141
Karol Nowosad
1
, Piotr Stępień
2
, Paula Musiał
3
Sekwencjonowanie DNA – przegląd metod
1. Wstęp
Terminem sekwencjonowanie określa się ogół metod prowadzących do
odczytania kolejności nukleotydów w cząsteczkach kwasów nukleinowych.
Pierwsze próby zsekwencjonowania DNA były podejmowane w latach 70
wraz z pojawieniem się metody chemicznej degradacji łańcucha DNA
i równoczesnym opracowaniem przez zespół Sangera metody terminacji
łańcucha. Przełomem w rozwoju metod sekwencjonowania było wyizo-
lowanie termostabilnej polimerazy z Thermus aquaticus oraz opracowanie
techniki PCR, co znacznie zwiększyło wydajność procesu sekwen-
cjonowania i skróciło czas analizy [1,2]. Wykorzystanie reakcji PCR ze
znakowanymi fluorescencyjnie nukleotydami oraz zastąpienie klasycznych
żeli poliakrylamidowych wykorzystywanych do rozdziału uzyskanych
fragmentów DNA nowoczesnymi kapilarami stosowanymi do rozdziału
umożliwiło zautomatyzowanie metody Sangera. Zautomatyzowane aparaty
do sekwencjonowania zostały wykorzystane do analizy genomów
większości organizmów modelowych oraz analizy genomu człowieka
w projekcie HGP (ang. Human Genome Project), który zakończył się w
2003 roku [3,4,5]. Opracowanie metod NGS (ang. Next Generation
Sequencing) na początku XXI wieku oraz rozwój w dziedzinie
bioinformatyki umożliwiło zwiększenie przepustowości analizowanych
danych, znaczne obniżenie kosztów oraz czasu prowadzonych badań [6].
Obecnie dostępnych jest wiele metod sekwencjonowania, jednakże
ograniczenia oraz ciągle wysokie koszty analizy przyczyniają się do
poszukiwania
nowych
rozwiązań
umożliwiających
opracowanie
alternatywnych technik określania sekwencji nukleotydów. W niniejszej
pracy
przedstawiono charakterystykę
najpopularniejszych
metod
sekwencjonowania.
1
karol-nowosad@wp.pl, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie, Wydział Biologii
i Biotechnologii
2
piotr.stepien@interia.pl, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie, Wydział Biologii
i Biotechnologii
3
pp.auula17@gmail.com, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, Wydział Nauk
o Zdrowiu, Katedra Fizjoterapii, Zakład Medycyny Sportowej i Fizjologii Wysiłku Fizycznego
Karol Nowosad, Piotr Stępień, Paula Musiał
142
2. Metody klasyczne
2.1. Metoda chemicznej degradacji DNA
Metoda sekwencjonowania DNA oparta o chemiczną degradację łańcucha
została opisana w 1977 roku przez dwóch naukowców Allana Maxama
i Waltera Gilberta. W technice tej, fragmenty DNA z odpowiednio
wyznakowanymi nukleotydami na końcach poddawane są przy użyciu
specyficznych związków chemicznych losowemu rozszczepieniu w pozycji
adeniny, guaniny, cytozyny oraz tyminy. Degradacja chemiczna oparta jest
na 3 etapach:
modyfikacji zasady azotowej;
usunięciu zmodyfikowanej zasady azotowej;
przecięciu nici DNA w miejscu apurynowym lub pirymidynowym.
