laboratorium medyczne | temat numeru

LIFE SCIENCE

Laboratorium |

7-8

/2008

44

Streszczenie
Enzymy są biokatalizatorami wytwarzanymi przez żywe organizmy.
Prawie wszystkie enzymy są białkami. Przyspieszają one szybkość
reakcji zachodzących w organizmie poprzez obniżanie energii
aktywacji. Nie zmieniają stanu równowagi reakcji chemicznej: nie
wpływają na wartość stałej równowagi, lecz jedynie na szybkość
przemian. Niektóre reakcje enzymatyczne przebiegają w sposób
bardzo skomplikowany, inne są bardzo proste. Wiele z nich zachodzi
z bardzo dużą szybkością.
Specyficzność enzymów jest zawsze bardzo wysoka w porównaniu
ze specyficznością katalizatorów chemicznych, ale stopień specyficz-
ności poszczególnych enzymów może być bardzo różny. Aktywność
niektórych enzymów występujących w organizmie podlega regulacji,
która może odbywać się na wiele różnych sposobów. Jednym z nich
jest zmiana ilości białka enzymatycznego, spowodowana zmianami
szybkości jego syntezy lub degradacji. Szybkość reakcji enzymatycz-
nych zależy ponadto od wielu innych czynników: stężenia substratów
i produktów, obecności aktywatorów lub inhibitorów, temperatury
oraz pH środowiska.

Słowa kluczowe
enzymy, regulacja aktywności enzymatycznej

Key words
enzymes, enzymes activity regulation

Summary
Enzymes are biomolecules that catalyze (i.e. increase the rates of)
chemical reactions. Almost all enzymes are proteins. In enzymatic
reactions, the molecules at the beginning of the process are called
substrates, and the enzyme converts them into different molecules,
the products. Almost all processes in a biological cell need enzymes
in order to occur at significant rates. Since enzymes are extremely
selective for their substrates and speed up only a few reactions
from among many possibilities, the set of enzymes made in a cell
determines which metabolic pathways occur in that given cell.
Like all catalysts, enzymes work by lowering the activation energy
for a reaction, thus dramatically increasing the rate of the reaction.
Most enzyme reaction rates are millions of times faster than those
of comparable uncatalyzed reactions. As with all catalysts, enzymes
are not consumed by the reactions they catalyze, nor do they alter
the equilibrium of these reactions. However, enzymes do differ from
most other catalysts by being much more specific.
Enzyme activity can be affected by other molecules. Inhibitors are
molecules which decrease enzyme activity; activators, on the other
hand, are molecules which increase activity. Many drugs and poisons
are enzyme inhibitors. Activity is also affected by temperature, chemi-
cal environment (e.g. pH), and the concentration of the substrate.

Rola oznaczeń enzymatycznych

w medycynie laboratoryjnej – cz. I

Enzymy są biokatalizatorami wytwarzanymi przez żywe organizmy.
Poprzez obniżanie energii aktywacji przyspieszają one szybkość reakcji
zachodzących w organizmie. Nie zmieniają stanu równowagi reakcji
chemicznej: nie wpływają na wartość stałej równowagi, lecz jedynie na
szybkość przemian. Niektóre reakcje enzymatyczne przebiegają w sposób
bardzo skomplikowany, inne są bardzo proste. Wiele z nich zachodzi
z bardzo dużą szybkością. Przykładem jest reakcja katalizowana przez
anhydrazę węglanową uczestniczącą w procesie przenoszenia dwutlenku
węgla przez krew. Blisko połowa dwutlenku węgla wytwarzanego w tkan-
kach jest transportowana w osoczu w formie kwasu węglowego, a ściślej
– jonu wodorowęglanowego HCO

3

-

, powstającego w wyniku dysocjacji

H

2

CO

3

(pozostała część dwutlenku węgla jest przenoszona przez he-

moglobinę). Szybkość powstawania kwasu węglowego w reakcji CO

2

z wodą jest zbyt mała, by sprostać wymaganiom organizmu. Anhydraza
węglanowa zwiększa szybkość tego procesu o 10 milionów razy.

Enzymy produkowane są w komórkach, ale aktywność niektórych

z nich może być obserwowana również w płynach ustrojowych na skutek
przechodzenia enzymów przez błony komórkowe lub w wyniku rozpadu
komórek. Prawie wszystkie enzymy są białkami, chociaż zidentyfikowano
też kilka rodzajów cząsteczek RNA aktywnych katalitycznie.

