Pierwszy problem rozwiązano za pomocą znajomo-
Wykład 4 09.03
ści genomu faga   geny są pogrupowane i szczęśliwie
pEMBL8
fragment
okazało się, że w środkowej części znajdują się geny,
DNA M13
które są zbędne dla faga o funkcji wektora
3997 bp
R
amp
lacZ
pEMBL8: wektor hybrydowy (fagemid)
Posiada zalety M13, ale jednocześnie pozwala
" możliwość usunięcia do 15 kb, a zatem insert
na wklonowanie dłuższych fragmentów.
może mieć do 18 kb
" wektor jest hybrydą faga i plazmidu (w tym przy-
" zostaje wycięty fragment odpowiedzialny za
padku faga M13 i typowego plazmidu, np z serii PUC)
możliwość istnienia faga w formie litycznej
" posiada oporność na ampicylinę (amp), miejsce
ori, lacZ (jak w każdym plazmidzie)
Drugi problem rozwiązano posługując się selekcją
" fragment DNA M13  zawiera wszystkie sekwencje
naturalną. Infekowano E. Coli szczepem dzikim faga
potrzebne do tego, aby mogła powstać pojedyncza nić
. Zauważono, że po pewnym czasie liczba miejsc re-
Kiedy potrzebujemy otrzymać DNA w postaci poje-
strykcyjnych się zmniejsza  fag się uodparnia, nastę-
dynczej nici (w formie kolistej), wtedy komórki, które
pują naturalne mutacje. Następnie infekowano komórki
posiadają dany plazmid muszą być zakażone fagiem
fagiem  o zmniejszonej ilości miejsc restrykcyjnych
pomocniczym. Fag pomocniczy dostarcza wszystkich
aż do uzyskania faga , którego DNA nie ulega prze-
białek potrzebnych do tego, aby na matrycy fagemi-
cięciu.
dowej mogła rozpocząć sę synteza pojedynczej nici
Rodzaje wektorów faga :
DNA. Fag pomocniczy jest tak skonstruowany, że jego
" wektory inserycjne
DNA nie podlega replikacji i mapowaniu w białkach
" wektory zastępcze
osłonkowych, które również dostarcza.
Konwersja pEMBL8 do jednoniciowego DNA
Wektor insercyjny
" krótszy fragment
M13
" jedno miejsce restrykcyjne !
region
Normalne DNA wektor insercyjny
(49 kb) (35 40 kb)
Dwuniciowe
pEMBL8
gt10
" zostało wygenerowane miejsce EcoR1 do klono-
wania
" dokładnie znana długość wektora (40 kb)
" selekcja rekombinantów polega na zmianie feno-
typu łysinek (miejsce klonowania jest zlokalizowane
w obrębie genu kodującego  represor)
gt10
Eco RI
40 kb
Klonowanie wektorów bazujących na fagu 
Delecja cl
Przed skonstuowaniem tych wektorów trzeba było roz-
wiązać dwa problemy:
" wielkość  istnieją pewne granice wielkości czą-
2APII
steczek, jakie mogą być pakowane we wnętrzu główki
" podobna długość wektora
faga (3 kb  52 kb)
" selekcja polega na selkcji biało-niebieskiej (lacZ )
" miejsca restrykcyjne  enzymy restrykcyjne tną
ZAPII
cząsteczkę w wielu miejscach i staje się ona bezuży-
P
teczna, chociaż enzymy restrykcyjne są uznawane za
41 kb
unikatowe.
lacZ Delecja
Wczesna regulacja
Synteza DNA
Liza gospodarza
Wektory zastępcze Cosmid
Typowy cosmid
Bam HI
" dwa miejsca restrykcyjne !
R
amp
" w miejsca Stuffer a wchodzi nowe DNA
pJB8
Restrykcja, ligacja 5.4 kb cos
DNA
ori
Nowe DNA
fragment
" plazmid, który zawiera sekwencję faga  i miejsce cos
Eco RI, Bam HI, Sal I
lub kombinacja " względnie duży
" pozwala na klonowanie fragmentów ponad 40 kb
Nowe DNA, do 23 kb
RBS SBR
R = Eco RI B = Bam HI S = S al I
Bam HI
R
amp
Dlaczego nie można skorzystać z pierwszej metody?
Bam HI Bam HI
Restrykcja
R
Kolisty cos amp
Po usunięciu miejsc Stuffer a i samoligacji otrzy-
Bam HI
pJB8
cos
mamy fragmenty krótsze niż 3 kb. Dlatego w miejsce
Stuffera musi wejść nowe DNA.
Liniowe pJB8
Bam HI Bam HI
EMBL4
Ligacja
" może przyjmować bardzo duże nowe fragmenty
Nowe DNA
DNA (23 kb)
Bam HI Bam HI Bam HI
" selekcja przez wielkość lub fenotyp SPI
R
cos amp Nowe cos Katenany
DNA
Po co jest potrzebny Stuffer?
