Co to jest?

Ustalenie kolejności nukleotydów w DNA.

Nauką zajmującą się sekwencjonowaniem i analizą całych genomów jest dział biologii molekularnej genomika. Gromadzeniem i analizowaniem danych biologicznych z wykorzystaniem metod komputerowych zajmuje się bioinformatyka.

Projekt poznania ludzkiego genomu (en. Human Genome Project, HUGO Project)

W 1988 roku zapada decyzja o rozpoczęciu międzynarodowego Programu Poznania Ludzkiego Genomu. Na początku lat 90-tych projekt rusza.

Głównymi założeniami projektu jest określenie sekwencji ok 3 miliardów par zasad budujących DNA człowieka, poznanie wszystkich chromosomów i następnie udostępnienie tych danych szerokiemu środowisku naukowemu.

Do przyspieszonego postępu prac przyczynia się bezpośrednio prywatna firma Celera Genomics, której założycielem był Craig Venter. Firma przystępuje do rywalizacji w 1998 r.
Chce jako pierwsza zsekwencjonować ludzki genom i tym samym mieć możliwość opatentowania go.
Koncern ten wprowadził nową, szybszą technikę sekwencjonowania zwaną shotgun.

W wyniku prac naukowców rządowych i działań konkurencji z Celera Genomics powstawały artykuły w Nature i Science. (2001) Okazało się, że naukowcy poznali 90% genomu.

14 kwietnia 2003 na konferencji zorganizowanej w Bethesda w USA, z okazji 50. rocznicy poznania struktury DNA, międzynarodowe konsorcjum naukowców ogłosiło oficjalne zakończenie prac nad poznaniem genomu ludzkiego.
Zsekwencjonowano 99% całego genomu ludzkiego z prawie stuprocentową trafnością ( 99,99% ).

Kolejnym krokiem po 2003 roku było wypełnienie luk, związanych z niedokładnościami wcześniejszego mapowania.

Metody sekwencjonowania DNA:

- metoda „shotgun”

Rozbicie materiału genetycznego na przypadkowe fragmenty

Ustalenie kolejności nukleotydów za pomocą sekwentatorów i wprowadzenie uzyskanych w ten sposób informacji do baz danych.

Superkomputery pracujące na uzyskanym w ten sposób zbiorze, porównują sekwencje i odnajdują zachodzące na siebie fragmenty. Następuje złożenie całości.

- metoda chemicznej degradacji DNA (metoda Maxama-Gilberta)
Polega na wyznakowaniu cząsteczek DNA na końcu 5' radioaktywnym izotopem fosforu ³²P , działaniu na DNA specyficznymi związkami chemicznymi w czterech odrębnych reakcjach,
które rozszczepiają(cleavage - rozpad) łańcuch w miejscu którejś zasady azotowej. (G-miejsce cięcia).

Fragmenty z czterech niezależnych reakcji rozdziela się elektroforetycznie(Wykorzystuje zjawisko przemieszczania się obdarzonych ładunkiem cząstek w polu elektrycznym.).

Po czym poddaje autoradiografii (metoda obrazowania rozkładu substancji promieniotwórczych) uwidaczniającej łańcuchy DNA wyznakowane izotopowo.

Na końcu „składa się” sekwencje w całość.
Metoda Maxama-Gilberta obecnie jest rzadko stosowana.

Walter Gilbert wraz z Frederickiem Sangerem otrzymali za to osiągnięcie nagrodę Nobla w dziedzinie chemii.

- metoda terminacji łańcucha (metoda dideoksy, metoda Sangera) – unowocześniona modyfikacja

Są to nukleotydy, w których pięciowęglowy cukier nie ma grupy hydroksylowej ani przy węglu 2', ani przy węglu 3 '. Jak wiadomo, właśnie grupa hydroksylowa 3' jest zaangażowana w tworzenie wiązań fosfodiestrowych występujących w łańcuchu DNA. Ze względu na brak dwóch grup hydroksylowych (2' i 3') zatrzymują one reakcję syntezy nowej nici DNA. Z tego powodu nazywa się je terminatorami.