Funkcjonowanie komórki jest związane z przebiegiem wielu reakcji

chemicznych, jednak liczne oddziaływania organizmu ze środowiskiem

polegają na wymianie energii w postaci innej niż energia procesów
chemicznych. Enzymy oraz białka o właściwościach zbliżonych do
enzymów mogą przekształcać energię chemiczną w odmienne formy
energii i odwrotnie. Jednym z przykładów jest przekształcanie energii
uwalnianej podczas reakcji chemicznej w ciepło wykorzystywane do
utrzymywania właściwej temperatury ciała. Inne procesy enzymatyczne
powodują obniżenie temperatury organizmu przez tworzenie i wydzie-
lanie potu. Ruch ciała odbywa się dzięki skurczom mięśni, podczas
których następuje przekształcenie energii chemicznej, zmagazynowanej
w postaci ATP, w pracę mechaniczną. Energia światła słonecznego jest
wykorzystywana przez rodopsynę do wytwarzania sygnałów chemicz-
nych w oku. Jony i substancje drobnocząsteczkowe są transportowane
wbrew gradientowi stężeń przez błony komórkowe. Informacja jest ma-
gazynowana w formie chemicznej w chromosomach oraz w mózgu.
Procesy enzymatyczne leżą także u podstaw przekazywania impulsów
nerwowych.

Każdy enzym posiada tzw. miejsce aktywne, które jest regionem

enzymu wiążącym substrat. Tworzy ono kompleks enzym-substrat
i przekształca go w produkt. O specyficzności substratowej enzymu
decydują właściwości i przestrzenne ułożenie reszt aminokwasów two-
rzących miejsca aktywne. Specyficzność enzymów jest zawsze bardzo
wysoka w porównaniu ze specyficznością katalizatorów chemicznych,

dr n. med. Brygida Beck

Dział Diagnostyki Laboratoryjnej
Regionalne Centrum Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa w Opolu

mgr Aleksandra Malarska

Dział Zapewnienia Jakości

45

laboratorium medyczne | temat numeru

LIFE SCIENCE

Laboratorium |

7-8

/2008

45

ale stopień specyficzności poszczególnych enzymów może być bar-
dzo różny.

Podział enzymów

Zgodnie z zaleceniami Międzynarodowej Unii Biochemicznej enzymy
dzielimy na sześć głównych klas:
1. oksydoreduktazy – katalizujące reakcje oksydoredukcyjne,
2. transferazy – katalizujące przenoszenie określonych grup pomiędzy

poszczególnymi związkami,

3. hydrolazy – katalizujące rozkład różnych wiązań z udziałem cząste-

czek wody,

4. liazy – katalizujące odłączenie grup od substratu bez udziału czą-

steczek wody,

5. izomerazy – katalizujące reakcje izomeryzacji,
6. ligazy (syntetazy) – katalizujące wytwarzanie wiązań pomiędzy ato-

mami w cząsteczkach substratów.
Ze względu na budowę enzymy dzielimy na proste i złożone. Enzy-

my proste są zbudowane jedynie z aminokwasów (np. amylaza, ureaza,
aldolaza, enzymy proteolityczne). Natomiast enzymy złożone są zbudo-
wane z komponentu białkowego i niebiałkowego, którym może być:
− grupa prostetyczna (np. porfiryny w oksydazie cytochromowej,

katalazie, peroksydazie),

− koenzym (np. NAD w dehydrogenazie mleczanowej).

Kolejną klasyfikacją jest podział diagnostyczny, który obejmuje

trzy grupy enzymów:
1. sekrecyjne (wydzielnicze) – są wydzielane do krwi z komórek, będąc

potwierdzeniem prawidłowo zachodzących procesów anabolicznych.
Procesy doprowadzające do uszkodzenia komórek przyczyniają się
do spadku aktywności tych enzymów w osoczu (np. esteraza choli-
nowa, czynniki krzepnięcia, lipaza lipoproteinowa, ceruloplazmina,
acylotransferaza lecytynowo-cholesterolowa).

2. indykatorowe (wskaźnikowe) – w warunkach fizjologicznych cha-

rakteryzują się niewielką aktywnością w osoczu, będąc przejawem
ciągłego obumierania komórek. Wzrost ich aktywności jest pro-
porcjonalny do stopnia uszkodzenia narządów. Badając aktywność
enzymów narządowo specyficznych, można zlokalizować toczący
się proces chorobowy. Na zakres uszkodzenia narządu wskazuje
również aktywność izoenzymów pochodzących z różnych organelli
komórkowych. Izoenzymy cytoplazmatyczne pojawiają się już przy
niewielkich uszkodzeniach komórek, natomiast obecność izoenzy-
mów związanych z wewnętrznymi strukturami komórki świadczy
o ich poważnym uszkodzeniu. Dzielimy je na:

– narządowo specyficzne – np. w wątrobie: dehydrogenaza etano-

lowa, dehydrogenaza sorbitolowa, dehydrogenaza mleczanowa
(izoenzym – 5), acylaza aktywowana kobaltem, karbamoilotrans-
feraza ornitynowa, w mięśniach: kinaza kreatynowa,

– narządowo niespecyficzne – enzymy cyklu pentozowego, enzymy

glikolizy, enzymy cyklu Krebsa, enzymy przemiany białkowej.

