Cel: znalezienie klonu który zawiera transkrypt
Wykład 5 16.03
w dużych ilościach
Peroksydaza nie jest substratem, to białko. Zatem jak
" Wybrano przypadkowy klon, wyizolowano DNA.
połączyć to białko z DNA?  Poprzez reakcję siecio-
" Po wycięciu insertu otrzymano sondę, którą wy-
wania aldehydem glutarowym. W ten sposób powstaje
korzystano do przeszukiwania biblioteki klonów.
sonda, zaznakowana peroksydazą, która specyficznie
Wynik: Sonda została związana specyficznie tylko w
wiąże się z DNA klonu.
jednym miejscu, tam skÄ…d pobrano DNA. Trafiono na
Jak przeprowadzić detekcję? Jak wykryć te miejsca, w
klon, który nie jest nadreprezentowany. Ścieżka ślepa.
których peroksydaza jest zlokalizowana?
Próba B: Wybrano kolejny przypadkowy klon. Od-
Wykorzystuje siÄ™ zjawisko chemiluminescencji.
tworzono procesy.
Polega ona na tym, iż podczas reakcji chemicznej emi-
Wynik: Po hybrydyzacji pojawia się wiele klonów.
towana jest energia w postaci świetlnej. Substratem dla
Oznacza to, że trafiono na klon, który jest obecny w
peroksydazy jest luminol.
wielu klonach innych. Mamy do czynienia z nadrepre-
Przykłady technik hybrydyzacyjnych do poszuki-
zentowanym DNA.
wania klonów
" znalezienie klonu, gdy nie dysponujemy informa-
cją DNA ani RNA, ale posiadamy produkt białkowy.
Dla danego produktu białkowego można odtworzyć
Peroksydaza chrzanowa
Jednoniciowa
DNA, znając układ aminokwasów
+ glutaraldehyd
sonda DNA
" najlepiej wybrać taką sekwencję aminokwasową,
HP
której będzie odpowiadało najmniej kodonów. (np. Met
HP
 1 kodon, Trp  1 kodon)
HP
Sonda musi być jak najbardziej zdegenerowana, tak
HP
by zawierała jak najmniej różnych sekwencji.
Hybrydyzacja
HP HP
Sonda jest znakowana przy pomocy kinazy P4. Na-
stępuje przeszukanie biblioteki  Ale czy jest to wiąza-
nie specyficzne?
Dodanie luminolu
Chemiluminescencja
HP HP
Hybrydyzacja
kolonii
" Poszukiwanie cDNA klonu, który reprezentuje
transkrypt, występujący w komórkach w dużym nad-
miarze. Transkrypt występuje w specjalnym klonie,
który jest nadreprezetowany.
Np. komórki produkujące insulinę lub gliadyna
...
Biblioteka klonów
Otrzymujemy trzy klasy (dwa sygnały słabe, trzeci
mocny). Trzeci może być specyficzny. Zatem wrócono
A
do sekwencji białka; odnaleziono inną, również zde-
B
generowaną. Powtórzono doświadczenie z inną sondą.
Jeśli wynik znów pokaże ten sam klon, duża szansa, że
klon zawiera szukanÄ… przez nas sekwencjÄ™.
Hybrydyzacja
Sonda B
Sonda A
kolonii " W różnych gatunkach wykorzystywane są różne
kodony. IstniejÄ… tablice podajÄ…ce informacje na ten te-
mat. Dzeki temu można lepiej przewidywać sekwencje
nukleotydów.
" Hybrydyzacja heterologiczna pomędzy gatun-
kami polega na tym, iż tą samą sondąprzeszukujemy
biblioteki klonów innych gatunków, by uzyskać infor-
macje, jak podobne są poszczególne geny względem
siebie.
Sonda A Sonda B
" Hybrydyzacja heterologiczna w obrębie gatun- Immunoscreening
ku ma na celu zbadanie podobieństw w obrębie rodzin
Przeszukiwanie za pomocą przeciwciał:
tych samych białek.
Immunoscreening Kolonie
Szukamy ostatniej sytuacji...