Metoda prowadzi do otrzymania zbioru cząsteczek DNA zakończonych
określonym nukleotydem A, G, C lub T, różniących się długością
o 1 nukleotyd [7]. To co wyróżnia tą technikę od metody Sangera jest to że
w inny sposób uzyskuję się pulę tych cząsteczek. Materiałem wyjściowym
jest dsDNA (ang. double-strand Deoxyribonucleic Acid), które przed
rozpoczęciem degradacji chemicznej znakowane jest promieniotwórczą
grupą fosforanową na końcu 5` nici. Wyznakowane radioaktywnie
fragmenty DNA rozdziela się na 4 części umieszczając każdą do innej
probówki. Przy użyciu odczynników chemicznych prowadzi się reakcje
częściowego rozszczepienia w różnych częściach zasad. Przeprowadza się
zwykle cztery równoczesne reakcje dla A+G, G, C, C+T. W reakcjach
właściwych dla G oraz C związek chemiczny silniej oddziałuję na G niż A
oraz C zamiast T. Odczynnik chemiczny w reakcjach G+A i C+T działa na
pirymidyny i puryny z taką samą siłą. Ważnym detalem jest dodanie
związku chemicznego w bardzo niewielkiej ilości. Odpowiednie dobranie
warunków reakcji sprawia że tylko jedna zasada z danego fragmentu będzie
zmodyfikowana. Modyfikacja zasady prowadzi do osłabienia wiązania
między zasadą a dezoksyrybozą. Późniejsze dodanie piperydyny powoduje
rozszczepienie wiązania glikozydowego w wyniku czego zasada azotowa
ulega usunięciu. Odszczepieniu ulega dezoksyryboza i nić DNA zostaje
w tym miejscu rozerwana [1]. Dla przykładu, dodanie ograniczonej ilości
siarczanu dimetylu, sprawia że w poszczególnych cząsteczkach metylowana
będzie całkowicie losowo tylko jedna guanina. Późniejsze dodanie piperydyny
powoduje usunięcie zmetylowanej zasady G i przecięcie ssDNA
(ang. single stranded Deoxyribonucleic Acid) przed miejscem w którym
znajdowała się zasada G. W wyniku takich działań uzyskuje się zbiór
cząsteczek wyznakowanych radioaktywną grupą fosforanową na końcu 5`
i różniących się długością na końcu 3`. W momencie uzyskania zbioru
cząsteczek dla wszystkich próbek, poddaje się go rozdziałowi elektro-
foretycznemu w żelu poliakrylamidowym. Wyznakowanie radioaktywną
Sekwencjonowanie DNA – przegląd metod
143
grupą fosforanową na końcu 5` umożliwia wizualizację wyników przy
użyciu autoradiografii [6].
Rys. 1. Autoradiogram [6- zmodyfikowano]
Uzyskany autoradiogram (rys.1.) odczytuje się od dołu. Prążek
znajdujący się najniżej odpowiada najmniejszej cząsteczce DNA. Prążek
znajdujący się w ścieżce A+G i brak prążka w ścieżce G daje nam
informacje że pierwszym nukleotydem w badanej sekwencji jest nukleotyd
A. Kolejny nukleotyd to C ponieważ prążek występuje zarówno w ścieżce
C jak C+T. W taki sposób przesuwając się w odczycie autoradiogramu
w górę odczytujemy sekwencje badanej cząsteczki DNA [1].
Metoda chemicznej degradacji DNA jest metodą sprawiającą trudności,
między innymi z powodu używania odczynników chemicznych dlatego
naukowcy odeszli od jej używania. W 1977 roku powstała alternatywna
metoda opracowana przez Fredericka Sangera[2,7]
Karol Nowosad, Piotr Stępień, Paula Musiał
144
2.2. Metoda terminacji syntezy łańcucha DNA
Metoda terminacji syntezy łańcucha DNA nazywana metodą Sangera
lub metodą dideoksy opiera się na podobnej zasadzie jak metoda Maxam-
Gilberta tzn., na uzyskaniu zbioru cząsteczek DNA zakończonych
konkretnym nukleotydem, różniących się długością o jeden nukleotyd [2].
Sposób w jaki uzyskuje się tą pulę cząsteczek jest podstawową różnicą
między tymi dwoma metodami. Metoda Maxam-Gilberta oparta jest na
degradacji cząsteczki DNA a metoda Sangera oparta jest na syntezie nowej
nici DNA [1,2]. W klasycznej metodzie Sangera materiałem wyjściowym
do sekwencjonowania jest ssDNA. W celu otrzymania ssDNA najpierw
należy sklonować badaną cząsteczkę DNA w wektorze umożliwiającym
uzyskanie jednoniciowych matryc. Do tego celu można użyć wektora
fagowego M13 lub fagemidu [6]. Metoda dideoksy opiera się na syntezie
cząsteczki DNA de novo. W klasycznej metodzie Sangera do syntezy nici
DNA używa się fragmentu Klenowa polimerazy DNA I. Polimeraza ta
pozbawiona jest fragmentu N-końcowej domeny w wyniku czego nie
posiada właściwości 5`-3` egzonukleolitycznej. Fragment Klenowa cechuje
się niską procesywnością. Oprócz zwykłych dNTP, potrzebne do tej reakcji
są wyznakowane radioaktywnymi izotopami dNTP, umożliwiające
wizualizację cząsteczki DNA na autoradiogramie. Ważnym elementem
w tej metodyce jest dodanie w ograniczonej ilości trifosforanów dideo-
ksynukleozydów (ddTTP, ddGTP, ddCTP i ddATP). Charakterystyczną
cechą ddNTP jest brak na końcu 3` grupy hydroksylowej. Można określić
ddNTP jako terminator syntezy DNA. W klasycznej metodzie Sangera
przeprowadza się cztery reakcje w probówkach które zawierają wszystkie
elementy potrzebne do przeprowadzenia syntezy de novo, różnią się
jedynie tym że do każdej z nich dodawany jest inny dideoksynukleotyd.