3. ekskrecyjne (wydalnicze) – wydzielane są z wydalinami ustrojowymi.

Wydzielające je komórki przekazują ich niewielką ilość również do krwi.
W przypadku utrudnionego odpływu wydzielin (np. zaczopowanie
przewodów wydzielniczych kamieniem lub guzem nowotworowym)
obserwuje się wzrost ich aktywności we krwi (np. w żółci: fosfataza
zasadowa, gammaglutamylotranspeptydaza, leucyloaminopeptyda-
za; w soku trzustkowym: amylaza, lipaza, trypsyna, chymotrypsyna,
DNA-aza, RNA-aza; w śliniankach: amylaza; w płynie sterczowym:
fosfataza kwaśna; w gruczołach wydzielniczych żołądka: pepsyna).
Enzymy można również podzielić ze względu na ich rozmieszcze-

nie w komórce. Są to enzymy: błony komórkowej, cytoplazmatyczne,

mitochondrialne, mikrosomalne, jądra komórkowego, lizosomalne,
połączone z innymi organellami.

W warunkach fizjologicznych skład enzymów i ich aktywność

w poszczególnych organellach komórkowych ulegają tylko nieznacz-
nym zmianom. W warunkach patologicznych może dochodzić do
zachwiania składu lub całkowitego zaniku enzymu w komórce. Stany
takie nazywamy enzymopatiami.

Oznaczanie aktywności enzymów będących znacznikami po-

szczególnych przedziałów komórkowych ma znaczenie nie tylko
diagnostyczne (enzymy wskaźnikowe, enzymopatie), lecz jest rów-
nież przydatne w ocenie stopnia czystości uzyskanych frakcji ko-
mórkowych.

Izoenzymy

Izoenzymy katalizują te same reakcje w ustroju, ale występują w róż-
nych formach molekularnych. Izoenzymy różnią się między sobą
właściwościami zarówno fizycznymi (szybkością wędrowania w polu
elektrycznym, różną wrażliwością na temperaturę), chemicznymi (po-
winowactwem do substratów, koenzymów i innych kofaktorów), jak
i immunologicznymi.

Różnice dotyczą również ich lokalizacji wewnątrzkomórkowej oraz

narządowej. Wszystkie te odmienności mogą być wykorzystywane do
rozdziału izoenzymów.

Badania oparte na zjawisku heterogenności molekularnej enzymów

zyskały duże znaczenie w diagnostyce enzymologicznej. W biochemii
klinicznej najczęściej oznacza się izoenzymy kinazy kreatynowej, fos-
fatazy kwaśnej i zasadowej, dehydrogenazy mleczanowej, aminotrans-
ferazy oraz amylazy.

laboratorium medyczne | temat numeru

LIFE SCIENCE

Laboratorium |

7-8

/2008

46

Kinetyka reakcji enzymatycznych

Aby zaszła reakcja, musi zostać pokonana bariera energetyczna związana
z przekształceniem cząsteczki substratu w stan przejściowy. Stan przej-
ściowy ma w przebiegu reakcji największą energię swobodną. Różnica
energii swobodnej między substratem a stanem przejściowym nazywa
się energią aktywacji. Enzym stabilizuje stan przejściowy i zmniejsza
wartość energii aktywacji, zwiększając przez to szybkość przebiegu
reakcji. Kinetyka reakcji enzymatycznych – ich szybkość i przebieg
– jest niezwykle istotna dla organizmu, który zachowuje homeostazę,
dostosowując szybkość reakcji enzymatycznych do warunków środo-
wiskowych lub bodźców hormonalnych.

Enzymy, tworząc przejściowe połączenia z substratem i zmniejszając

energię aktywacji, obniżają barierę energetyczną pomiędzy reagującymi
cząsteczkami. Kompleks enzym-substrat ulega następnie rozpadowi na
produkt reakcji i wolny enzym:

E + S

E-S

E + P

gdzie: E – enzym, S – substrat, E-S – kompleks enzym-substrat, P – pro-
dukt.

