Klonowanie genów

Biblioteki genomowe

Reakcja PCR

Metody powielania

sekwencji DNA

Łączenie fragmentów DNA ciętych

enzymami restrykcyjnymi

Klonowanie

•Trawienie wektora enzymem restrykcyjnym

•Trawienie interesującego nas fragmentu DNA tym
samym enzymem

•Łączenie – fragmentu z wektorem (ligacja)

•Wprowadzenie plazmidu do bakterii
(transformacja)

•Wysiewanie bakterii na płytkę z odpowiednim
antybiotykiem

•Minipreparatyka DNA z pojedynczych kolonii

•Trawienie enzymem restrykcyjnym (wycinanie
„wstawki”)

•Elektroforeza

•Namnażanie bakterii z kolonii zawierających
wstawkę

•Bankowanie

Wektory

•Plazmidowe – najmniejsze,
nadają się do klonowania
fragmentów do kilku tysięcy
pz

•Fagowe – większe,
klonowanie fragmentów do
kilkudziesięciu tysięcy pz

•Drożdżowe – największe,
klonowanie fragmentów
kilkuset tysięcy pz i więcej

Biblioteki genomowe

Biblioteka genomowa
jest zbiorem różnych
sekwencji
sklonowanych w
wektorach

Przeszukiwanie biblioteki

Biblioteki fagowe (fag Lambda)

Biblioteka genomowa

Biblioteka cDNA

Reakcja PCR (Polymerase Chain Reaction)

•Najczulsza metoda wykrywania i
powielania fragmentów DNA o
określonej sekwencji

•Pozwala na wykrycie i amplifikację
pojedynczej kopii interesującej
sekwencji

Główne etapy reakcji PCR

•Denaturacja wyjściowych cząsteczek DNA

•Wiązanie primerów (annealing)

•Wydłużanie łańcucha (extension)

Denaturacja

Annealing

(wiązanie
primerów

)

Extension
(wydłużanie)

Powielone cząsteczki

PCR

Temperatura jest najważniejszym

czynnikiem wpływającym na wynik

w reakcji PCR

PCR

Primery (startery)

1. długość 18-25 nukleotydów
2. skład 40-60% GC
3. nie powinny zawierać odwróconych powtórzeń
4. temperatura topnienia podwójnoniciowej cząsteczki

tworzonego przez

oba primery z matrycą powinna być

podobna

5. na końcu 3’ powinny mieć G lub C, ale nie więcej niż

jeden nukleotyd

Denaturacja

•Temperatura zależy od składu zasad fragmentu który chcemy
powielić

•Przy fragmentach bogatych w GC używać polimeraz bardziej
opornych na wysoką temperaturę

•Najpopularniejsza polimeraza używana standartowo w PCR – Taq
wytrzymuje temperaturę 94-95 stopni C

Annealing

Temperatura za wysoka – słaba wydajność,

za niska niespecyficzne powielanie

Stosuje się temperaturę około 3-5 stopni poniżej oszacowanej
temperatury topnienia

[Praktyczny wzór na temperaturę topnienia dla primera o 20
nukleotydach:

T=2x(A+T) + 4(G+C)]

Extension

Temperatura tej części cyklu zależy od właściwości polimerazy.
Dla polimerazy Taq optymalna jest temperatura 72-78 stopni
Szybkość reakcji w optymalnych warunkach około 2000
nukleotydów/min

PCR

Anemia sierpowata

RFLP PCR – polimorfizm długości fragmentów
restrykcyjnych

Reverse Transcription PCR

Real Time PCR

Pozwala na śledzenie
akumulacji produktów w
trakcie przebiegu
reakcji PCR

Sekwencjonowani

e DNA

(metoda

dideoxy-)

Nukleotydy dideoxy- powodują
zakończenie replikacji DNA

Sekwencjonowanie

DNA

C

G

Znakowanie
sekwencjonowane
go

fragmentu

pojedynczym
nukleotydem

Znakowanie końcowego

nukleotydu (dideoxy)

Odczytywanie sekwencji DNA

Metoda chemiczna sekwencjonowania polega na

wykorzystaniu specyficznych wobec

poszczególnych zasad reakcji chemicznych, co

pozwala na identyfikację miejsca występowania

danej zasady

Zasada

Specyficzna modyfikacja

G

Metylacja N7 dimetylosiarczanem w pH 8.0
sprawia, że wiązanie C8-C9 staje się specyficznie
wrażliwe na rozkład przy pomocy zasady.

A+G

Mrówczan piperydyny w pH 2.0 osłabia wiązania
glikozydowe puryn, co powoduje depurynację

C+T

Hydrazyna otwiera pierścień pirymidynowy, który

następnie recyklizuje w formę podatną na
usunięcie

C

W obecności 1.5 M NaCl jedynie cytozyna reaguje
specyficznie z hydrazyną

A>C

1.2 N NaOH w temp. 90

0

C powoduje częste

przecinanie reszt A i rzadsze - C

Piperydyna przecina łańcuch fosfocukrowy w miejscu modyfikacji zasady

Odczytywanie sekwencji

Specyficzne znakowanie jednej

nici DNA przy użyciu fragmentu

Klenowa polimerazy I

Sekwencjonowanie automatyczne
W systemie tym stosuje się nukleotydy dideoxy lub startery
znakowane czterema różnymi znacznikami fluorescencyjnymi.
Można stosować sekwencjonowanie rozpoczynające się od jednego
startera
i zatrzymujące się na znakowanych nukleotydach dideoxy.
Wszystkie cztery znakowane nukleotydy dideoxy występują wtedy
w jednej mieszaninie.
Inną możliwością jest stosowanie znakowanych starterów,
prowadzenie czterech niezależnych reakcji, a następnie rozdział na
jednej ścieżce żelu. Po reakcji mieszanina nanoszona jest na żel
poliakrylamidowy,
a elektroforeza prowadzona jest w aparacie wyposażonym w
detektor promieniowania.

System

ABI

(Applied

Biosystems

Incorporated)

używa

czterech

znakowanych

fluorescencyjnymi

barwnikami

ddNTPs

i polimerazy Taq

(AmpliTaq).

Wzbudzanie fluorochromów i detekcja emisji
mają miejsce w określonej pozycji w pobliżu
dolnej części żelu. Dane są odczytywane na
podstawie spektrum emisyjnego kolejnych pasm
mijających

detektor

w czasie elektroforezy. Dane przekazywane są
do komputera podłączonego do urządzenia

.

Sekwencjonowanie cykliczne

(połączenie metody PCR i

sekwencjonowania) pozwala

na liniową amplifikację sygnału