Rozpoczyna się synteza nici komplementarnych. Polimeraza dobudowuje
nukleotydy na zasadzie komplementarności, zarówno zwykłe dNTP jak
również wyznakowane dNTP radioaktywnymi izotopami. W momencie
gdy polimeraza doda ddNTP dochodzi do zatrzymania syntezy nici DNA.
W wyniku tego otrzymujemy zsyntetyzowaną nić DNA o której wiemy, że
w danej probówce zakończona jest użytym ddNTP. Czas reakcji oraz
stosunek stężenia dNTP do ddNTP dobrany jest w taki sposób, aby
otrzymać w danej probówce zbiór fragmentów DNA różniących się długością
o jeden nukleotyd zakończonych określonym ddNTP. Mieszaniny reakcyjne
z czterech probówek poddaje się elektroforezie w żelu poliakrylamidowym
[8,9]. Wyniki rozdziału elektroforetycznego wizualizowane są poprzez
autoradiografię. Uzyskany autoradiogram analizowany jest od dołu, czyli
od cząsteczki której synteza zakończyła się na pierwszym nukleotydzie od
Sekwencjonowanie DNA – przegląd metod
145
startera. Po przeanalizowaniu całego autoradiogramu uzyskuje się
sekwencje badanej cząsteczki DNA [2].
W klasycznej metodzie Sangera można odczytać kilkaset nukleotydów.
Analiza sekwencji DNA klasyczną metodą Sangera jest bardzo
pracochłonna. Przyczyniło się to do powstania metody sprawniejszej
i mniej czasochłonnej [7].
2.3. Sekwencjonowanie cykliczne
Sekwencjonowanie cykliczne jest to zmodyfikowana postać metody
Sangera. Idea tej metody jest podobna do metody dideoksy. W celu
uzyskania puli fragmentów DNA różniących się długością o jeden
nukleotyd, zakończonych zdefiniowanym nukleotydem wykorzystano
rekcję PCR (ang. polymerase chain reaction). W reakcji PCR wykorzystywana
jest zmodyfikowana, termostabilna polimeraza Taq, której powinowactwo
do ddNTP jest takie samo jak do dNTP. Zastosowanie jednego rodzaju
startera prowadzi do amplifikacji jednej nici DNA. Jest to modyfikacja
klasycznej reakcji PCR nazywana asymetrycznym PCR. Dzięki
zastosowaniu reakcji PCR materiałem wyjściowym może być ssDNA, jak
również dsDNA. Jest to znacząca różnica pomiędzy sekwencjonowaniem
cyklicznym, a metodą Sangera. Krokiem, który przyczynił się do
zautomatyzowania sekwencjonowania DNA było zastosowanie odpowiednio
wyznakowanych fluorescencyjnie ddNTP. Każdy rodzaj ddNTP został
wyznakowany innym fluoroforem. Istotnym elementem, który podczas
reakcji umożliwia uzyskanie odpowiedniej liczby fragmentów DNA
o różnej długości jest dobranie odpowiedniego stężenia ddNTP w roztworze.
Powinno być znacznie mniejsze od stężenia dNTP, co zmniejsza
prawdopodobieństwo dobudowania dideoksynukleotydu na samym
początku nowopowstającej nici DNA. Po zakończeniu reakcji uzyskany
materiał poddaje się elektroforezie w żelu poliakrylamidowym lub
elektroforezie kapilarnej. Sekwenatory wykorzystywane w tej technice
wyposażone są w laser, który jest źródłem światła. Działanie lasera
wzbudza znacznik fluorescencyjny, który powracając do stanu podstawowego
emituje światło o określonej długości fali, rejestrowane przez detektor.
W wyniku automatycznego sekwencjonowania uzyskujemy elektroferogram
Analiza uzyskanych danych umożliwia określenie sekwencji nukleotydów
w cząsteczce DNA [2,10].