Czynniki wpływające na szybkość

reakcji enzymatycznych

Aktywność niektórych enzymów występujących w organizmie podlega
regulacji, która może odbywać się na wiele różnych sposobów. Jed-
nym z nich jest zmiana ilości białka enzymatycznego, spowodowana
zmianami szybkości jego syntezy lub degradacji. Szybkość reakcji en-
zymatycznych zależy ponadto od wielu innych czynników:
– stężenia substratów,
– stężenia produktów,
– aktywacji lub hamowania allosterycznego,
– temperatury,
– pH środowiska,
– siły jonowej,
– obecności aktywatorów,
– obecności inhibitorów.

Stężenie substratu – przy stałym poziomie enzymu szybkość

reakcji enzymatycznej wzrasta początkowo wraz ze wzrostem stęże-
nia substratu, jednak w momencie całkowitego wysycenia enzymu
substratem reakcja osiąga tzw. szybkość maksymalną (V

max

). Dalsze

zwiększanie stężenia substratu nie przyczynia się już do przyspiesze-
nia szybkości reakcji (może nawet, wręcz przeciwnie, doprowadzić do
obniżenia szybkości reakcji).

Niektóre reakcje enzymatyczne osiągają V

max

już przy niewielkich

stężeniach substratu, co świadczy o dużym powinowactwie enzymu do

substratu. Można je wyrazić za pomocą stałej Michaelisa (K

m

), okre-

ślającej stężenie substratu, przy której szybkość reakcji enzymatycznej
jest równa połowie szybkości maksymalnej. K

m

wyraża się w molach

substratu na litr. Dla większości enzymów wartość ta zawarta jest w gra-
nicach 10

-2

-10

-5

mol/l. Enzym charakteryzuje się więc tym większym

powinowactwem do substratu, im mniejsza jest stała Michaelisa.

Równaniem opisującym zależność szybkości reakcji enzymatycznej

od stężenia substratu jest równanie Michaelisa-Mentena:

V =

V

max

K

m

1 +

[s]

Z graficznego przedstawienia tego równania można wyznaczyć

wartość stałej Michaelisa (rys. 1).

Znacznie dogodniejszym sposobem wyznaczania wartości tej stałej

jest wykorzystanie tzw. równania Lineweavera-Burka, będącego prze-
kształceniem równania Michaelisa-Mentena (odwrotnością):

=

1

V

V

max

1

+

V

max

K

m

×

1

[s]

Graficznie przyjmuje ono postać prostej (rys. 2).
Do oznaczeń aktywności enzymów stosuje się stężenie substratu

odpowiadające 10-krotnej wartości stałej Michaelisa.

Stężenie enzymu – związek między szybkością reakcji i stęże-

niem enzymu najwygodniej jest obserwować przy dużych stężeniach
substratu, bowiem szybkość reakcji zależy od stężenia enzymu tylko
w przypadku nadmiaru stężenia substratu w środowisku reakcji. Jest
ona wtedy proporcjonalna do stężenia enzymu (rys. 3).

Aktywacja/hamowanie allosteryczne – efekt allosteryczny ob-

serwujemy w momencie przyłączenia się do enzymu, w tzw. centrum
allosterycznym, odpowiedniego efektora, który powoduje zmiany
konformacji białka enzymatycznego. Prowadzi to w efekcie do zmia-
ny aktywności enzymu.

Temperatura – wzrostowi temperatury towarzyszy przyspieszenie

reakcji enzymatycznej. Jednak po osiągnięciu pewnego optimum w da-
nych warunkach reakcja ulega spowolnieniu w następstwie denaturacji
cieplnej enzymu. Większość enzymów traci nieodwracalnie aktywność
po przekroczeniu temperatury 65°C (rys. 4).
Podwyższenie temperatury o 10°C zwiększa szybkość reakcji 2-3-krotnie
(współczynnik Q

10

) do temperatury, w której następuje denaturacja

części białkowej badanego enzymu.

pH – stężenie jonów wodorowych jest czynnikiem silnie wpływają-

cym na szybkość reakcji enzymatycznej. Dla działania każdego enzy-
mu istnieje optymalne pH (np. dla pepsyny pH 1,0-2,2; dla fosfatazy

kwaśnej pH 4,5-5,0; dla amylazy pH 6,7-7,2; dla fosfatazy alkalicznej
pH 9,0-10,0). W zakresie optymalnego pH szybkość reakcji enzyma-
tycznej jest maksymalna, a spada w miarę oddalania się od niej. Zbyt
kwasowe lub zasadowe środowisko może powodować denaturację
białka enzymatycznego (rys. 5).

