Sekwencjonowanie DNA:

-poznanie sekwencji nukleotydów występujących

Zastosowanie:

-sekwencjonowanie de Novo całych genomów

-resekwencjonowanie

-poszukiwanie mutacji

-genotypowanie

-identyfikacja osobnicza

-analiza polimorfizmu długości fragmentów

-analiza zmian epigenetycznych

Sekwencjonowanie metodą chemiczną:

-opracowana przez Maxama i Gilbera w 1977r.

-chemiczna modyfikacja określonych zasad i ilościowa degradacja zmodyfikowanych łańcuchów DNA przez rozszczepianie poszczególnych nukleotydów przez piperydynę

-jedna nić jest znakowana na końcu 3 lub 5’.

-4 reakcje: G; G+A; T+C; C

-metoda niewrażliwa na trudne sekwencje (np. bogate w pary GC)

Sekwencjonowanie metodą enzymatyczną DNA-początki:

-opracowana przez Sangera i Coulsona w 1977r.

-zastosowanie polimerazy i tri fosforanów ddNTP

-początkowo reakcja w 4 probówkach

-ddNTP znakowane radioizotopowo 32P lub 35S

-elektroforeza w denaturującym żelu poliakrylamidowym w 4 ścieżkach

-uwidocznienie prążków na kliszy rentgenowskiej po autoradiografii żelu

Sekwencjonowanie metoda enzymatyczną:

-sekwenatory kapilarne

-reakcja w 1 probówce

-ddNTP znakowane czterema różnymi fluorochromami

-automatyczny odczyt sekwencji.

Sekwencjonowanie w czasie rzeczywistym – pirosekwencjonowanie:

-max odczyt to 40-60 nt.

-metoda służy do:

*głównie do genotypowania znanych polimorfizmów

Pirosekwencjonowanie:

-wykorzystanie jednocześnie 4 enzymów: polimeraza DNA, sulfurylaza ATP, lucyferaza, apiraza.

-matryca: jednoniciowy DNA

-składniki reakcji: matryca, enzymy, adenozyno-5’-fosfosiarczan, nukleotydy, lucyferyna.

C.D.:

-kolejność dodawania jednego z czterech dNTP odbywa się automatycznie

-jeśli dNTP jest komplementarny następuje wbudowanie i uwolnienie pirofosforanu

-sulfurylaza przekształca pirofosforan do ATP wykorzystując APS

-lucyferaza z użyciem ATP przekształca lucyferazę do oskylucyferyny emitując światło

-sygnał świetlny jest rejestrowany przez fotodetektor CCD

-apiraza degraduje ATP i niezwiązane nukleotydy

-następny nukleotyd może być dodany do mieszaniny reakcji.

Nowa generacja sekwencjonowania:

*technologia służy do:

-sekwencjonowania nieznanych sekwencji

-resekwencjonowania

-badanie regulacji ekspresji genów

-analiza trans kryptonów

-określanie zmian epigenetycznych

*sekwenatory genomowe:

-analizują miliony nukleotydów w ciągu kilkunastu godzin

-sekwencjonowanie najczęściej fragmentów 50 nukleotydowych

-fragmenty o długości 200-300 pz

-dokładność 99,99%

*systemy:

-454 Life sciens

-Solid

-Solexa Genome Analyzer.

Nowa generacja sekwencjonowania – system SOLID:

1.Fragmentacja DNA na odcinki 300-800 pz.

2.Przyłączanie do końców 5’ i 3’ adapterów – utworzenie biblioteki genomowej jednoniciowych fragmentów.

3.Przyłączenie do fragmentu z adapterem specjalnego koralika i wytworzenie wokół otoczki.

4.”Emulsyjny PCR”- amplifikacja kilku milionów jednorodnych kopii wyjściowej matrycy na powierzchni koralika.

5.Uwolnienie koralika z emulsyjnej otoczki do studzienki reakcyjnej.

6.Pirosekwencjonowanie i detekcja sygnału w każdej studzience

7.Analiza sekwencji.

Każda sonda jest oktamerem – zawiera dwa specyficzne nukleotydy i 6 nukleotydów podlegających degradacji. Na końcu 5’ wyznakowana jest jednym z czterech fluochormonów.

-przyłączenie uniwersalnego primera do sekwencji adaptera

-następnie przyłączenie jednej z sond za pomocą ligazy

-emisja fluorescencji

-odcięcie 3 nukleotydów z sondy

-przyłączenie następnej sondy, połączenie za pomocą ligazy i odczyt fluoroscencji przyłączenie kolejnego startera (n-1) i kolejnej rundy ligacji sond.