Karol Nowosad, Piotr Stępień, Paula Musiał
146
3. Metody NGS II generacji
Nowe rozwiązania w sekwencjonowaniu DNA umożliwiły prowadzenie
analizy milionów fragmentów DNA w jednym czasie i przy znacznie
mniejszym nakładzie finansowym. Przy zastosowaniu NGS w ciągu jednej
doby można uzyskać sekwencję kilku genomów bakterii [11].
3.1. Pirosekwencjonowanie
Pirosekwencjonowanie jest najstarszą metodą zaliczaną do metod nowej
generacji. Wykorzystuje szereg reakcji enzymatycznych następujących
jedna po drugiej umożliwiających analizę sekwencji DNA w czasie
rzeczywistym. Możliwe jest to dzięki detekcji strumienia fotonów
powstałego w wyniku przekształcenia pirofosforanu, uwolnionego podczas
reakcji przyłączenia się określonego nukleotydu do nowopowstałej nici
DNA. Jako matrycę stosuje się jednoniciową cząsteczkę DNA. Zaawansowana
technologia stosowana w pirosekwencjonowaniu umożliwia analizowanie
ponad miliona fragmentów DNA jednocześnie. Wykorzystywane są do
tego celu mikropłytki posiadające do 1,5 mln studzienek o średnicy
0,44µm. Każda studzienka stanowi oddzielne środowisko reakcji, do
którego dozowane są odpowiednie enzymy oraz substraty. Pierwszym
etapem w sekwencjonowaniu jest reakcja polimeryzacji nici DNA
katalizowana przez zmodyfikowaną polimerazę DNA I pozbawioną
aktywności egzonukleolitycznej [12].
(DNA)
n
+ dNTP -> (DNA)
n+1
+ PP
i
(polimeraza)
W wyniku przyłączenia się pojedynczego nukleotydu do nici DNA
uwalniana jest cząsteczka pirofosforanu (PPi), która następnie w obecności
adenozynofosfosiarczanu (APS) przekształcana jest za pomocą sulfurylazy
ATP do adenozynotrifosforanu (ATP).W reakcji niezbędne są jony Mg
2+
będące kofaktorem sulfurylazy ATP.
PP
i
+ APS -> ATP + H
2
SO
4
(sulfurylaza ATP, Mg
2+
)
W następnych dwóch reakcjach, katalizowanych przez lucyferazę,
powstały ATP wykorzystywany jest do przekształcenia lucyferyny do
oksolucyferyny. Produkt pośredni pierwszej reakcji lucyferyno-AMP ulega
utlenieniu do oksolucyferyny. W wyniku przejścia oksolucyferyny ze stanu
wzbudzonego do stanu podstawowego wyemitowany zostaje strumień
fotonów, który rejestrowany jest przez detektor zaopatrzony w matrycę
CCD (ang. Charge Coupled Device).
lucyferyna + ATP ->lucyferylo-AMP + PP
i
(lucyferaza)
lucyferylo-AMP + O
2
->oksylucyferyna + AMP + hv (lucyferaza)
Sekwencjonowanie DNA – przegląd metod
147
Emisja fotonów światła następuje jedynie w wyniku przyłączenia
jednego z czterech nukleotydów (A,T,G,C). W przypadku, gdy
wprowadzony nukleotyd nie jest komplementarny do matrycy następuje
jego degradacja. Reakcja degradacji katalizowana przez apyrazę polega na
odłączeniu reszt fosforanowych od nukleotydów, które nie zostały
wbudowane do nici DNA. Defosforylacji ulega również niewykorzystane
ATP [13, 14, 15, 16].
ATP -> AMP + 2P
i
(apyraza)
dNTP ->dNMP + 2P
i
(apyraza)
Przekształcenie wyżej wymienionych związków do monofosforanów
zmniejsza tło reakcji. W pirosekwencjonowaniu do uzyskania odpowiednio
dużej puli fragmentów DNA stosuje się emulsion PCR, który jest modyfikacją
klasycznej reakcji PCR. Metoda ta umożliwia przeprowadzenie kilku
milionów reakcji amplifikacji w jednym „naczyniu” reakcyjnym.
Zastosowanie emulsji oraz dobór odpowiednich parametrów i proporcji
składników roztworu: wody i oleju, umożliwia utworzenie milionów
„mikrobioreaktorów”, w których przeprowadzane są równolegle reakcje
amplifikacji. W każdym „mikrobioreaktorze” znajduje się jeden nośnik
z naniesioną na powierzchni streptawidyną, do której za pomocą adapterów
przyłączają się fragmenty DNA. Adaptery są krótkimi fragmentami DNA
wyznakowanymi biotyną, które w reakcji ligacji łączą się z badanymi
cząsteczkami DNA. Wysokie powinowactwo biotyny do streptawidyny
umożliwia opłaszczanie nośnika fragmentami DNA [7, 17].