Zmiana warunków jonowych środowiska (składu jonowego i siły

jonowej) wpływa na aktywność wielu enzymów. Jest to istotne zwłaszcza
wtedy, gdy obecność określonego jonu (np. Mg

2+

w przypadku kinazy

czy arginazy) jest konieczna do przebiegu procesu katalitycznego.

Aktywatory – to różnego rodzaju substancje nie biorące udziału

w reakcji katalitycznej, które uczynniają enzymy lub zwiększają ich
aktywność. Można podzielić je na trzy grupy:
– jony niektórych metali,
– białka działające przez odmaskowanie grup czynnych enzymu,
– drobnocząsteczkowe połączenia organiczne usuwające wpływ związ-

ków hamujących.
Inhibitory są substancjami obniżającymi lub całkowicie znoszą-

cymi aktywność enzymatyczną. Wyróżniamy dwa typy inhibitorów
reakcji enzymatycznej:
– inhibitory kompetycyjne (współzawodniczące), które wykazują

analogie strukturalne do substratu i konkurują z nim o centrum
aktywne enzymu. Inhibitor kompetycyjny powoduje wzrost war-
tości K

m

, ale nie powoduje zmniejszenia maksymalnej szybkości

reakcji.

– Inhibitory niekompetycyjne (niewspółzawodniczące), które działają

poprzez modyfikacje białka enzymatycznego, np. przez przyłączanie
metali ciężkich do czynnych grup -SH cysteiny, fosforylację grup
-OH seryny. Inhibitor najczęściej wiąże się z enzymem w miejscu
innym niż centrum aktywne. Niektóre związki przyłączają się do
tzw. centrum allosterycznego enzymu (inhibicja allosteryczna).
Inhibitor niekompetycyjny nie wywiera wpływu na wielkość K

m

,

obniża natomiast maksymalną szybkość reakcji enzymatycznej.
Działanie inhibitorów może być odwracalne i nieodwracalne. Inhi-

bitory kompetycyjne można wypierać z centrum aktywnego enzymu
przez wprowadzenie nadmiaru substratu do środowiska reakcji.

Działanie metali ciężkich, blokujących grupy -SH, można znieść

przez dodanie do środowiska reakcji (albo podanie pacjentowi) związ-
ków zawierających grupy tiolowe, takie jak cysteina czy BAL (2,3-
-dimerkaptopropanol), których grupy -SH będą współzawodniczyły
z grupami -SH enzymu o inhibitor.

Można też podać związki o właściwościach chelatujących, mających

zdolność wiązania jonów dwuwartościowych. Podanie dożylne w bar-
dzo wysokich, subtoksycznych, dawkach alkoholu etylowego w czasie
zatrucia glikolem etylenowym prowadzi do hamowania utleniania gli-

Rys. 2. Graficzne wyznaczanie stałej Michaelisa me-
todą podwójnych odwrotności Lineweavera i Burka

V

max

V

max

/2

[S] = K

M

prędk

ość

V

stężenie substratu [S]

Nachylenie
= K

M

/V

max

1

V

1

[S]

–1
K

M

=

1

V

max

1

[S]

0

Rys. 3. Wpływ stężenia enzymu na szybkość
reakcji enzymatycznej: 1 – amoniakoliaza
asparaginianowa, 2 – hydrataza fumaranowa

Rys. 1. Graficzne przedstawienie stałej
Michaelisa

szybk

ość r

eak

cji,

V

[E]

1

2

0

0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12

47

laboratorium medyczne | temat numeru

LIFE SCIENCE

Laboratorium |

7-8

/2008

47

Kinetyka reakcji enzymatycznych

Aby zaszła reakcja, musi zostać pokonana bariera energetyczna związana
z przekształceniem cząsteczki substratu w stan przejściowy. Stan przej-
ściowy ma w przebiegu reakcji największą energię swobodną. Różnica
energii swobodnej między substratem a stanem przejściowym nazywa
się energią aktywacji. Enzym stabilizuje stan przejściowy i zmniejsza
wartość energii aktywacji, zwiększając przez to szybkość przebiegu
reakcji. Kinetyka reakcji enzymatycznych – ich szybkość i przebieg
– jest niezwykle istotna dla organizmu, który zachowuje homeostazę,
dostosowując szybkość reakcji enzymatycznych do warunków środo-
wiskowych lub bodźców hormonalnych.