Paczka in vitro
Do otrzymania wektora w dostatecznej ilości do
klonowania (bez Stuffera nie mógłby się namnażać, bo
Rekombinowane
Infekcja E. coli
DNA cosmidu
byłby za krótki)
W jaki sposób klonujemy przy użyciu wektorów faga 
" Klonowanie przy użyciu kolistego  DNA (rzadko)
" otrzymujemy duże fragmenty DNA zmodyfiko-
wanego faga , ale z niego jest jedynie fragment cos oraz
Eco RI
białka osłonkowe, cała reszta jest rekombinowana
Eco RI
Eco RI
Nowe DNA
" co jest jeszcze ważne: komórka nie ulega lizie!
Eco RI
Podsumowanie: najkrótsze są wektory M13, potem
Eco RI, ligacja
wektory plazmidowe (8 kb), wektory faga  (20 kb),
cos
cos
wektory cosmidowe (40 kb)
Transfekcja
do E. coli
Można oszacować ilość klonów, aby gen wystąpił
Rekombinant
 forma cykliczna
z dobrej strony z prawdopodobieństwem.
ln(1 p)
" Klonowanie przy użyciu liniowego DNA 
N =
a
ln 1
( )
b
cos
cos N  liczba klonów
Ligate cos
Eco RI
cos P  prawdopodobieństwo wystąpienia każdego genu
cos Katenany cos
Eco RI
a  średnia wielkość fragmentu
b  całkowita wielkość genomu
Eco RI Eco RI W jaki sposób znalez
ć konkretny klon w bibliotece
genów?
Nowe DNA
mieszanka reakcji
Potrzeba znalezienia wektorów, które przenoszą
pakowania in vitro
większe fragmenty (o tym będzie mowa póz
niej)
Rekombinant
Problem selekcji: jeśli chcemy otrzymać bibliotekę,
to DNA przed otrzymaniem biblioteki zwykle ulega
Infekowanie E. coli
fragmentacji. Mamy w bibliotece kolekcję fragmentów
DNA w poszczególnych klonach. W jednym z klonów
długość jest określona przez miejsca cos (zatem okre-
jest poszukiwana informacja.
ślają one upakowanie).
Różne sposoby fragmentacji DNA
Selekcja bezpośrednia
" mechaniczne (np. ultradz
więkami powodujemy
Jest prowadzona już na etapie hodowli komórek, przeży-
pękanie DNA)
wają tylko te, które mają być wyselekcjonowane.
" trawienie DNA enzymem restrykcyjnym (wy-
" wygodna i skuteczna
czerujące trawienie) polega na dodaniu takiej ilości
enzymu, że wszystkie miejsca ulegają restrykcji). Cza-
sem mogą powstać zbyt krótkie fragmenty nie ligujące
rekombinant
z wektorem  częśći DNA trawione.
" lepsza metoda: Trawienie niewyczerpujące.
Otrzymujemy fragmenty których DNA się powtarzają,
ale sekwencje mają być różne.
tetR
Następnie przeprowadza się elektroforezę, wybiera
Transformacja
LEU2
E. coli
framenty o konkretnych dłgościach i liguje z wekto-
R
amp
rem. Czy nie odrzucimy zatem części istotnego mate-
Samozligowany
Klony E. coli
riału? Otóż nie!
wektor
Jak zredukować ilość materiału genetycznego, która
jest nam zbędna?
do tego służy biblioteka cDNA  odpowiada in-
formacji jaka ulega ekspresji w komórce (nie zawiera
całej informacji genetycznej).
- brak leucyny
Geny ciche
Komórka typu A
Selekcja pośrednia
Musimy zidentyfikować klon w bibliotece genów.
" Przykład: Plazmid R6-5
Posiada oporność na działanie kalamicyny.
Geny ciche
Doświadczenie: plazmid trawiony enzymem re-
strykcyjnym, który nie trawi interesującego nas genu
oporności na kanamicynę (EcoRI). Ligujemy strawione
fragmenty z wektorem pBR322 i wysiewamy na pod-
łoże selekcyjne z kanamicyną. Pozostają tylko klony
Komórka typu B
posiadające gen oporności na kanR.
" Szczep auksotroficzny w odniesieniu do Trp
(wymaga obecności Trp w pożywce)
Doświadczenie: Dysponujemy szczepem E. Coli,
który jest zmutowany pod {...}
Różne geny są ekspresjonowane w różnych typach
{...} gen za to odpowiedzialny?
komórek. Część genów nie ulega ekspresji konstytu-
Konstruujemy bibliotekę szczepu dzikiego E. Coli.
tywnej tylko od czasu do czasu.
Trawimy DNA bakterii i otrzymujemy fragmenty
Ogólnie bibiloteka cDNA zawiera informacje o trans-
z oraz bez genu, zwane TrpA. Ligujemy do wektora
kryptach. Każdy gen posiada wiele transkryptów, a za-
i transformujemy komórki. Następnie wysiewamy je na
tem biblioteka cDNA jest dużo bardziej złożona.
podłoże bez Trp. Przeżyją tylko rekombinanty TrpA+.