3.2. Solexa/Illumina
Firma Illumina w roku 2006 wprowadziła sekwenator nowej generacji
wykorzystujący reakcję odwracalnej terminacji. Materiał do sekwen-
cjonowania przygotowywany jest za pomocą polony PCR. DNA cięte jest
na fragmenty, które poddawane są następnie reakcji ligacji z krótkimi
oligoukleotydami (tzw., adapterami). Po przeprowadzeniu reakcji denaturacji
uzyskane jednoniciowe fragmenty immobilizuje się na mikropłytce, która
wykorzystywana jest w reakcji amplifikacji do namnożenia DNA. Miliony
kopii fragmentów DNA poddawane są sekwencjonowaniu. Jeden
sekwenator zdolny jest do sekwencjonowania 600 mln fragmentów DNA
jednocześnie. Sekwencjonowanie rozpoczyna się od wprowadzenia do
mieszaniny reakcyjnej wszystkich czterech nukleotydów wyznakowanych
fluorescencyjnie, z których każdy wyznakowany jest innym barwnikiem.
Specyficzne ulokowanie barwnika prowadzi do zablokowania miejsca
tworzenia wiązania fosfodiestrowego. Reakcja zostaje zatrzymana poprzez
przyłączenie nukleotydu komplementarnego do matrycy za pomocą
Karol Nowosad, Piotr Stępień, Paula Musiał
148
polimerazy DNA do nowopowstałej nici. Substraty niewykorzystane
w reakcji polimeryzacji zostają wymywane z mieszaniny, a sygnał
z dobudowywanego nukleotydu rejestrowany jest przez detektor zaopatrzony
w matrycę CCD. Następnie usuwany jest znacznik fluorescencyjny.
Prowadzi to do odblokowania grupy hydroksylowej na końcu 3’, co
umożliwia utworzenie nowego wiązania fosfodiestrowego. Cykl rozpoczynany
jest od początku, dozowana jest nowa porcja substratów. System ten
umożliwia jednorazowo zsekwencjonować fragment długości 30-42 bp.
Natomiast wydajność jednego sekwenatora wynosi 25Mb/h [17, 18, 19].
3.3. SOLID
SOLID (ang. Sequencing by OligoLigation and Detection) jest to system
oparty na reakcji ligacji. Wykorzystuje zestaw 8-nukleotydowych
wyznakowanych sond oraz pięć różnych pod względem wielkości
starterów. Każda sonda zawiera zdefiniowane pierwsze dwa nukleotydy
występujące w czterech różnych kombinacjach, przypadających na jeden
barwnik fluorescencyjny przyłączony do ostatniego nukleotydu. Pomiędzy
piątym a szóstym nukleotydem znajduje się miejsce cięcia. W metodzie tej
biblioteka DNA tworzona jest z zastosowaniem emulsion PCR. Zampli-
fikowane fragmenty DNA wraz z nośnikiem immobilizowane są na
szklanej mikropłytce stosowanej do analizy sekwencji w systemie SOLID.
Umożliwia to przeprowadzenie wielu reakcji sekwencjonowania
jednocześnie. Reakcja sekwencjonowania rozpoczyna się od hybrydyzacji
startera komplementarnego do adaptera łączącego jednoniciową matrycę
z nośnikiem. Wolna grupa –OH znajdująca się na końcu 3’ startera
umożliwia przeprowadzenie reakcji ligacji katalizowanej przez ligazę
DNA. Następny cykl prowadzący do przyłączenia kolejnego oligonukleotydu
poprzedzony jest odcięciem i wymyciem trzech ostatnich nukleotydów.
Prowadzi to do uwolnienia grupy hydroksylowej znajdującej się na końcu
3’ niezbędnej do utworzenia wiązania fosfodiestrowego oraz odłączenia
barwnika. Z wykorzystaniem jednego startera w wyniku przeprowadzenia
siedmiu reakcji ligacji syntetyzowany jest 35-nukleotydowey fragment
DNA. Przeprowadzenie pięciu „cykli” reakcji umożliwia uzyskanie pełnej
sekwencji. W każdym następnym „cyklu” stosowany jest starter krótszy
o jeden nukleotyd. Schemat reakcji przedstawia rys.2.
