SEKWENCJONOWANIE DNA 2

background image

SEKWENCJONOWANIE
DNA

Mateusz Lorenc gr.8a

background image

Sekwencjonowanie DNA jest to technika
odczytywania sekwencji par
nukleotydowych w cząsteczce DNA.

background image

Cele sekwencjonowania:

dostarcza wielu cennych informacji o
strukturze i funkcji genów,

znajomość pełnej sekwencji DNA
badanych organizmów umożliwia
zrozumienie molekularnych mechanizmów
ich funkcjonowania i ewolucji

umożliwia szukanie mutacji

background image

Metody sekwencjonowania
DNA:

Metoda Maxama i Gilberta (1977)

Metoda Sangera - metoda terminacji wydłużania
łańcucha tzw. metoda dideoksy (1981)

Automatyczne sekwencjonowanie z
wykorzystaniem dideoksyrybonukleotydów
znakowanych fluorescencyjnie(1987)

Pirosekwencjonowania – sekwencjonowanie w
czasie rzeczywistym

Stosowanie polimerazy

Składanie z wielu sekwencji wyjściowej sekwencji
chromosomów.

background image

Metoda Maxama i Gilberta - metoda

chemicznego sekwencjonowania

Polega na użyciu związków chemicznych do
specyficznego rozczepienia DNA.

1.

Fragment DNA znakuje się na jednym końcu:

- Radioaktywnym fosforanem na końcu 5`
-Radioaktywnym nukleotydem na końcu 3`

2.

Znakowany DNA poddawany jest reakcjom
zrywania w miejscach występowania
określonych zasad

3.

Uzyskane fragmenty rozdziela się przy
użyciu elektroforezy, a następnie poddaje
autoradiografii.

background image
background image

Metoda Sangera

Polega na przedwczesnej terminacji syntezy

DNA wynikającej z przyłączenia
dideoksynukleotydem.
Przebeg:
- Przygotowanie 4 mieszanin reakcyjnych
zawierających: kopie jednoniciowego DNA
do sekwencjonowania, polimeraze DNA,
radioaktywnie znakowane startery, 4 rodzaje
deoksyrybonukleoidów( dATP, dCTP, dGTP,
dTTP)

w każdej z mieszanin znajduje się również

jeden z dideoksyrybonukleoidów(ddATP,
ddCTP, ddGTP, ddTTP) .

background image

Metoda Sangera

Przebieg w mieszaninie z ddATP:

-

W każdym miejscy gdzie występuje adenina,
rosnąca nić przypadkowo wbudowuje ddATP, co
hamuje jej wydłużanie.

-

W mieszaninie powstaje wiele fragmętów DNA
różnej wielkości. W każdym fragmęcie w
miejscu gdzie znajduje się ddATP znajdowałaby
się adenina – w normalnie syntetyzowanej nici.

-

Radioaktywne fragmęty każdej z reakcji
denaturuje się, następnie dokonuje się
elektroferezy powstałych cząsteczek, gdzie
każda mieszanina tworzy osobny prążek w żelu.

background image
background image

Automatyczne sekwencjonowanie z
wykorzystaniem
dideoksyrybonukleotydów
znakowanych fluorescencyjnie.

W systemie tym stosuje się nukleotydy

dideoxy znakowane czterema różnymi
znacznikami fluorescencyjnymi. Detektor
fluorescencji w trakcie ekektroferezy
ustala zakończenia cząsteczek ( czy
kończy się ona na A, T, C czy G)

background image

Wydruk z sekwenatora, sekwencja w
postaci serii szczytów, z których
każdy
odpowiada innemu nukleotydowi.
W przedstawionym przykładzie A-
zielony, C-niebieski, G- czarny, T-
czerwony.

background image

Pirosekwencjonowanie – w czasie

rzeczywistym

Metoda ta jest dużo szybsza od metody terminacji łańcucha ze

względu na to, że nie wymaga elektroferezy ani innego
rozdzielania fragmętów.

Przebieg:

-

Matryca jest kopiowana w prosty sposób bez dodawania
dideoksynukleotydów do mieszaniny.

-

Dołączeniu nowego nukleotydu towarzyszy uwolnienie
cząsteczki pirofosforanu, której przekształcenie za pomocą
fosfatazy daje błysk będący wynikiem chemiluminescencji.

-

Każdy nukleotyd dodawany jest osobno, a jeśli dany nukleotyd
nie zostanie wbudowany to jest degenerowany przez
nukloetydaze.

-

W czasie syntezy rejstruje się kojeność wbudowywanych
nukleotydów co pozwala na bezpośredni odczyt.

background image

Pirosekwencjonowanie

background image

Im wyższy jest pik świetlny, tym większa ilość
nukleotydów została wbudowana kolejno po sobie. Brak
sygnału świetlnego świadczy o tym, że nukleotyd nie
został wbudowanym z powodu niekomplementarności.

background image

Składanie sekwencji
chromosomu

Strategia „shotgun” – dotyczy krótkich genomów
prokariotycznych. Polega na znalezienie za
pomocą komputera zachodzących na siebie
końców w celu złożenia sekwencji wyjściowej.

Strategie tą zastosowana po raz pierwszy do

zsekwencjonowania genomu Haemophilus
influenzae.

Ukierunkowana strategia „shotgun” – dotyczy
wiekszych genów eukariotycznych. Wykorzystuje
się informacje zawarte w mapie genomowej.


Document Outline


Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
wiczenie Nr Sekwencjonowanie DNA USTALENIE SEKWENCJI NUKLEOTYDO
Lekcja 6 sekwencjonowanie DNA sekwencje genomów
Sekwencjonowanie DNA prezentacja
BIOTECHNOLOGIA 10d sekwencjonowanie DNA
W4 Metody powielania sekwencji DNA
Sekwencjonowanie DNA
Sekwencjonowanie DNA
Nowosad K, Stępień P, Musiał P Sekwencjonowanie DNA Przegląd metod [2015]
Sekwencjonowanie DNA
Wykład 10x, Genom- obejmuje sekwencje kodujące i niekodujące DNA
Replikacja DNA i choroby związane
W5 sII PCR i sekwencjonowanie cz 2
Elektroforeza DNA komórkowego BioAut1, BioAut2 i Ch1
DNA Eng2
Metoda symultaniczno sekwencyjna
Wykład VIII Synteza układów sekwencyjnych

więcej podobnych podstron