Fragment DNA, który ma być zsekwencjonowany, jest rozdzielany najpierw na dwie pojedyncze nici. Następnie do roztworu dodaje się krótki, kilkunastonukleotydowy odcinek DNA, który pełni funkcję startera. Ponieważ jest on komplementarny do jednej z nich przyłącza się do niej, tworząc z odpowiednimi nukleotydami matrycy wiązania wodorowe .

Do mieszaniny reakcyjnej dodaje się następnie polimerazę DNA oraz substraty, z których będzie ona syntetyzowała nową nić. Substratami tymi są, jak wiadomo deoksynukleotydy: dATP, dCTP, dGTP, dTTP.

Dodatkowo do mieszaniny dodajemy dideoksynukleotydy, które po włączeniu do łańcucha, zatrzymują reakcję, uniemożliwiając polimerazie kontynuowanie syntezy DNA.

Podczas sekwencjonowania w mieszaninie reakcyjnej są obecne wszystkie cztery terminatory. Każdy z nich ma przyłączoną dodatkową grupę chemiczną, która pod wpływem promieniowania ultrafioletowego (UV) emituje światło widzialne o charakterystycznej długości, czyli, mówiąc w uproszczeniu, każdy terminator ma swój własny kolor. Jeżeli taki terminator zostanie wprowadzony do syntetyzowanej nici, to cała cząsteczka DNA będzie naznaczona tylko jednym kolorem.
Należy jednak zaznaczyć, że stężenie terminatorów w reakcji sekwencjonowania jest wielokrotnie niższe od stężenia prawidłowych nukleotydów użytych do reakcji. Oznacza to, ze polimeraza DNA najczęściej wprowadza do nowo syntetyzowanego łańcucha prawidłowy nukleotyd, ponieważ

w mieszaninie reakcyjnej jest takich nukleotydów znacznie więcej niż cząsteczek odpowiedniego terminatora. Z tego powodu synteza DNA tylko nielicznych cząsteczek kończy się wprowadzeniem terminatora; pozostałe cząsteczki są nadal wydłużane i ich synteza może być zatrzymana w innym miejscu.

Pod koniec reakcji sekwencjonowania powstaje mieszanina cząsteczek DNA o różnej długości.

Rozdział uzyskanych w reakcji sekwencjonowania fragmentów DNA odbywa się w sekwenatorze.

Najważniejszą częścią sekwenatora są bardzo cienki rurki - kapilary (elektroforeza kapilarna)- wypełnione żelowatą substancją. Fragmenty DNA uzyskane podczas sekwencjonowania są nanoszone automatycznie na górną powierzchnię żelu wypełniającego rurkę. Pod wpływem przyłożonego napięcia wędrują w żelu od góry ku dołowi kapilary. Podczas tej wędrówki rozdzielają się ze względu na swoją długość: krótkie fragmenty migrują szybciej, a dłuższe wolniej. Na dolny koniec rurki jest skierowane światło laserowe. Jeżeli z rur wypływa fragment zakończony odpowiednim terminatorem, to specjalny detektor notuje kolor światła emitowanego przez ten fragment. Ponieważ z rur kolejno wypływają coraz to dłuższe fragmenty, detektor odnotowuje kolejność terminatorów, jakimi są one zakończone. Współpracujący z sekwenatorem komputer rozszyfrowuje sekwencję kolorów i tłumaczy ją, na sekwencję zasad występujących w cząsteczce DNA.

Wersja podstawowa

Brak „kolorów”; 4 reakcje, elektroforeza żelowa produktów każdej reakcji osobno.

W trakcie tego procesu fragmenty DNA rozdzielają się na grupy o tej samej długości.

Znakuje się je izotopowo (autoradiografia), dzięki czemu uwidaczniają się w postaci prążków na żelu. Odczytuje się sekwencje DNA.

(Z rozkładu prążków można odczytać pozycję nukleotydu, na którym zatrzymała się synteza.)

band-pasmo w widmie, prążek label - znakowane izotopowo

Cel sekwencjonowania

- dostarcza informacji o strukturze i funkcji genów,

- umożliwia zrozumienie molekularnych mechanizmów funkcjonowania badanych organizmów (mysz, szczur, muszka owoców, dwa rodzaje nicieni, komar „ malaryczny”)
- badanie ewolucji organizmów

- pozwala badać pochodzenie człowieka

- umożliwia szukanie mutacji