Enzymy, tworząc przejściowe połączenia z substratem i zmniejszając

energię aktywacji, obniżają barierę energetyczną pomiędzy reagującymi
cząsteczkami. Kompleks enzym-substrat ulega następnie rozpadowi na
produkt reakcji i wolny enzym:

E + S

E-S

E + P

gdzie: E – enzym, S – substrat, E-S – kompleks enzym-substrat, P – pro-
dukt.

Czynniki wpływające na szybkość

reakcji enzymatycznych

Aktywność niektórych enzymów występujących w organizmie podlega
regulacji, która może odbywać się na wiele różnych sposobów. Jed-
nym z nich jest zmiana ilości białka enzymatycznego, spowodowana
zmianami szybkości jego syntezy lub degradacji. Szybkość reakcji en-
zymatycznych zależy ponadto od wielu innych czynników:
– stężenia substratów,
– stężenia produktów,
– aktywacji lub hamowania allosterycznego,
– temperatury,
– pH środowiska,
– siły jonowej,
– obecności aktywatorów,
– obecności inhibitorów.

Stężenie substratu – przy stałym poziomie enzymu szybkość

reakcji enzymatycznej wzrasta początkowo wraz ze wzrostem stęże-
nia substratu, jednak w momencie całkowitego wysycenia enzymu
substratem reakcja osiąga tzw. szybkość maksymalną (V

max

). Dalsze

zwiększanie stężenia substratu nie przyczynia się już do przyspiesze-
nia szybkości reakcji (może nawet, wręcz przeciwnie, doprowadzić do
obniżenia szybkości reakcji).

Niektóre reakcje enzymatyczne osiągają V

max

już przy niewielkich

stężeniach substratu, co świadczy o dużym powinowactwie enzymu do

substratu. Można je wyrazić za pomocą stałej Michaelisa (K

m

), okre-

ślającej stężenie substratu, przy której szybkość reakcji enzymatycznej
jest równa połowie szybkości maksymalnej. K

m

wyraża się w molach

substratu na litr. Dla większości enzymów wartość ta zawarta jest w gra-
nicach 10

-2

-10

-5

mol/l. Enzym charakteryzuje się więc tym większym

powinowactwem do substratu, im mniejsza jest stała Michaelisa.

Równaniem opisującym zależność szybkości reakcji enzymatycznej

od stężenia substratu jest równanie Michaelisa-Mentena:

V =

V

max

K

m

1 +

[s]

Z graficznego przedstawienia tego równania można wyznaczyć

wartość stałej Michaelisa (rys. 1).

Znacznie dogodniejszym sposobem wyznaczania wartości tej stałej

jest wykorzystanie tzw. równania Lineweavera-Burka, będącego prze-
kształceniem równania Michaelisa-Mentena (odwrotnością):

=

1

V

V

max

1

+

V

max

K

m

×

1

[s]

Graficznie przyjmuje ono postać prostej (rys. 2).
Do oznaczeń aktywności enzymów stosuje się stężenie substratu

odpowiadające 10-krotnej wartości stałej Michaelisa.

Stężenie enzymu – związek między szybkością reakcji i stęże-

niem enzymu najwygodniej jest obserwować przy dużych stężeniach
substratu, bowiem szybkość reakcji zależy od stężenia enzymu tylko
w przypadku nadmiaru stężenia substratu w środowisku reakcji. Jest
ona wtedy proporcjonalna do stężenia enzymu (rys. 3).

Aktywacja/hamowanie allosteryczne – efekt allosteryczny ob-

serwujemy w momencie przyłączenia się do enzymu, w tzw. centrum
allosterycznym, odpowiedniego efektora, który powoduje zmiany
konformacji białka enzymatycznego. Prowadzi to w efekcie do zmia-
ny aktywności enzymu.

Temperatura – wzrostowi temperatury towarzyszy przyspieszenie

reakcji enzymatycznej. Jednak po osiągnięciu pewnego optimum w da-
nych warunkach reakcja ulega spowolnieniu w następstwie denaturacji
cieplnej enzymu. Większość enzymów traci nieodwracalnie aktywność
po przekroczeniu temperatury 65°C (rys. 4).
Podwyższenie temperatury o 10°C zwiększa szybkość reakcji 2-3-krotnie
(współczynnik Q

10

) do temperatury, w której następuje denaturacja

części białkowej badanego enzymu.

pH – stężenie jonów wodorowych jest czynnikiem silnie wpływają-

cym na szybkość reakcji enzymatycznej. Dla działania każdego enzy-
mu istnieje optymalne pH (np. dla pepsyny pH 1,0-2,2; dla fosfatazy

kwaśnej pH 4,5-5,0; dla amylazy pH 6,7-7,2; dla fosfatazy alkalicznej
pH 9,0-10,0). W zakresie optymalnego pH szybkość reakcji enzyma-
tycznej jest maksymalna, a spada w miarę oddalania się od niej. Zbyt
kwasowe lub zasadowe środowisko może powodować denaturację
białka enzymatycznego (rys. 5).

