplifikacja fragmentu DNA



sekwencjonowanie



porównanie wyników z danymi zamieszczonymi w banku genów



5% różnica w sekwencji wystarczy dla wyodrębnienia gatunku



Specyficzne fragmenty uzyskane w wyniku reakcji PCR mogą być również

wykorzystane w metodzie hybrydyzacji.

40

Wykład 4

21

Metody wykorzystujące technikę PCR

badanie mieszanej populacji mikroorganizmów

41

P
C
R

Sekwencjonowanie

DNA

Izolacja DNA

agctgatcgtagtctgt
aggctggtgtaccctg
atgcttgtatgttaaaag
ctagatgctgagtgagt
cgtagtggatcgatgct
gagtcgtaggctggct

Analiza

Sekwencji

42

Wykład 4

22

sekwencjonowanie



Nowe metody sekwencjonowania typu Next-Generation Sequencing (NGS)

umożliwiają odczyt do kilku mld pz



Rozwój metod bioinformatycznych umożliwia coraz szybszą i efektywniejszą analizę

takiej ilości danych, dzięki czemu możliwe jest porównywanie coraz większej ilości

fragmentów DNA, a nawet całych genomów badanych mikroorganizmów

43

Analiza sekwencji

44

Wykład 4

23

Metody wykorzystujące technikę PCR



Geny kodujące białka bakteryjne



białko szoku termicznego Hsp 70



białko szoku termicznego Hsp 60



syntaza asparaginylo-tRNA



syntaza alanylo-tRNA



dehydrogenaza glutaminianowa



hydrolaza pirofosforanu



podjednostka

β polimerazy RNA (RpoB)



podjednostka

β’ polimerazy RNA (RpoC)



czynniki elongacyjne: EF 1

α

/Tu, EF-Tu, Ef-G/2



białka rybosomowe: L2, L5, L11, L14, L15, L22, L23, S5, S12



gyrazy

45

IV. Metody immunochemiczne



Stosowane do szybkiego wykrywania mikroorganizmów patogennych w

-

Medycynie

-

Przemyśle spożywczym (Sanepid) i farmaceutycznym

Oparte są na specyficznej reakcji zachodzącej pomiędzy przeciwciałem i

antygenem

46

Wykład 4

24

Metody immunochemiczne



Antygenem mogą być:



Komórki mikroorganizmów lub ich elementy – antygen cząstkowy



Specyficzne metabolity mikroorganizmów, np. toksyny



Przeciwciała:



Białka z grupy immunoglobulin biorące udział w reakcjach odpornościowych

wyższych organizmów eukariotycznych

47

Przeciwciało

Schemat przeciwciała:
1. fragment

wiążący antygen

2. region Fab
3. region Fc
niebieskie

– łańcuchy ciężkie

żółte – łańcuchy lekkie

ciemnoniebieskie

/

ciemnożółte

– regiony zmienne

jasnoniebieskie

/

jasnożółte

– regiony stałe

szare

–

mostki disiarczkowe

48

Wykład 4

25

Metody immunochemiczne

W identyfikacji mikroorganizmów najczęściej stosuje się:



Testy aglutynacji



Metody radioimmunologiczne (RIA)



Metody immunoenzymatyczne (EIA)



Metody immunofluorescencyjne (FIA)

49

Test aglutynacji

Umożliwia identyfikację gatunków bakterii i grzybów strzępkowych na podstawie analizy antygenów

ścian komórkowych, komórek lub specyficznych toksyn wytwarzanych przez komórki.

W celu wzmocnienia efektu stosowane są

cząsteczki lateksu, które opłaszczane są

przeciwciałem. W obecności specyficznego

antygenu zachodzi reakcja immunologiczna

wynikiem czego jest aglutynacja (zlepianie

się)

cząstek

lateksu

opłaszczonych

przeciwciałem.

50

Wykład 4

26

Metody immunochemiczne



Reakcja immunologiczna wykrywana jest poprzez specyficzne

znakowanie samego przeciwciała:



fluorochromami (np. fluoresceiną, rodaminą, fikoerytryną, fikocyjaniną),



radioizotopem



enzymem (peroksydaza chrzanowa, fosfataza alkaliczna, β-galaktozydaza)

51

Metody immunochemiczne



Znakowanie przeciwciała enzymem umożliwia wykrycie reakcji immunologicznej po

dodaniu kompleksu chromogenu z substratem enzymu.



Zmiana barwy środowiska na skutek utworzenia barwnego produktu pozwala na

detekcję nawet bardzo małych ilości antygenu.

52

Wykład 4

27

Metody immunofluorescencyjne - FACS



Komórki

znakowane

markerem

fluorescencyjnym



Rozdział

przy

użyciu

cytometru

przepływowego (fluorescence-activated cell

sorter)

–

aktywacja

fluorescencji

przeciwciała przy użyciu lasera



Sortowanie w polu elektrycznym komórek z

różnym znacznikiem



Istotny

jest

dobór

odpowiedniego

przeciwciała

53

Metody immunoenzymatyczne - ELISA



ang. Enzyme Linked Immunosorbent Assay



Wyróżnia się 3 odmiany:



Bezpośrednia współzawodnicząca



Pośrednia współzawodnicząca



Kanapkowa

54

Wykład 4

28

Metody immunoenzymatyczne - ELISA



Metoda współzawodnicząca:



Specyficzne przeciwciało wiązane jest ze stałą fazą (np. powierzchnia mikropłytki



Dodanie określonej ilości antygenu oznakowanego enzymem oraz próba badana
(antygen nieoznakowany - nie połączony z enzymem)



Współzawodnictwo (kompetycja) o miejsce wiązania pomiędzy antygenem
oznakowanym i nieoznakowanym

Ilość oznakowanego antygenu związanego z przeciwciałem jest odwrotnie proporcjonalna do

zawartości antygenu w próbie badanej

.

Odmiana bezpośrednia – stosowane są oczyszczone, oznakowane przeciwciała

specyficzne dla antygenu – wykrywany jest antygen

Odmiana pośrednia – nieoznakowane przeciwciało specyficzne dla antygenu, a następnie

użycie wtórnego przeciwciała, połączonego z enzymem

55

Metody immunoenzymatyczne - ELISA



Metoda kanapkowa:



Antygen z badanej próby jest unieruchomiony pomiędzy dwoma warstwami przeciwciał



Przeciwciało specyficzne dla antygenu związane jest z fazą stałą



Jeżeli w badanej próbie jest antygen – wiąże się on z przeciwciałem i zostaje
unieruchomiony na nośniku. Niezwiązane antygeny są wymywane.



Druga porcja specyficznych przeciwciał jest wyznakowana enzymatycznie.



Barwny kompleks powstaje w wyniku reakcji immunoenzymatycznej

56

Wykład 4

29

Metody immunoenzymatyczne - ELISA

57

Metody immunochromatograficzne

Test kanapkowy ELISA

Zabarwione cząstki lateksu opłaszczone przeciwciałem po wprowadzeniu antygenu z badanym
materiałem migrują wzdłuż membrany.

Kompleks antygen-przeciwciał jest unieruchamiany na pewnej wysokości wskutek reakcji
antygenu z unieruchomionym przeciwciałem monoklonalnym tworząc barwny pasek.

Niezwiązany barwny lateks połączony z przeciwciałami migruje dalej, napotykając na linię
utworzoną z IgG i tworzy pasek kontrolny.

58