Nowa generacja sekwencjonowania – system Illumina:

*Różnica z systemem SOLID:

-zamiast emulsyjnego PCR do amplifikacji stosuje się „bridge amplification”

-generacja klasterów na komórce przepływowej a nie w studzienkach płytki

-sekwencjonowanie poprzez konkurencyjne przyłączania właściwego nukleotydu.

Sekwencjonowanie genomu:

-ustalenie sekwencji nukleotydów krótkich fragmentów i składanie ich w nieprzerwany ciąg, tak żeby uzyskać sekwencję chromosomu

-sekwencje genomu, to zestaw sekwencji poszczególnych chromosomów, wchodzących w skład zestawu haploidalnego.

Znane sekwencje genomów jądrowych:

Rzodkiewnik pospolity – 2000; człowiek 2001; ryż – 2002; mysz – 2002; szczur -2003; pies 2003 i 2005; bydło 2004, kura 2004, szympans 2005; pszczoła miodna 2006; koń 2007; kot 2007; świnia 2012.

Dokładność sekwencjonowania wyrażana jest współczynnikiem sequence coverage:

*sequece coverage:

-przeciętna wielokrotność z jaką dany nukleotyd występuje w kolekcji fragmentów DNA, które sekwencjonowano

-np.: genom o wielkości 1Mpz, przeciętna długość sekwencjonowania fragmentu wynosi ok. 500pz.

-pies – 1,5x(2003r.); 7,5x (2005r,)

Genom człowieka – niektóre wnioski z 2001r.:

- w trakcie ewolucji mutacje zachodziły u mężczyzn z częstością około dwukrotnie wyższą niż u kobiet

-crossing-over zachodzi znacznie częściej w obszarach dystalnych i w najkrótszych ramionach chromosomów

-zidentyfikowano ponad 1,4 mln miejsc, w których występują mutacje punktowe

-nie ma różnic rasowych pod względem budowy i organizacji człowieka.

-z października 2004r.:

-oszacowana liczba genów : ok. 22 tys.

-ustalono sekwencję ponad 99% obszarów euchromatynowanycj, w których uzyskano dokładność sekwencjonowania na poziomie 99,9999%

-w genomie człowieka nadal są „przerwy”:

-w 2000 r. było ich 150.000

-w 2004 r. jest ich tylko 341.

-duplikacje fragmentów chromosomowych pokrywają ok. 5,3%

-w genomie szczura – 3%

-u myszy 1%

-występowanie duplikacji fragmentów chromosomowych jest nierównomierne rozłożenie w genomie:

-w chromosomie Y ok. 25% sekwencji to duplikacje

-duplikacje zazwyczaj zgromadzone są w pobliżu centromerów i telomerów.

-od czasu oddzielenia się gryzoni w ewolucji ssaków w genomie człowieka pojawiło się ok. 1.000 nowych genów

-jednocześnie w nieodległym okresie 33 geny utraciły funkcjonalność – powstanie pseudogenów, a 27 spośród nich ma również charakter pseudogenów w genomie szympansa.

Różnice między genomem człowieka a szympansa:

-różnice SNP – ok. 35 mln. SNP

-różnice typu indele – ok. 5 mln. Ale obejmują ok. 90 Mpz

-niewielkie różnice w częściach kodujących białka – 29% białek ma identyczną sekwencję aminokwasów a pozostałe zazwyczaj różnią się 1-2 aminokwasami

U szympansa mamy 1,66 mln SNP.

Ustalono 4 mld. Nukleotydów około 60% dla neandeartalczyka.

Zróżnicowanie wielkości genomów organizmów eukariotycznych:

-długość DNA genomowego

-człowiek- ok. 2.9 mld pz

-mysz – ok. 2.5 mld pz

-pies – ok. 2.4 mld pz

-rzodkiewnik – 120 mln pz

Zawartość sekwencji powtarzalnych w genomie:

-człowiek 46%

-pies 38%

-mysz 31%.

Genom myszy:

-niektóre wnioski:

-około 90% genomu myszy i człowieka można uporządkować w odpowiadające sobie segmenty

-a 40% genomu człowieka jest zgodna z sekwencja myszy.

Genom psa:

-80% genów psa wykazuje homologię z genami człowieka, chociaż jedynie 83% tran skryptów człowieka wykazywało identyczność sekwencji przekraczającej 50 % ich długości

Bydło – ok. 3 mld. pz