Mamy sondę, która tylko częsciowo hybrydyzuje z
Membrana
sekwencją docelową. Podobieństwo białek należących
Liza komórek
do rodziny nigdy nie jest 100%.
(chloroform)
Te same aminokwasy  DNA może się różnić. Do-
świadczenia te doprowadziły do wielu odkryć rodzin,
np. kinaz, białek homeotycznych.
125
I
" przypadek w którym nie dysponujemy informa-
cją na temat sekwencji DNA, czy białek. W tym celu
musimy dysponować przeciwciałami do określonych
białek oraz biblioteką ekspresyjną, tzn. taką, w której
klony podlegajÄ… ekspresji.
W jaki sposób otrzymujemy bibliotekę ekspresyjną?
Potrzebujemy wektory, które posiadają promotor
Białko A  zaznakowane izotopem jodu, pochodze-
aktywny w komórce bakteryjnej. Pod jego kontrolą
nie bakteryjne, bardzo silnie wiąże immunoglobuliny.
znajdują się inserty. Otrzymuje się cDNA. Następnie
biblioteka ta jest ligowana z wektorem ekspresyjnym.
Charakterystyka fagemidu pBlueScript SK (+)
Oczywiście mamy przeróżne fragmenty DNA, ale nie-
które cDNA pod kontrolą promotora bakteryjnego ule-
Fagemid  wektor, który zawiera fragmenty
gają ekspresji takiej, że dają produkt polipeptydowy.
i faga i plazmidu.
IstotÄ… znalezienia sekwencji kodujÄ…cej jest odnalezie-
(+/ )
Fagemidy pBluescript II SK
nie klonu, w którym ta ekspresja zachodzi
f1 (-) ori
f1 (+) ori
AAAAA
TTTTT
Dwuniciowe DNA
ampicylina
lacZ'
ends, ligate
Kpn I
Ligacja do wektora
MCS
pBluescript II SK (+/-)
Sac I
cDNA
3.0 kb
P lac
Transformacja
klony cDNA
pUC ori
ampicilin  cecha nadająca oporność na ampicilinę
ori  miejsce z wektora pUC
P lac  promotor, który jest pochodną promotora
klon gliadynowy
z operonu laktozowego (promotor aktywny w komórce
bakteryjnej)
lac Z  zatem może służyć do selekcji biało niebieskiej
Jedyna różnica między biblioteką eksresyjną, a zwy-
MCS  sekwencja wielokrotnego klonowania (za-
kłą jest taka, że wektor zawiera promotor.
wiera również promotory polimerazy T2 i T3).
SacI, Kpn1  miejsca restrykcyjne Możliwe jest hybyrydyzowanie ze sobą cząsteczek
f1(+) ori  fragment z faga f1 (działanie: możemy pierwonych matrycy, ale preferowane jest hybrydyzo-
cały czas używać fagemidu jako zwykłego wektora, wanie ze starterem. Startery są zawsze w nadmiarze, są
a po zakażeniu komórki będzie wykorzystywana se- to krótsze fragmenty, ddlatego są one preferowane.
kwencja f1(+) ori i od tej sekwencji zachodzić będzie 3 cykl: Hybrydyzująze sobą produkty cyklu drugie-
replikacja, która zakończy kolistą cząsteczkę DNA jed- go, które mają już określoną długość (w ten sposób
ną z nici wektora). określana jest ostateczna długość produktów PCR).
Wersja (-) przy odwróconej sekwencji f1(+) ori. Zwykle produkty PCR analizujemy przy pomocy
Funkcje: elektroforezy żelowej.
" klonowanie fragmentów DNA
Co wpływa na powodzenie eksperymentu?
" separacja molekularna
Przede wszystkim odpowiednie zaprojektowanie
" zwielokrotnienie ilości
starterów.
" otrzymanie w postaci pojedynczej nici
Startery są projektowane w oparciu o znaną już se-
" wprowadzenie nadekspresji białka
kwencę, okalają odcinek DNA, który ma być powie-
" selekcja biało-niebieska
lany.