Zmiana warunków jonowych środowiska (składu jonowego i siły

jonowej) wpływa na aktywność wielu enzymów. Jest to istotne zwłaszcza
wtedy, gdy obecność określonego jonu (np. Mg

2+

w przypadku kinazy

czy arginazy) jest konieczna do przebiegu procesu katalitycznego.

Aktywatory – to różnego rodzaju substancje nie biorące udziału

w reakcji katalitycznej, które uczynniają enzymy lub zwiększają ich
aktywność. Można podzielić je na trzy grupy:
– jony niektórych metali,
– białka działające przez odmaskowanie grup czynnych enzymu,
– drobnocząsteczkowe połączenia organiczne usuwające wpływ związ-

ków hamujących.
Inhibitory są substancjami obniżającymi lub całkowicie znoszą-

cymi aktywność enzymatyczną. Wyróżniamy dwa typy inhibitorów
reakcji enzymatycznej:
– inhibitory kompetycyjne (współzawodniczące), które wykazują

analogie strukturalne do substratu i konkurują z nim o centrum
aktywne enzymu. Inhibitor kompetycyjny powoduje wzrost war-
tości K

m

, ale nie powoduje zmniejszenia maksymalnej szybkości

reakcji.

– Inhibitory niekompetycyjne (niewspółzawodniczące), które działają

poprzez modyfikacje białka enzymatycznego, np. przez przyłączanie
metali ciężkich do czynnych grup -SH cysteiny, fosforylację grup
-OH seryny. Inhibitor najczęściej wiąże się z enzymem w miejscu
innym niż centrum aktywne. Niektóre związki przyłączają się do
tzw. centrum allosterycznego enzymu (inhibicja allosteryczna).
Inhibitor niekompetycyjny nie wywiera wpływu na wielkość K

m

,

obniża natomiast maksymalną szybkość reakcji enzymatycznej.
Działanie inhibitorów może być odwracalne i nieodwracalne. Inhi-

bitory kompetycyjne można wypierać z centrum aktywnego enzymu
przez wprowadzenie nadmiaru substratu do środowiska reakcji.

Działanie metali ciężkich, blokujących grupy -SH, można znieść

przez dodanie do środowiska reakcji (albo podanie pacjentowi) związ-
ków zawierających grupy tiolowe, takie jak cysteina czy BAL (2,3-
-dimerkaptopropanol), których grupy -SH będą współzawodniczyły
z grupami -SH enzymu o inhibitor.

Można też podać związki o właściwościach chelatujących, mających

zdolność wiązania jonów dwuwartościowych. Podanie dożylne w bar-
dzo wysokich, subtoksycznych, dawkach alkoholu etylowego w czasie
zatrucia glikolem etylenowym prowadzi do hamowania utleniania gli-

kolu etylenowego (związku nietrującego) do silnie toksycznego kwasu
szczawiowego. Alkohol etylowy jest w tym przypadku inhibitorem
kompetycyjnym dehydrogenazy alkoholowej. Podobną terapię stosuje
się w przypadkach zatrucia alkoholem metylowym.

Aktywność enzymatyczna

Przeprowadzając badania enzymatyczne, nie określamy stężenia en-
zymu, ale podajemy jego aktywność za pomocą tzw. jednostek ak-
tywności enzymu.

Katal – jest jednostką aktywności w układzie SI. Jest to ilość en-

zymu, która przekształca 1 mol substratu w ciągu 1 sekundy w temp.
30

o

C, w pH optymalnym dla działania danego enzymu i przy cał-

kowitym wysyceniu enzymu substratem (1 katal = 6 × 10

7

jednostek

międzynarodowych, 1 IU = 16,67 nanokatali).

Międzynarodowa jednostka aktywności enzymu IU – okre-

śla taką ilość enzymu, która przekształca 1 µmol substratu w ciągu
1 min w temperaturze 30

o

C, w optymalnym pH i przy całkowitym

wysyceniu enzymu substratem.

Aktywność molekularna, czyli liczba obrotów – jest to liczba

cząsteczek substratu przekształconych w ciągu 1 min przez jedną czą-
steczkę enzymu (lub jedno miejsce aktywne), przy pełnym wysyceniu
enzymu przez substrat.