Sekwencjonowanie DNA – przegląd metod
149
Rys. 2 Schemat reakcji zachodzącej w systemie SOLID. Szczegółowe objaśnienia w tekście.
[20-zmodyfikowano].
Technologia ta umożliwia odczytanie 21-28Mb/h. Analiza wyników
wymaga zastosowania odpowiedniego oprogramowania do analizy
uzyskanych wyników [17, 18, 19, 21].
4. Metody NGS III generacji
Systemy
trzeciej
generacji
umożliwiają
sekwencjonowanie
pojedynczych cząsteczek w czasie rzeczywistym bez uprzedniego
przygotowania biblioteki DNA. Eliminuje to błędy powstające podczas
reakcji amplifikacji oraz skraca czas sekwencjonowania.
4.1. HeliScope
Dążenie do minimalizacji w skali nano i minimalnego użycia substratów
w reakcji sekwencjonowania zostało osiągnięte poprzez bezpośrednie
analizowanie sekwencji DNA pojedynczej cząsteczki bez konieczności jej
amplifikacji. Taki sposób analizy wymaga użycia bardzo wrażliwego
Karol Nowosad, Piotr Stępień, Paula Musiał
150
systemu detekcji i układu fizycznego zdolnego do rejestracji i identyfikacji
sygnału świetlnego pochodzącego od pojedynczej cząsteczki barwnika
fluorescencyjnego. Jedną z pierwszych technik sekwencjonowania
pojedynczych cząsteczek DNA, została opisana przez zespół S.Quake’a
i opatentowana przez firmę Helicos Biosciences. Helicos wprowadził na
rynek pierwszy system sekwencjonowania oparty na pojedynczej cząsteczce
DNA w 2007 roku. System ten zdolny jest do sekwencjonowania DNA, od
kilku do kilku tysięcy nukleotydów. Optymalną długością do sekwen-
cjonowania dla systemu Helicos są cząsteczki DNA o długości około 100-200
nukleotydów. Do pojedynczych cząsteczek dosyntetyzowany jest ogon poli-A
z zastosowaniem polimerazy poliadenylowej. Dodatkowo każda nić na
końcu 3` zawiera wyznakowaną fluorescencyjnie adenozynę. Próbki DNA
poddawane są hybrydyzacji z im mobilizowanymi starterami w komorze
przepływowej. Startery stosowane w tej metodyce to oligo(dt)50. Każda
matryca DNA po hybrydyzacji do startera znajdującego się na mikropłytce
w komorze przepływowej poddawana jest osobnej reakcji sekwencjonowania.
Miejsca hybrydyzacji matryc DNA ze starterami określane są dzięki
wyznakowanym adenozynom. Przed rozpoczęciem reakcji polimeryzacji
wyznakowana adenozyna jest usuwana. Mieszanina reakcyjna, w której
skład wchodzi polimeraza DNA oraz jeden z czterech nukleotydów
wyznakowanych fluorescencyjnie dozowana jest do komory przepływowej.
Swoiste umiejscowienie fluoroforu w nukleotydzie blokuje syntezę wiązania
fosfodiestrowego. Przed wbudowaniem następnego nukleotydu do
nowopowstającej nici DNA znacznik jest usuwany, co umożliwia
przeprowadzenie dalszej reakcji. Każde jednorazowe wbudowanie nukleotydu
poprzedzone jest wymyciem składników niewykorzystanych w poprzedniej
reakcji oraz wprowadzenie nowej porcji mieszaniny reakcyjnej. Wydajność
jednego sekwenatora wynosi 4150Mb/24h [18, 22, 23, 24].
4.2. SMRT
SMRT (ang. Single-Molecule Real-Time) jest to technika wykorzystująca
sekwencjonowanie pojedynczych cząsteczek DNA w czasie rzeczywistym
zastosowana w sekwenatorze PacBio RS, III generacji wprowadzonym
przez firmę Pacific Bioscience. Metoda ta wykorzystuje pojedynczą
cząsteczkę polimerazy DNA Φ29 o wysokiej procesywności (> 70 000 bs)
zimmobilizowaną na powierzchni ZMWs (ang. zero-modewaveguides).
ZMWs są to studzienki o średnicy 70nm oraz wysokości 100nm, w których
zachodzi reakcja sekwencjonowania. Deoksyrybonukleotydy stosowane
w tej technice wyznakowane są różnymi barwnikami fluorescencyjnymi
przyłączonymi do grupy fosforanowej. Emisja strumienia fotonów
z dołączonego nukleotydu rejestrowana jest w czasie rzeczywistym przez
Sekwencjonowanie DNA – przegląd metod
151
detektor ZMW. Po wbudowywaniu nukleotydu polimeraza uwalnia
fluorofor wraz z pirofosforanem i przyłącza następny nukleotyd.