Zakłada się często, że transkrypty posiadają {...}
Używana również w komórkach drożdżowych.
Do transkryptu jest hybrydyzowana sonda, starter
który jest poliogonem T, komplementarny do poliogo-
Praktyczne aspekty tworzenia bibliotek
na A. Cząsteczki RNA są niestabilne, więc biblioteka
transkryptów jest przetwarzana na DNA. Po przyłącze-
Rozróżniamy biblioteki genomowe oraz biblioteki cDNA.
niu startera z ogonem poli(T) używana jest odwrotna
" Biblioteka genomowa zawiera całą informację
transkryptaza (korzystając z matrycy RNA syntezuje
genetyczną właściwą danemu organizmowi.
DNA). Zsyntezowana nić DNA nosi nazwę pierwszej
" Jak powstaje? DNA poddawany jest fragmentacji
i fragmenty o określonej długości są wybierane i ligo- nici cDNA (komplementarny DNA). Ta cząsteczka
również jest nietrwała. Potrzebujemy nić dsDNA. Mu-
wane z wektorem.
simy usunąć nić RNA. Używamy do tego RNazyH1 Do jakich metod może być użyty tyen izotop fosforu
(RNaza, która hydrolizuje RNA, brak większej specy- w pozycji d2?
ficzności). RNA ulega fragmentacji. Pozostają tylko
do znakowania w translacji NIC (polimeraza
krótkie fragmenty połączone oddziaływaniami Watso-
DNA I, która wykorzystuje aktywność 5 3 nukle-
na Cricka. Następnie używamy polimerazy DNA typu
azową). Musimy dysponować cząsteczką DNA,która
I (może korzystać ze starterów, które są RNA i może
ma szereg pęknięć.
syntezować nić komplementarną), która wykorzystu-
Można również zaznakować końce cząsteczki DNA
je pozostałe fragmenty RNA. Polimeraza ta posiada
(tak zwane wypełnianie końców), używając fragmen-
trzy aktywności: (1) polimerazową, (2) korekcyjną,
tów Klenowa.
(3) nukleazową. Otrzymujemy ostatecznie cząsteczkę
Znakowanie przy użyciu starterów o przypadko-
dsDNA. Następnie już ligacja z wektorem i transfor-
wych sekwencjach. Jako substrat wykorzystujemy
macja komórek. Jest to biblioteka, która zawiera tylko
cząsteczkę dsDNA, która jest następnie denaturowa-
sekwencje kodujące białek, które pojawiają się w da-
na. W roztworze są obecne również krótkie oligonu-
nym momencie w komórce.
kleotydy (heksomeryczne), w różnym nadmiarze. Przy
Bardzo istotny jest dobór komórek, które powinny
obniżaniu temperatury, oligonkuleotydy będą hybrydy-
być wyspecjalizowane w syntezie białek (konkretnych).
zowały przypadkowo i tylko te, które są komplemen-
Identyfikacja klonu (metody pośrednie)
tarne. Pełnią funkcję starterów i są używane przez frag-
" Hybrydyzacja kwasów nukleinowych (oddziały-
ment Klenowa. Dostaniemy zatem kolekcję cząsteczek
wania Watsona-Cricka)
komplementarnych do danej cząsteczki DNA. Będą
one znakowane radioaktywnie (otrzymamy sondy, któ-
Niestabilna hybryda
re posłużą do przeszukania biblioteki).
Stabilna hybryda
A zatem musimy dysponować sondą, która jest do-
statecznie stabilna.
Hybryda DNA-RNA
" Hybryda DNA-RNA (rybosonda)
DNA
RNA
Otrzymujemy replikę gotową do właściwego proce-
su hybrydyzacji. Eksperyment hybrydyzacji polega na
tym, że w roztworze zamieszczamy ten filtr mikrocelu-
Membrana
nitrocelulozowa/nylonowa
lozowy z immobilizowanym DNA, a w roztworze znaj-
duje się sonda znakowana radioaktywnie. Sonda wiąże
Bakterie przyczepione
się z DNA: wiązania niespecyficzne są bardzo słabe,
do membrany
zaś wiązania specyficzne bardzo mocne. Nadmiar son-
dy jest odmywany (sonda wiązana niespecyficznie jest
DNA
Bakterie
Zasada
usuwana). Replika jest suszona, następnie przykładany
+ proteaza
jest film rentgenowski, który pod wpływem promie-
niowania jonizującego ulega zaczernieniu (zaczernie-
Niesparowane zasady
nie ukazuje sondy związane z DNA. Porówanie płytki
z koloniami {...}
Substratem do znakowania DNA jest dNTP. Taki
Sonda ze znakowanym DNA
znacznik zawiera izotop fosforu (P32), który znajduje
Film rentgenowski
się w pozycji ą. (Do znakowania zaś końców 5 stoso-
*
*** Przemycie ***
** * * *
wany jest ATP ze znakowaniem w pozycji ł i ta reszta
jest przenoszona przez kinazę T4 na 5 koniec).