Aktywność właściwa – liczba jednostek enzymatycznych przy-

padających na 1 mg białka (używana np. w przypadku oznaczania
aktywności enzymów w homogenatach tkankowych lub do określania
aktywności odczynników enzymatycznych).

Metody oznaczania aktywności enzymów

Metody punktu końcowego, zwane również metodami dwupunk-
towymi, polegają na pomiarze ilości powstałych produktów reakcji
enzymatycznych lub ilości substratów, które pozostały w środowisku
reakcji.
Metody kinetyczne stosuje się do pomiaru zmian absorbancji w czasie
(przyrost lub spadek), spowodowanych zmianami stężenia uczestniczą-
cych w reakcji koenzymów nikotynamidoadeninowych lub produktów
reakcji. W metodach kinetycznych często wykorzystuje się różnice
w absorbancji światła pomiędzy formą zredukowaną i utlenioną ko-
enzymu nikotynamidoadeninowego. Formy zredukowane NADH +
H

+

lub NADPH + H

+

pochłaniają światło przy długości fali 300-370

nm, podczas gdy ich postacie utlenione nie wykazują absorbancji
w tym zakresie. Oznaczany przyrost lub ubytek formy zredukowanej
nukleotydu jest miarą aktywności enzymu (rys. 6).



Piśmiennictwo dostępne na www.laboratorium.elamed.pl

Rys. 4. Wpływ temperatury na aktywność enzymu

Akt

ywność %

100

80

60

40

20

20

30

40

50

60

0

Rys. 5. Wpływ pH na aktywność: 1 – pepsyny,
2 – dekarboksylazy glutaminianowej,
3 –

α-amylazy śliny, 4 – arginazy

Rys. 6. Widma absorpcyjne dinukleotydów
nikotynamidoadeninowych

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

100

80

60

40

20

0

Akt

ywność %

pH

1

2

3

4

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

334

365

NAD (NADP)
NADH (NADPH)

χ(nm)

ºC

260

300

340

400

E

Rola oznaczeń enzymatycznych w medycynie laboratoryjnej – cz. I

dr n. med. Brygida Beck, mgr Aleksandra Malarska

Dział Diagnostyki Laboratoryjnej

Regionalne Centrum Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa w Opolu

Piśmiennictwo

1. Angielski S., Jakubowski Z., Dominiczak M. H. (red.): Biochemia kliniczna.

Wydawnictwo PERSEUSZ, Sopot 1996.

2. Bańkowski E.: Biochemia. Urban & Partner, Wrocław 2004.
3. Beck B., Birkner E., Bilińska K., Grucka-Mamczar E., Hebrowska B., Jacheć W.,

Mika G., Nowakowska Z., Polaniak R., Smolińska-Kozieł H., Sowa B., Tomasik A.:
Skrypt do ćwiczeń z biochemii. Cz. 1: Ćwiczenia praktyczne. (red.): R.Tarnawski.
ŚAM, Katowice1995.

4. Beck B., Birkner E., Błaszczyk U., Duliban H., Grucka-Mamczar E., Jacheć W.,

Kasperczyk A., Kasperczyk S., Polaniak R., Skrzep-Poloczek B., Widera E.,
Wojciechowska C., Zalejska-Fiolka J.: Skrypt do ćwiczeń z biochemii dla studentów II
roku Wydziału Lekarskiego i Oddziału Stomatologicznego. (red.): R. Tarnawski, E.
Birkner. ŚAM, Katowice 2000.

5.

Buchholz

K.,

Kasche

V.,

Bornscheuer

U.T.: Biocatalysts and Enzyme Technology.

John Wiley & Sons

, 2005.

6. Davidson V.L., Sittman D.B. (red.): Biochemia. Urban & Partner, Wrocław 2002.
7. Dembińska-Kieć A., Naskalski J.: Diagnostyka laboratoryjna z elementami biochemii

klinicznej. Elsevier Urban & Partner, Wrocław 2002.

8. Hames B.D., Hooper N.M., Houghton J.D.: Biochemia – krótkie wykłady.

Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2000.

9. Kłyszejko-Stefanowicz L.: Cytobiochemia. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa

1995.

10. Kłyszejko-Stefanowicz L. (red.): Ćwiczenia z biochemii. Wydawnictwo Naukowe

PWN, Warszawa 1999.

11. Matthews H.R., Freedland R.A., Miesfeld R.L.: Biochemia i biologia molekularna w

zarysie. Prószyński i S-ka, Warszawa 2000.

12. Purich D.L.: Contemporary Enzyme Kinetics and Mechanism 2E.

Academic Press

,

1996.