Wydajność sekwenatora wynosi około 40Mb na 40min [25].
5. Podsumowanie
W artykule przedstawiono przegląd najbardziej popularnych metod
sekwencjonowania cząsteczek DNA. Pierwsze metody sekwencjonowania
DNA pozwalały na poznanie małych genomów organizmów prokariotycznych
i eukariotycznych. Połączenie modyfikacji reakcji PCR i metody dideoksy
z wyznakowanymi fluorescencyjnie nukleotydami umożliwiło z automaty-
zowanie i zaprojektowanie pierwszego sekwenatora. Pełna automatyzacja
procesu sekwencjonowania DNA i zmniejszenie kosztów związanych
z prowadzeniem badań spowodowało rozpoczęcie i zakończenie wielu
projektów poznania genomów w tym także genomu ludzkiego w 2003 roku.
Postęp techniki oraz rozwój w dziedzinach inżynierii genetycznej, biologii
molekularnej w przeciągu ostatnich 30 lat zaowocował powstaniem
nowych metod NGS II i III generacji. Nowe podejście do analizy sekwencji
DNA wpłynęło na zmniejszenie kosztów i czasu przeznaczanych na
badania. Dzięki postępowi technicznemu co roku ilość zidentyfikowanych
sekwencji DNA znacząco wzrasta. Poznanie sekwencji genomów
umożliwiło lepsze zrozumienie procesów biologicznych zachodzących
w żywych organizmach.
Literatura
1. Mullis KB, Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid
sequences using a thermstable enzyme, U.S. Patent 4, 1990, 965,188
2. Brown TA, Genomy, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2001, 36,60-70
3. Chain P.S, Grafham D.V, Fulton R.S, Fitzgerald M.G, Hostetler J, Muzny
D, Ali J, Birren B, Bruce D.C, Buhay C, Cole J.R, Ding Y, Dugan S, Field
D, Garrity G.M,Gibbs R, Graves T, Han C.S, Harrison S.H, Highlander
S, Hugenholtz P, Khouri H.M, Kodira C.D, Kolker E, Kyrpides NC, Lang
D, Lapidus A, Malfatti S.A, Markowitz V, Metha T, Nelson KE, Parkhill
J, Pitluck S, Qin X, Read T.D, Schmutz J, Sozhamannan S, Sterk P, Strausberg
Chien A, R.L, Sutton G, Thomson N.R, Tiedje J.M,Weinstock G, Wollam
A, Detter J,C, Genomics. Genome project standards in a new era of
sequencing, Science, 2009 Oct 9;326(5950):236-7
4. Maxam AM, Gilbert W, A new method for sequencing DNA, Proceeding
of the National Academy of Sciences of the United States of America,
1977 Feb;74(2): 560-564
5. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR., DNA sequencing with chain-terminating
inhibitors, Proceeding of the National Academy of Sciences of the United
States of America, 1977 Dec;74(12):5463-5467
6. Franca LT, Carrilho E, Kist TB, A review of DNA sequencing techniques,
Quarterly Reviews of Biophysics, 2002 May;35(2):169-200
Karol Nowosad, Piotr Stępień, Paula Musiał
152
7. Pettersson E, Lundeberg J, Ahmadian A, Generations of sequencing
technologies, Genomics, 2009 Feb;(2):105-111
8. Prober JM, Trainor GL, Dam RJ, Hobbs FW, Robertson CW, Zagursky RJ,
Cocuzza AJ, Jensen MA, Baumeister K, A system for rapid DNA sequencing
with fluorescent chain-terminating dideoxnucleotides, Science, 1987 Oct
16;238(4825)336-341
9. Roe BA, Johnston-Dow L, Mardis E, Use of a chemically modified T7 DNA
polymerase for manual and automated sequencing of supercoiled DNA,
Biotechniques, 1988 Jun;6(6);520
10. Ansorge WJ, Next-generation DNA sequencing techniques, New
Biotechnology, 2009 Apr;25(4):195-203
11. Ahmadian A, Ehn M, Hober S, Pyrosequencing: history, biochemistry
and future, Clinica Chimica Acta, 2006 Jan;363(1-2):83-94
12. Klenow H, Overgaard-Hansen K, Patkar SA, Proteolytic cleaage of native
DNA polymerase into two different catalytic fragments. Influence of assay
conditions on the change of exonuclease activity and polymerase activity