" otrzymanie transkryptów in-vitro
Starter przedni  sekwencja nici górnej.
Starter tylni  sekwencja nici dolnej.
Reakcja pCR
Starter musi być specyficzny! Co to znaczy?
Reakcja syntezy DNA. Cechą szczególną jest to, że
W całym genomie starter powinien parować tylko z
syteza (w bardzo szczególnych warunkach) jest powta-
jednÄ… komplementarÄ… sekwencjÄ…! Taki wynik jest uzy-
rzana wielokrotnie. Następuje amplifikacja sekwencji
skiwany za pomocÄ…:
DNA.
" odpowiedniej długości startera (szacuje się, że
Przed wynalezieniem metody PCR jedynym sposo-
dla startera o długości 17 pz można znalez
ć sekwencję,
bem otrzymania DNA było klonowanie (wbudowanie
która się powtórzy tylko raz)
insertu do wektora i podział komórki).
" konkretne temperatury
Do reakcji PCR potrzebujemy:
" startery
Typowy profil temperaturowy
" matrycÄ™ DNA
" polimerazÄ™
100
Denaturacja
(1 min)
Opis reakcji
90
" Matryca jest denaturowana. Otrzymujemy dwie
nici, do których są hydrolizowane startery. Starte-
80
ry określają produkt, jaki będzie po reakcji (Długość
DNA)
(2 min)
W PCR matrycą jest pojedyncza cząsteczka (nić) 70
DNA dostarczana przez denaturacjÄ™ czÄ…steczki DNA
(w komórce nić dostarczona przy udziale białek, m.in.
60
helikaz).
Próbka jest następnie ochłądzana (temperatura
50
znacznie niższa niż przy denaturacji). Wartość tempe-
ratury jest określana przez charakter starterów, które
Å‚Ä…czÄ… siÄ™ z obiema niciami.
40
0 1 2 3 4 5 6 7
" Synteza prowadzona przez termostabilnÄ… polime-
Czas (minuty)
razÄ™ DNA na obu niciach. Temperatura powyżej 70°C
(okoÅ‚o 74°C)
Należy zwrócić uwagę na temperaturę wiązania
Krytycznym etapem dla osiągnięcia specyficzności
starterów
jest etap hybrydyzacji.
3 sytuacje hipotetyczne
" Ekstremalne wartości pH wpływają na denatura-
SkÄ…d bierze sÄ™ amplifikacja?
cjÄ™ DNA
Z powtarzalności cylki (głównie od cyklu 3) mamy
" Wysoka temperatura powoduje rozerwanie wiÄ…-
już matrycę o zdefiniowanej długości.
zań wodorowych i dysocjację DNA. Zatem przy zbyt
1 cykl: Produkty, które są syntezowane mają dłu-
wysokiej temperaturze startery nie hybrydyzujÄ….
gość określoną przez czas syntezy.
" Temperatura jest za niska  starter hybrydyzuje
2 cykl: Mamy nić matrycową i produkt 1, znów na-
tylko prezz niektóre reszty. Są to słabe oddziaływania.
stępuje hybrydyzacja. Powstaą produkty, które maą już
Zależy nam, aby wszystkie reszty hybrydyzowały.
określoną długość.
Temperatura °C
Temperatura topnienia DNA  temperatura, w któ-
rej połowa cząsteczek DNA jest rozdysocjowana (po-
Å‚owowa czÄ…steczek zwiÄ…zana lub nie)
Jak to oszacować?
T = (4 × [G + C]) + (2 × [A + T])°C
m
prawdziwe dla względnie krótkich długości DNA
Temperatura hybrydyzuje  o 1-2°C niższa od tem-
peratury topnienia konieczność wykorzystania poli-
meraz termostabilnych.
Proces należy powtarzać około trzydzieści razy
(teoretycznie powinno się uzyskać 2n-2 cząsteczek).
Produktu może być trochę mniej, ponieważ polime-
raz traci swoją aktywność podczas wzrostu tempera-
tury oraz substraty ulegają rozkładowi częściowemu.
mimo to ilość produktu DNA jest wystarczająca do
dalszych badań.