accompanying cleavage, European Journal of Biochemistry, 1971;22:371-381
13. Segel IH, Renosto F, Seubert PA, Sulfate-activating enzymes, Methods in
Enzymology, 1987;143:334-349
14. Deluca M, Firefly luciferase, Advances in Enzymology and Related Areas
of Molecular Biology, 1976;44:37-68
15. Komoszyński M, Wojtczak A, Apyrases (ATP diphosphohydrolases, EC
3.6.1.5): function and relationship to ATPases, Biochimica et Biophysica
Acta, 1996 Feb2;1310(2):233-241
16. Mardis ER, Next-generation DNA sequencing methods, Annual Review
of Genomics and Human Genetics, 2008;9:387-402
17. Kircher M, Kelso J, High-throughput DNA sequencing-concepts and
limitations, Bioessays, 2010 Jun;32(6):524-536
18. Mardis ER, The impact of next-generation sequencing technology on genetics,
Trends in Genetics, 2008 Mar;24(3):133-141
19. Voelkerding KV, Dames są, Durtschi JD, Next-generation sequencing: from
basic research to diagnostics, Clinical Chemistry, 2009 Apr;55(4):641-658
20. Hurd PJ, Nelson CJ, Advantages of next-generation sequencing versus
the microarray in epigenetic research, Briefings in Functional Genomics,
2009 May;8(3):174-183
21. Zhu Z, Waggoner AS, Molecular mechanism controlling the incorporation of
fluorescent nucleotides into DNA by PCR, Cytometry, 1997 Jul 1;28(3):206-211
22. Bowers J, Mitchell J, Beer E, Buzby PR, Causey M, Efcavitch JW, Jarosz M,
Krzymanska-Olejnik E, Kung L, Lipson D, Lowman GM, Marappan S,
Mclnerney P, Platt A, Roy A, Siddigi SM, Steinmann K, Thompson JF,
Virtual terminator nucleotides for next-generation DNA sequencing, Nature
Methods, 2009 Aug;6(8):593-595
23. Pushkarev D, Neff NF, Quake SR, Single-molecule sequencing of an individual
human genome, Nature Biotechnology, 2009 Sep;27(9):847-850
24. Korlach J, Bjornson KP, Chaudhuri BP, Cicero RL, Flusberg BA, Gray JJ,
Holden D, Saxena R, Wegener J, Turner SW, Real-time DNA sequencing from
single polymerase molecules, Methods in Enzymology, 2010;472:431-455
Sekwencjonowanie DNA – przegląd metod
153
Sekwencjonowanie DNA- przegląd metod
Streszczenie
Pojęcie sekwencjonowanie DNA definiowane jest jako technika prowadząca do odczytania
kolejności par nukleotydów w cząsteczkach kwasów nukleinowych. Opublikowane w 1977
roku dwóch różnych metod sekwencjonowania, umożliwiło poznanie pierwszych sekwencji
DNA dając początek nowej dziedzinie zwanej genomiką strukturalną. Wspólną ideą obu
metod jest uzyskanie zbioru fragmentów DNA zakończonych określonym nukleotydem,
różniących się o jeden nukleotyd. Metoda Maxama-Gilberta oparta jest na chemicznej
degradacji łańcucha, natomiast metoda Sangera opiera się na syntezie nowej nici DNA.
Metodą obecnie najczęściej stosowaną jest metoda Sangera, która swą popularność
zawdzięcza łatwemu zautomatyzowaniu. W kontekście uzyskiwania sekwencji całych
genomów organizmów złożonych w jak najkrótszym czasie, dotychczasowe metody nie
spełniały w pełni oczekiwań naukowców, co przyczyniło się do opracowania metod NGS II
generacji (ang. New Generation Sequencing). Należy zwrócić uwagę że, uzyskane metody
oprócz obniżenia długości czasu prowadzonych badań, znacznie obniżyły ich koszt.
Atrakcyjność tych metoda przyczyniła się do wzrostu zainteresowania badaniem sekwencji
DNA. Powstałe systemy trzeciej generacji umożliwiają sekwencjonowanie pojedynczych
cząstek DNA, bez konieczności wcześniejszej reakcji PCR (ang. Polymerase Chain
Reaction).
Słowa kluczowe: sekwencjonowanie DNA, metoda Sangera, NGS II generacji, NGS
III generacji